基于三羧基乙基磷的羊毛角蛋白提取及其性能

王聞?dòng)?，馬玉單 ，陳立娟 ，何雅僖 ，金 欣 ，肖長發(fā)

（1.天津工業(yè)大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院，天津 300387；2.天津工業(yè)大學(xué)省部共建分離膜與膜過程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300387）

角蛋白是羊毛的主要成分，羊毛中的角蛋白是可再生蛋白的重要來源.再生角蛋白有許多優(yōu)質(zhì)的特性，可應(yīng)用于不同的領(lǐng)域.Akira Tachibana[1]將角蛋白海綿結(jié)構(gòu)浸泡在含鈣和磷酸鹽離子的緩沖液中培養(yǎng)L-929細(xì)胞，一周后發(fā)現(xiàn)細(xì)胞無變異，可用于生物醫(yī)用材料；王江波等[2]和Kawahara[3]均將角蛋白作為功能整理劑，對滌綸織物或棉織物進(jìn)行親水整理，處理后的織物手感柔軟，具有很好的懸垂性能及吸濕功能；Aluigi[4]利用角蛋白吸附重金屬離子、甲醛及其他揮發(fā)性有機(jī)化合物.

羊毛角蛋白中含有離子鍵、氫鍵、疏水鍵、二硫鍵等，其中二硫鍵是角蛋白折疊和結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的基礎(chǔ)[5-6]，因此溶解羊毛提取角蛋白的關(guān)鍵是破壞羊毛中的二硫鍵.常見的溶解羊毛提取角蛋白的方法有氧化法[7]、離子溶液法[8]及還原 A、B、C[9]等.最近，有一種新的還原劑三羧基乙基磷（TCEP）被用于羊毛角蛋白的溶解[10]，與傳統(tǒng)還原劑相比，TCEP對二硫鍵有極強(qiáng)的選擇還原性[11]，能得到分子質(zhì)量集中在9.5～22.0 KD的不溶于水的角蛋白.而傳統(tǒng)的羊毛溶解工藝得到的角蛋白均是水溶性蛋白，限制了角蛋白在重金屬吸附、超吸水等方面的應(yīng)用.

本文分別采用TCEP和NaHSO3提取羊毛角蛋白，對2種方法所提取角蛋白的相對分子質(zhì)量、結(jié)構(gòu)及熱穩(wěn)定性進(jìn)行分析，并制備角蛋白（TCEP法提?。?聚乙烯醇復(fù)合膜，考察復(fù)合膜的吸水性.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料與儀器

所用原材料包括:羊毛，型號(hào)為DH1126，常州毛條廠產(chǎn)品；TCEP溶液，質(zhì)量分?jǐn)?shù)35%，聯(lián)寬精細(xì)化學(xué)品有限公司產(chǎn)品；十二磺基磺酸鈉（SDS），質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥59%，天津市精細(xì)化工研究所產(chǎn)品；亞硫酸氫鈉（NaHSO3），分析純，天津市精細(xì)化工研究所產(chǎn)品；尿素，分析純，天津市精細(xì)化工研究所產(chǎn)品；3500D型透析袋，Solarbio公司產(chǎn)品；乙酸，分析純，天津市化學(xué)試劑三廠產(chǎn)品；聚乙烯醇（PVA），聚合度為 1750±50，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所產(chǎn)品，二甲基亞砜（DMSO），分析純，天津精細(xì)化工研究所.

所用儀器包括:Nicolet iS10型紅外光譜儀，美國Thermo Nicolet公司產(chǎn)品；DYY－16D型凝膠電泳儀，北京六一儀器廠產(chǎn)品；TG209F3型熱重分析儀，德國Netzsch公司產(chǎn)品；BX51型偏光顯微鏡，日本Olympus公司產(chǎn)品.

