蜂產(chǎn)品農(nóng)獸藥殘留檢測技術(shù)研究進展

柳青　羅紅霞　句榮輝　馬長路　王麗　賈紅亮

（北京農(nóng)業(yè)職業(yè)學院，北京　102442）

蜂產(chǎn)品農(nóng)獸藥殘留檢測技術(shù)研究進展

柳青羅紅霞句榮輝馬長路王麗賈紅亮

（北京農(nóng)業(yè)職業(yè)學院，北京102442）

蜂產(chǎn)品由于具有極高的營養(yǎng)價值而深受消費者的青睞。隨著全球蜂產(chǎn)品消費量的逐漸擴大，農(nóng)獸藥殘留的問題日益嚴重，危害人類的健康，影響蜂產(chǎn)品的出口。本文結(jié)合蜂產(chǎn)品農(nóng)獸藥殘留的現(xiàn)狀，重點闡述了農(nóng)獸藥殘留檢測的方法，并展望了未來蜂產(chǎn)品農(nóng)獸藥殘留檢測技術(shù)的發(fā)展趨勢。

蜂產(chǎn)品；農(nóng)獸藥殘留；檢測方法

蜂蜜為綠色保健營養(yǎng)品，具有消炎、抗菌、抗腫瘤、調(diào)節(jié)血糖和血脂，促進組織再生及提高免疫力等作用。我國是蜂蜜產(chǎn)品的生產(chǎn)大國和出口大國，蜂蜜出口世界70多個國家和地區(qū)，主要集中在日本、歐盟和美國，占世界蜂蜜總產(chǎn)量的20%以上，出口金額1億美元，居世界第二位［1］。近年來，蜂產(chǎn)品質(zhì)量安全事件頻發(fā)，農(nóng)獸藥超標已成為我國蜂產(chǎn)品在國際貿(mào)易中被預警通報或出口退貨的主要問題之一。因此，蜂產(chǎn)品的質(zhì)量安全需要從源頭抓起，加大蜂產(chǎn)品中的質(zhì)量監(jiān)控及農(nóng)獸藥檢測已刻不容緩。本文對蜂產(chǎn)品中農(nóng)獸藥殘留的來源及檢測技術(shù)現(xiàn)狀進行深入分析，為蜂蜜農(nóng)獸藥殘留檢驗方法提供了理論基礎(chǔ)。

1　蜂產(chǎn)品農(nóng)獸藥殘留的現(xiàn)狀

1.1獸藥殘留

蜂產(chǎn)品的污染最主要是來自養(yǎng)蜂過程中用于防治病害的藥物，不同的蜂產(chǎn)品所受到的主要污染風險不同，集中體現(xiàn)在獸藥中抗生素殘留。養(yǎng)殖戶往往通過添加抗生素來防治蜜蜂疾病，使用違禁藥物或長期超標使用獸藥，在喂藥期仍然搖蜜或采漿，導致蜂產(chǎn)品中獸藥殘留超標。2002年1月，由于“氯霉素事件”歐盟中止了進口我國蜂產(chǎn)品，并迅速波及美國、加拿大、日本、沙特、挪威等國家，相繼提高了對中國蜂產(chǎn)品藥物殘留的檢出限量要求，使我國蜂產(chǎn)品出口嚴重受阻，致使2003年上半年蜂產(chǎn)品出口量比上年減少44.34%，創(chuàng)匯額減少38.11%，蜂產(chǎn)品加工、出口企業(yè)損失慘重，蜂業(yè)面臨嚴峻挑戰(zhàn)。常用于養(yǎng)蜂業(yè)中的獸藥包括四環(huán)素類（四環(huán)素、土霉素、金霉素、強力霉素）、氯霉素、磺胺類、甲硝唑類、大環(huán)內(nèi)酯類和硝基呋喃及代謝產(chǎn)物。這些獸藥殘留嚴重影響蜂蜜的質(zhì)量安全，危害人體的健康，造成經(jīng)濟損失，影響我國蜂產(chǎn)品的國際聲譽。秦皇島出入境檢驗檢疫局國家蜂產(chǎn)品檢測重點實驗室對覆蓋全國28省440家蜂產(chǎn)品企業(yè)，40萬個蜂蜜樣品檢測，2003～2010年蜂產(chǎn)品中獸藥殘留檢出率見后頁表1。可知近年來硝基呋喃、硝基咪唑等獸藥殘留種類有所增加，而歐盟對此限量值分別為0.3和0.1μg/kg。因此，需采取多種手段，依靠現(xiàn)代檢測分析技術(shù)嚴把蜂產(chǎn)品質(zhì)量關(guān)。

