蒙古沙冬青AmDREB2.1基因的克隆及表達分析

李章磊 高飛 曹玉震 張至瑋 王寧 李華云 周宜君

（中央民族大學生命與環(huán)境科學學院，北京 100081）

蒙古沙冬青AmDREB2.1基因的克隆及表達分析

李章磊 高飛 曹玉震 張至瑋 王寧 李華云 周宜君

（中央民族大學生命與環(huán)境科學學院，北京 100081）

基于已建立的蒙古沙冬青［Ammopiptanthus mongolicus（Masxim.）Cheng f.］根的轉(zhuǎn)錄本數(shù)據(jù)庫，分離到1個編碼DREB類轉(zhuǎn)錄因子基因，命名為AmDREB2.1。該序列全長978 bp，包括531 bp的開放閱讀框（ORF），編碼176個氨基酸，具有典型的DREB轉(zhuǎn)錄因子保守的AP2結構域。實時熒光定量PCR分析表明，該基因能在根、葉中表達，但對干旱、低溫響應不同，AmDREB2.1主要參與根的干旱脅迫應答。

蒙古沙冬青；AmDREB2.1；序列分析；表達模式

沙冬青屬植物是亞洲中部地區(qū)唯一和特有的常綠闊葉灌木，是第四季冰川孑遺植物［1］，具有重要的研究價值。沙冬青屬為寡種屬，僅有蒙古沙冬青和新疆沙冬青2個種。蒙古沙冬青［Ammopiptanthus mongolicus（Maxim）Cheng f.］，也被稱為沙冬青、冬青、蒙古黃花木，主要分布于我國內(nèi)蒙古、寧夏等地，具有抗旱、抗寒、抗風蝕等特性，在我國西北部荒漠地區(qū)的生態(tài)平衡和水土保持中發(fā)揮了重要作用，同時也被認為是研究林木抗逆機制、發(fā)掘抗逆基因資源的理想材料。近年來，關于沙冬青抗逆分子機制和抗逆功能基因的研究受到越來越多的重視［2-6］。

干旱、低溫等非生物逆境是影響植物生長發(fā)育的重要因素。植物對逆境脅迫的響應是通過眾多基因的逐次表達實現(xiàn)的，這些基因可分為功能基因和調(diào)節(jié)基因兩大類。轉(zhuǎn)錄因子基因是一類重要的調(diào)節(jié)基因，研究轉(zhuǎn)錄因子在植物脅迫應答中的作用有助于推進對于植物逆境分子機制的認識。DREB（dehydration responsive element binding）類轉(zhuǎn)錄因子屬于植物AP2/EREBP（ethylene-responsive element binding protein）轉(zhuǎn)錄因子大家族中的一個亞族，可通過其保守的AP2結構域與多個逆境應答基因啟動子區(qū)的DRE（dehydration responsive element）/CRT（C-repeat responsive element）順式作用元件特異性地結合，在逆境脅迫下調(diào)控一系列下游逆境應答基因的表達［7，8］。目前，研究人員已經(jīng)對DREB類轉(zhuǎn)錄因子基因（擬南芥CBF3 /DREB1A［9］、水稻OsDREB1F［10］、玉米ZmDREB2［11］，煙草NbDREB-2a［12］）進行了轉(zhuǎn)基因研究，發(fā)現(xiàn)所獲得的轉(zhuǎn)基因植物能具有較高的干旱、高鹽或低溫耐受性?？寺『丸b定更多的DREB 類基因用于篩選抗逆作物育種的候選基因已成為國內(nèi)外植物抗逆分子生物學領域研究的熱點之一［13］。

本研究以蒙古沙冬青為材料，基于實驗室前期建立的蒙古沙冬青根轉(zhuǎn)錄本數(shù)據(jù)庫［2］，從中克隆得到1個新的DREB類基因，對其序列特征、編碼蛋白的功能域及系統(tǒng)進化關系進行分析，并對其逆境表達模式進行研究，旨在為闡釋蒙古沙冬青DREB類轉(zhuǎn)錄因子在應答干旱、低溫等逆境脅迫中的分子機制提供試驗數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

蒙古沙冬青（A. mongolicus）種子采自寧夏自治區(qū)中衛(wèi)縣。Trizol試劑購自Invitrogen公司，F(xiàn)astQuant cDNA第一鏈合成試劑盒和PCR Master Mix購自天根公司，膠回收試劑盒購自Bio Teke公司，pGEM-T載體購自Promega公司，大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α感受態(tài)細胞購自北京博邁德科技發(fā)展有限公司，SYBR Green Supermix購自Thermo公司。

1.2 方法

1.2.1 試驗材料處理 種子經(jīng)播種、萌發(fā)培養(yǎng)4周后，采用含20% PEG6000的1/2 Hoagland營養(yǎng)液澆灌，分別處理1、6、24和72 h。在低溫恒溫冷光源光照培養(yǎng)箱中，4℃下分別處理1、3、6和24 h；以未脅迫處理（0 h）為對照。分別取脅迫處理和未經(jīng)脅迫處理后的植物根和葉片組織，稱量后迅速放入液氮中，用于基因的克隆和表達模式分析。