1.2 羊毛角蛋白提取

（1）TCEP法:將羊毛剪碎至1 cm左右，取一定質(zhì)量的碎羊毛溶解于裝有TCEP溶液的燒杯中，浴比為1∶15；再向其中充入氮?dú)?，?0℃恒溫水浴中加熱12 h；將反應(yīng)后的羊毛溶液抽濾，液體放入透析袋中，然后置于去離子水中透析，每隔3 h換一次水，36 h后離心、冷凍干燥得到角蛋白.

（2）NaHSO3法:稱取0.05 mol/L的SDS和5 mol/L的NaHSO3倒入7 mol/L的尿素水溶液中，混合均勻；將羊毛剪碎至1 cm左右，并置于混合液燒杯中，浴比為1∶20；再向其中充入氮?dú)?，放?0℃恒溫水浴中加熱5 h；將反應(yīng)后的羊毛溶液抽濾，液體放入透析袋中，然后置于去離子水中透析，每隔3 h換一次水，36 h后用乙酸滴定至白色不再增加，然后離心、冷凍干燥得到角蛋白.

1.3 角蛋白/PVA復(fù)合膜的制備

稱取一定量TCEP法提取的非水溶性蛋白，與質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8%的PVA水溶液共混，角蛋白與PVA質(zhì)量比為1∶1.60℃恒溫加熱2 h，靜置一段時(shí)間后迅速流延制膜；在60℃烘箱中干燥5 h后揭膜.

1.4 性能表征與測試

（1）傅里葉變換紅外光譜分析（FTIR）:采用Nicolet iS10型紅外光譜儀在波數(shù)為650～4000 cm－1范圍內(nèi)，對羊毛纖維、TCEP法和NaHSO3法分別提取的角蛋白做紅外光譜分析.

（2）SDS－PAGE分子質(zhì)量測試:采用DYY－16D型凝膠電泳儀對TCEP法和NaHSO3法提取的角蛋白原液進(jìn)行分子量測試.分離膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)15%，濃縮膠質(zhì)量分?jǐn)?shù) 5%，上樣 10 μL，取過濾后的溶液 3 μL，樣品稀釋液7 μL.電壓80 V，用考馬斯藍(lán)R－250染色.

（3）TG熱失重分析:采用TG209F3型熱重分析儀以10℃/min的升溫速率在20～800℃內(nèi)對羊毛纖維及TCEP法和NaHSO3法分別提取的角蛋白的熱穩(wěn)定性進(jìn)行對比.

（4）溶解性分析:采用BX51型偏光顯微鏡觀察TCEP法和NaHSO3法分別提取的角蛋白在DMSO溶液中的溶解性，即將2種方法提取的角蛋白粉末分別與DMSO按質(zhì)量比1∶11.5混合均勻后，取少量溶液放置在顯微鏡熱臺(tái)上，調(diào)整熱臺(tái)升溫速率為5℃/min，升溫范圍30～60℃，觀察溶解現(xiàn)象.

（5）不同溫度下角蛋白/PVA復(fù)合膜的吸水性能測試:將已知質(zhì)量（m1）的復(fù)合膜放入20℃去離子水中浸泡1 h后，再分別轉(zhuǎn)入30、40和50℃去離子水中浸泡0.5 h后取出復(fù)合膜，用濾紙吸去表面水后稱重（mt）.計(jì)算樣品的吸水率（Q）:[12]

2 結(jié)果與討論

2.1 紅外光譜分析

對羊毛、TCEP法和NaHSO3法分別提取的角蛋白進(jìn)行傅里葉紅外光譜分析，如圖1所示.