1.2農(nóng)藥殘留

蜂蜜中的農(nóng)藥主要來源于環(huán)境污染和蜜源植物用藥，為了防治作物病蟲害，蜂農(nóng)使用有機氯、有機磷等除草劑以及植物生長調(diào)節(jié)劑。常見的農(nóng)藥殘留主要有有機氯類、有機磷農(nóng)藥、氟胺氰菊酯、溴螨酯和蠅毒磷等，這些農(nóng)藥在蜂產(chǎn)品中的殘留因?qū)θ梭w具有潛在的危害性而引起了人們廣泛的關(guān)注，長期使用對環(huán)境和人體都會產(chǎn)生不良作用。有研究表明，有機磷類農(nóng)藥具有致癌性、細胞毒性、遺傳毒性、致畸性和免疫毒性［3-4］。另一方面，蜂螨會產(chǎn)生抗藥性，為了除螨效果和處于經(jīng)濟方面的考慮，蜂農(nóng)會增加農(nóng)藥的用量，易進入蜂蠟而殘留，使蜂箱里的蜂蠟、蜂蜜、蜂膠等受到污染。世界上許多國家已經(jīng)規(guī)定和正在研究制定這些農(nóng)藥在蜂蜜中的殘留限量。瑞士規(guī)定蜂蜜中溴螨酯、蠅毒磷和氟胺氰菊酯的最高殘留限量分別為0.1 mg/kg、0.05 mg/kg和0.05 mg/kg。Martel AC［5］和Frazier M［6］等人報道了受測的100%蜂蠟樣品中蠅毒磷和氟胺氰菊酯等殺螨劑均超標。Wallner K［7］和Tremolada P［8］等人也研究了農(nóng)獸藥在蜂蠟、蜂蜜和其他蜂產(chǎn)品中的殘留。

2　蜂產(chǎn)品農(nóng)獸藥檢測方法

2.1高效液相色譜法及其聯(lián)用技術(shù)

高效液相色譜法（HPLC）是利用不同物質(zhì)在不同相態(tài)中分配系數(shù)的不同，以流動相對固定相中的待測物進行洗脫，使待測物中的物質(zhì)以不同的速度沿固定相移動，最終達到分離的方法。由于具有分離效率高、選擇性好、檢測靈敏度高等特點，在蜂蜜農(nóng)藥殘留測定中的應用廣泛。Kazuhiro Fujita等［9］人將樣品經(jīng)0.01 mol/L，pH4.0的Na2EDT A-Mcllvaine緩沖溶液提取后，通過雙重苯乙烯二乙烯苯共聚合小柱及銅離子螯合親和色譜柱凈化富集，利用高效液相色譜熒光檢測器檢測，結(jié)果表明土霉素、四環(huán)素、金霉素的最低檢測限分別達到0.5、0.7、0.9 ng/g。

表1　蜂產(chǎn)品中獸藥殘留檢出率［2］

液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)可獲得單一分析技術(shù)難以達到的效果，采用固相免疫親和柱凈化樣品可提高檢測分析技術(shù)的特異性［10］。其中，高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜由于集高效分離和多組分定性、定量于一體，因此對高沸點和熱不穩(wěn)定化合物的分離和鑒定具有獨特優(yōu)勢?？捎糜诨前奉悺ⅵ?內(nèi)酰胺類、四環(huán)素類、喹諾酮類、大環(huán)內(nèi)酯類、氨基糖苷類、酰胺醇類、硝基呋喃類、苯并咪唑類等，更重要的是不同種類獸藥的同時檢測。Manuel Lombardo-Agüí等［11］建立了超高液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（UHPLCMS/MS）同時分析蜂蜜、蜂王漿和蜂膠中環(huán)丙沙星、單諾沙星、恩諾沙星、麻保沙星、沙拉沙星、二氟沙星、氟甲喹、惡喹酸8種喹諾酮類獸藥的方法，同時利用分散固相萃取的方法（QuEChERS）提取和凈化，通過優(yōu)化色譜條件，3min可使8種藥物達到完全分離。Economou A等［12］研究了液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜方法對蜂蜜中的7種磺胺類藥物的影響，利用固相萃取技術(shù)進行樣品凈化，使用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS/MS）在ESI正模式下分析，同時使用兩種不同的同位素標記的內(nèi)標物對結(jié)果進行校準。根據(jù)歐盟執(zhí)行委員會2002/657/EC決議對該方法進行驗證，結(jié)果表明平均回收率在1.5，2.5和5.0 mg/kg三個濃度水平置信區(qū)間在70%至106%范圍內(nèi)，相對標準偏差范圍為6～18%，判定限和檢測能力值范圍分別為0.4～0.9和0.7～1.4 mg/kg。Kujawski M W［13］等人用LC-ESI-MS/MS檢測了波蘭蜂蜜中高滅磷、聯(lián)苯三唑醇、西維因、毒死蜱、抑霉唑、吡丙醚、氟草唑酯等13種不同種類的農(nóng)藥殘留，以磷酸三苯酯為內(nèi)標物定量檢測了40個實際樣品，87.5%檢測出有1～5種目標物。A.Carrasco-Pancorbo［14］等采用SPE-HPLC-TOFMS（液相色譜-四極桿-飛行時間質(zhì)譜）測定蜂蜜中四環(huán)素類的獸藥殘留，其回收率為72～98%，相對標準偏差為2.51～6.42%（n=6）。