圖1 羊毛及角蛋白的紅外譜圖Fig.1 IR spectra of wool and keratin

由圖1可見，羊毛及羊毛提取物的紅外譜圖都屬于典型的蛋白類紅外光譜圖，即具有明顯的氫鍵、肽鍵、酰胺Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ帶的特征.根據(jù)文獻(xiàn)[13－16]可知:在波數(shù)3090 cm－1附近原毛和羊毛的提取物均出現(xiàn)明顯的吸收峰，這是多肽（—CONH—）的特征吸收峰，證明了TCEP法和NaHSO3法對羊毛酰胺鍵的影響不大.羊毛在紅外光譜中2973 cm－1處較弱的吸收峰是C—H的伸縮振動(dòng)譜帶，TCEP法和NaHSO3法提取的角蛋白的C—H吸收峰在2960 cm－1處，這是由于二硫鍵在溶解的過程中發(fā)生斷裂，使C—H的極性增強(qiáng)，從而使C—H吸收峰的位置向低波數(shù)移動(dòng).原毛的酰胺Ⅲ吸收峰為1235 cm－1，TCEP法和NaHSO3法提取的角蛋白的酰胺Ⅲ吸收峰分別為 1242 cm－1、1230 cm－1，酰胺Ⅲ帶由N—H彎曲振動(dòng)和C—N的伸縮振動(dòng)產(chǎn)生，偏重C—N伸縮振動(dòng)[17]，而羊毛、TCEP法和NaHSO3法提取的角蛋白在酰胺Ⅲ帶差別細(xì)小，說明在進(jìn)行羊毛溶解時(shí)，羊毛大分子鏈間的化學(xué)鍵保持完整，HN鍵振動(dòng)變化不明顯，也就是說采用TCEP法和NaHSO3法溶解羊毛可以制得分子質(zhì)量相對較高的角蛋白[18].

2.2 羊毛角蛋白液的SDS-PAGE電泳分析

圖2所示為角蛋白的分子質(zhì)量分布圖.

圖2 2種方法提取的角蛋白分子質(zhì)量分布Fig.2 Molecular weight distribution of keratin extracted by two kind of methods

由圖2可知，TCEP法提取角蛋白的分子質(zhì)量比較集中，角蛋白的分子質(zhì)量分布在9.5～43 KD之間，主要集中在9.5～22 KD之間.NaHSO3法角蛋白分子質(zhì)量分布很寬，在9.5～97.4 KD均有分布，在14.4 KD處有一條比較深的線條，說明最為集中在14.4KD分子質(zhì)量處.

角蛋白經(jīng)水解可以成為分子質(zhì)量較小的系列中間產(chǎn)物直至氨基酸，在一定條件下得到的角蛋白實(shí)際上是各種中間產(chǎn)物和最終產(chǎn)物組成的混合體.羊毛角蛋白分為中長蛋白（分子質(zhì)量45～60 KD）、高或超高硫蛋白（分子質(zhì)量10～40 KD）、高－氨基乙酸－酪氨酸蛋白（分子質(zhì)量10 KD）3類.NaHSO3法提取的角蛋白中有超過60 KD的蛋白，是由于使用NaHSO3作為還原劑時(shí)，存在可逆反應(yīng)RSSR?2RSH，羊毛中的二硫鍵有90%被打開時(shí)，羊毛就被溶解[19].因此溶解的羊毛溶液中可能存在少量的二硫鍵未被打開，這些未斷開的二硫鍵使部分的肽鏈相連，使電泳得到的角蛋白分子質(zhì)量大于羊毛蛋白分子質(zhì)量.TCEP法制得的角蛋白的相對分子質(zhì)量集中在9.5～22 KD之間（＜60 KD），說明TCEP法更能有效的斷開二硫鍵，最終蛋白質(zhì)中含有氨基酸、多肽等較低分子質(zhì)量的物質(zhì).

2.3 TG熱重分析

對2種提取方法所獲得的角蛋白進(jìn)行熱重分析，結(jié)果如圖3所示.

圖3 羊毛及角蛋白的TG曲線Fig.3 TG cuves of wool and keratin

由圖3可知，TCEP法和NaHSO3法分別提取的角蛋白在46℃附近有一個(gè)明顯的失重，到90℃時(shí)重量達(dá)到一個(gè)初步穩(wěn)定的階段，這個(gè)過程可能是水分蒸發(fā)造成的，TCEP法和NaHSO3法分別提取的角蛋白有相同的熱失重率.羊毛、TCEP法和NaHSO3法提取角蛋白的初始分解溫度均在230℃附近，而且羊毛的初始分解溫度比角蛋白的高，這是由于羊毛的結(jié)構(gòu)比角蛋白的更加緊密，羊毛在溶解過程中二硫鍵被打開，空間立體結(jié)構(gòu)被破壞，同時(shí)部分α－螺旋結(jié)構(gòu)變?yōu)棣拢郫B結(jié)構(gòu)，角蛋白的結(jié)構(gòu)較松散，因此熱穩(wěn)定性下降.羊毛的最終質(zhì)量保留率比角蛋白的要高，這可能是由于角蛋白中結(jié)晶α-螺旋結(jié)構(gòu)的減少和β-折疊、無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)的增加造成的.TCEP法提取的角蛋白比NaHSO3法提取的角蛋白的質(zhì)量保留率要低，說明了TCEP法制得的角蛋白中β－折疊和無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)比NaHSO3法制得的角蛋白中的增加的多，即TCEP法能更有效地破壞羊毛的螺旋結(jié)構(gòu)和提取角蛋白.

2.4 角蛋白的溶解過程

角蛋白在DMSO中的溶解情況如圖4所示.

圖4 角蛋白在DMSO中的溶解現(xiàn)象Fig.4 Phenomena of keratin in DMSO solution

水溶性及非水溶性的角蛋白在DMSO溶劑中均有很好的可溶性，在60℃左右?guī)缀跞咳芙?由圖4可以看出，NaHSO3法提取的角蛋白在40℃開始溶解，60℃時(shí)幾乎完全溶解于DMSO溶劑，而TCEP法提取的角蛋白在50℃才開始溶解，60℃時(shí)只有少量的角蛋白溶于DMSO溶劑，這說明TCEP法提取的角蛋白與NaHSO3法提取的角蛋白不相同.

2.5 復(fù)合膜的吸水性

圖5所示為溫度對角蛋白/PVA復(fù)合膜吸水率的影響.

圖5 溫度對膜吸水率的影響Fig.5 Influence of temperature on membrane water absorption

由圖5可知，當(dāng)溫度從40℃升至50℃時(shí)，PVA膜和復(fù)合膜的吸水率均有大幅提高，這是由于PVA膜和復(fù)合膜在較高溫度的蒸餾水中能更好地舒展開，大量的親水集團(tuán)暴露，使得膜的吸水率大幅提高.膜中具有的親水基團(tuán)的親水性越強(qiáng)則復(fù)合膜的親和力越大，吸水倍率也就越高，親水基團(tuán)親水力:—SO3H>—COOH>—CONH2>—OH.角蛋白中含有大量的酰胺鍵和羥基，而且酰胺鍵的親水性要高于羥基，也就是角蛋白的親水性要高于PVA，因此復(fù)合膜的吸水率高于PVA膜.

3 結(jié)論

（1）TCEP和NaHSO3這2種還原劑均可以溶解羊毛，提取角蛋白.TCEP法能更有效的打開羊毛中的二硫鍵，提取的角蛋白分子量較集中，而NaHSO3與羊毛反應(yīng)時(shí)存在可逆反應(yīng)，二硫鍵并沒有全部打開，因此角蛋白的分子量分布較寬.

（2）TCEP法提取的角蛋白微溶于DMSO溶液，可見TCEP法提取的角蛋白與NaHSO3法提取的角蛋白不完全相同.

（3）復(fù)合膜在水中的穩(wěn)定性較好，其吸水性隨溫度的變化而變化，具有一定的溫度敏感性.制得的角蛋白/PVA復(fù)合膜可進(jìn)一步研究其力學(xué)性能，以應(yīng)用于重金屬吸附、藥物緩釋等領(lǐng)域.

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