2.2毛細管電泳（CE）

毛細管電泳已發(fā)展成為分離科學中最活躍的領(lǐng)域之一，具有操作簡單、色譜柱不受樣品污染、分析速度快、分離效率高、樣品量小、檢測成本低等優(yōu)點。毛細管電泳是利用樣品組分在高壓電場作用下遷移速率不同而達到分離的方法，根據(jù)離子到達檢測器的時間不同，得到按時間分布的電泳圖譜。毛細管電泳根據(jù)樣品組分在背景緩沖液中所受作用的不同可以分為毛細管區(qū)帶電泳、毛細管膠束電動色譜、毛細管凝膠電泳、毛細管等速電泳、毛細管等電聚集、毛細管電色譜等。但是因毛細管電泳遷移重現(xiàn)性低，靈敏度不如HPLC而在痕量殘留分析中的應用受到一定的限制。Casado-Terrones S［15］報道了使用毛細管電泳測定蜂蜜中四環(huán)素類藥物的方法，蜂蜜樣品用C18小柱凈化后，甲醇洗脫，用毛細管電泳-紫外檢測器測定，8種四環(huán)素藥物的檢出限為23.9～49.3 ng/g。M.Herndndez等［16］用毛細管區(qū)域電泳技術(shù)測定了生物樣品中的β一內(nèi)酰胺、喹諾酮類抗生素。Fuh Ming-Ren S等［17］建立了肉制品中8種磺胺類獸藥殘留的毛細管電泳檢測方法。分離電壓25KV下，pH=6.5，35 mmol/L Na3PO4～H3PO4緩沖液固相萃取柱凈化，在0.5～50 μg/ml線性范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，回收率為80～97%，檢出限在5～10 μg/kg范圍內(nèi)，符合歐盟的限量標準。

2.3免疫分析法（IA）

免疫分析法是以抗原與抗體的特異性、可逆性結(jié)合反應為基礎(chǔ)的分析技術(shù)，有特異性強、靈敏度高（檢測限可達1μg～1pg）、方便快捷、分析成本低等優(yōu)點，正逐漸成為農(nóng)獸藥殘留檢測的熱點。目前應用的殘留免疫分析法有放射免疫測定法、酶聯(lián)免疫吸附測定法（ELISA）、固相免疫傳感器等。目前最為成熟的技術(shù)是ELISA，已廣泛用于蜂蜜、牛奶、果蔬等食品的檢測。2005年，酶聯(lián)免疫法制訂為蜂蜜四環(huán)素類抗生素檢測的國家標準。此外，美國和加拿大使用微生物拭子檢測法（SwabTest on Premises）、牛的抗生素和磺胺實驗法（CalfAntibiotic and SulfaTest）、快速抗生素篩選實驗法（Fast Antibiotical Screen Test）；歐盟常用的方法為：德國三碟實驗法（German Three Plate Test）、歐盟四碟實驗法（European Union Four Plate Test）、新的荷蘭腎實驗法（New Dutch Kidney Test）等，國外許多公司如美國已將微生物法試劑盒商品化［18-19］。I.Guillén等［20］研究了側(cè)流免疫層析法檢測蜂蜜樣品中殘留的磺胺噻唑此方法中磺胺噻唑檢測限為15 μg/kg，并且可在10 min內(nèi)達到定性結(jié)果。

2.4氣相色譜法及其聯(lián)用技術(shù)

氣相色譜法是一種以氣體為流動相的柱色譜分離技術(shù)，適合溶劑沸點低而檢測物質(zhì)沸點高的體系測定，已經(jīng)成為蜂產(chǎn)品農(nóng)殘檢測分析中最常用的方法。在農(nóng)殘檢測中，在殘留濃度很低的情況下，不僅根據(jù)待測物在圖譜上的保留時間，更主要是依據(jù)農(nóng)藥裂解的特征離子碎片，由質(zhì)譜數(shù)據(jù)可準確判斷化合物的結(jié)構(gòu)信息。GC-MS（氣質(zhì)聯(lián)用）技術(shù)很好的發(fā)揮了色譜的準確分離能力，同時提高了質(zhì)譜的物質(zhì)分析鑒別能力。低分辨GC-MS主要是四級桿質(zhì)譜和離子阱質(zhì)譜，高分辨主要是飛行時間質(zhì)譜和扇形場質(zhì)譜。Russo等［21］分別用GCMS和GC-ECD對蜂蜜中氟胺氰菊酯進行檢測，色譜柱均為SE-54，檢出限分別為0.018 mg/kg和0.008mg/ kg。Chauzat等［22］用CP Sil 8 CB/MS色譜柱，經(jīng)GC-MS/ MS測定蜂蠟中18種殺蟲劑的殘留量，其檢出限均為0.005 mg/kg。Frison等［21］通過GC-MS用DB-5MS色譜柱測定蜂蠟中氟胺氰菊酯的殘留量，檢出限為0.05 mg/kg。

2.5分子印跡技術(shù)（MIT）

分子印跡技術(shù)是通過人工合成手段將印跡分子與聚合物單體鍵合，獲得在空間結(jié)構(gòu)和結(jié)合位點上與模板分子完全匹配、具有分子識別功能的聚合物，該技術(shù)科用于藥物、激素、蛋白質(zhì)、碳水化合物的分離工作。Bhim等［23］制備了以硅膠鍵合的嗯唑酮的分子印跡聚合物，作為固相萃取劑識別了β-內(nèi)酰氨抗生素類藥頭孢菌霉素和青霉素。夏環(huán)等［24］采用沉淀聚合法，以諾氟沙星為模板分子，合成了對氟喹諾酮類抗生素具有特異性識別的分子印跡聚合物，以該分子印跡聚合物作為固相萃取柱填料，建立了分子印跡固相萃取-高效液相色譜檢測蜂蜜中三種FQs抗生素殘留的方法。與Oasis HLB固相萃取柱相比，該分子印跡固相萃取柱具有更好的凈化能力和更高的富集效率。其線性范圍為0.125～12.5 mg/kg，檢出限為9～12 μg/kg，回收率在96.5～104.1%范圍內(nèi)。

3　展望

當今在日益重視食品安全和環(huán)境保護的發(fā)展形勢下，世界各國對蜂產(chǎn)品中農(nóng)獸藥殘留的控制越來越嚴格，許多重要的分析技術(shù)在蜂產(chǎn)品農(nóng)獸藥殘留分析中得到了廣泛的應用。Reybroeck W和Sun X Y等［25］報道了新型生物與物理方法結(jié)合的農(nóng)獸藥檢測技術(shù)，該方法幾乎不使用有毒試劑，安全、快速、簡單，有一定的抗干擾能力。另外一些新型的檢測器和快速掃描測定技術(shù)［26］等也推動了蜂產(chǎn)品檢測分析技術(shù)的發(fā)展。未來安全、快速、便攜化的篩選性的同步多殘留檢測是國際食品污染物分析檢測技術(shù)的主流趨勢，將更加側(cè)重于利用高效、高靈敏的聯(lián)用技術(shù)進行多種類藥物檢測方法的開發(fā)，隨著儀器分析技術(shù)的不斷提高，在建立這些污染物質(zhì)譜譜庫的基礎(chǔ)上，快速溶劑萃取、超臨界溶劑萃取等樣品前處理技術(shù)，超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜、超高效液相色譜-飛行時間質(zhì)譜等高端分析檢測技術(shù)的發(fā)展，同時力爭實現(xiàn)分析過程自動化或智能化，以提高農(nóng)獸藥分析效率，降低蜂產(chǎn)品檢測的成本。

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Advances of Studies on Techniques for Pesticide and Veterinary drug residues Determination in beeproducts

Liu Qing，Luo Hongxia，Ju Ronghui，Ma Changlu，Wang Li，Ja Hongliang
（Beijing Vocational College of Agriculture，Beijing，102442 China）

Honey has a high nutritional value and health benefits，and favored by consumers.sales have increased. With theglobal beeproducts consumption，agriculture and veterinary drug residue problem becomes more and more serious，endangering human health，affected the export of bee products.In this paper，combined with the status quo of bee products farming veterinary drug residue，expounds the farming of veterinary drug residue detection methods，and prospects the future trend of the development of bee products farming veterinary drug residue detection technology.

beeproducts，pesticide and veterinary drug residues，determination techniques

北京農(nóng)業(yè)職業(yè)學院技術(shù)推廣與示范項目“蜂產(chǎn)品中農(nóng)獸藥殘留的檢測研究”，項目編號（XY-YF-13-10）

柳青（1982-），女，博士，講師，研究方向為食品營養(yǎng)與檢測，北京農(nóng)業(yè)職業(yè)學院食品與生物工程系.Email：liuqingedu@126.com