1.2.2 AmDREB2.1基因的克隆 采用本實驗室改良的Trizol 法分別提取不同脅迫處理的植物根和葉片組織總RNA［14］，用FastQuant cDNA第一鏈合成試劑盒合成cDNA第一鏈。

根據(jù)本實驗室的蒙古沙冬青根轉(zhuǎn)錄本數(shù)據(jù)庫中的數(shù)據(jù)，進行DREB相關基因序列的搜索，獲得1個編碼DREB基因序列。采用Primer 5.0設計簡并引物，引物序列為5'-GGCGGTGGTGTGATAAACTC-3'/5'-ATGCACCACAACACACGATT-3'。以反轉(zhuǎn)錄得到的未經(jīng)脅迫處理的cDNA為模板，進行PCR擴增，反應體系：2×Pfu PCR Master Mix 20 μL，上下游引物（10 μmol/L）各1 μL，cDNA 1 μL，ddH2O 17 μL，總體積40 μL。反應條件：94℃ 3 min；94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 45 s，30個循環(huán)；72℃ 5 min；4℃保溫。膠回收目的片段，與pGEM-T載體連接，轉(zhuǎn)化E.coli DH5α感受態(tài)細胞，挑取單克隆進行菌落PCR 檢測，篩選出陽性克隆，送至北京華大基因公司測序。

1.2.3 AmDREB2.1基因的生物信息學分析 分別采用相關生物信息學軟件對獲得的蒙古沙冬青編碼DREB基因AmDREB2.1及演繹的氨基酸序列進行分析，具體分析目標及選用的相關軟件見表1。

表1 AmDREB2.1基因的生物信息學分析使用的相關軟件

1.2.4 AmDREB2.1的表達模式分析 根據(jù)熒光定量PCR（Quantitative real-time PCR，qRT-PCR）檢測引物的設計原則設計基因檢測引物和內(nèi)參引物。用引物5'-GTGCCAGAGTGGATGCTCTT-3'/5'-ATGCACCACAACACACGATT-3'擴增目標基因AmDREB2.1，用引物5'-CTGACATGCGCCGTAGGAACG-3'/5'-CCCTGCTTATGCCAGTCTTTT-3'擴增內(nèi)參基因AmeIF1（蒙古沙冬青的真核起始因子基因）。

采用qRT-PCR對不同脅迫處理下AmDREB2.1在根和葉片中的表達模式進行分析，以未處理（0 h）為對照，以AmeIF1為內(nèi)參基因。反應體系（10 μL）：2×SYBR Green Supermix 5 μL， 上 下游引物（10 μmol/L）各0.3 μL，稀釋后cDNA模板0.8 μL，ddH2O 3.6 μL。 反 應 于Bio-Rad MyIQ2熒光定量PCR儀上進行。反應條件：95℃預變性5 min；95℃ 10 s，60℃ 20 s，循環(huán)40次；55℃ 10 s（0.5℃/循環(huán)），循環(huán)81次。采用基因表達相對定量分析，將對照樣本的基因表達量設為1，處理樣本中的基因表達量變化的倍數(shù)用2-△△Ct來表示，其中：△△Ct=△Ct（處理）-△Ct（對照），△Ct=Ct（目標基因）-Ct（內(nèi)參基因），計算在不同處理下基因的表達量，其中每個處理重復3次，每個重復做3個平行。

2 結果

2.1 AmDREB2.1基因全長的克隆

用改良Trizol法提取蒙古沙冬青總RNA，根據(jù)本實驗室已建立的蒙古沙冬青根的轉(zhuǎn)錄本數(shù)據(jù)庫中搜索獲得的DREB基因序列設計引物，進行PCR擴增，獲得的目的片段大小為600 bp左右，擴增結果與預測結果一致（圖1）。

圖1 蒙古沙冬青AmDREB2.1的ORF區(qū)PCR產(chǎn)物電泳圖

2.2 AmDREB2.1基因的生物信息學分析

2.2.1 AmDREB2.1基因全長序列的結構特征 采用DNAMAN 7.0分析從蒙古沙冬青根轉(zhuǎn)錄本數(shù)據(jù)庫中獲得的1個編碼DREB的基因全長序列。序列全長為978 bp，其中5' UTR 長度為257 bp，3' UTR長度為 190 bp 。ORF編碼區(qū)長度為531 bp，可編碼176個氨基酸（圖2-A）。計算其等電點（pI）為5.59，分子量（MW）為20 210.16 Da。采用NCBI在線分析序列表明，此基因編碼的蛋白質(zhì)具有典型的AP2結構域，具有11個DNA結合位點，應屬于AP2超家族成員（圖2-B）。與GenBank登錄的部分DREB基因進行多序列比對，發(fā)現(xiàn)該基因與很多DERB2類基因高度相似，故將其命名為AmDREB2.1。

AmDREB2.1的氨基酸序列的潛在磷酸化位點共計11個，其中7個為Ser，3個為Thr，1個為Tyr。AmDREB2.1不存在跨膜結構，不是跨膜蛋白。用SignalP 3.0Server在線軟件分析確定AmDREB2.1不具有信號肽。用PSORT對AmDREB2.1的氨基酸序列進行亞細胞定位分析，推測其定位于細胞核中。采用cNLS Mapper對AmDREB2.1的氨基酸序列進行核定位信號分析，確定其核定位信號序列由30個氨基酸構成（圖2-A灰色陰影部分）。

2.2.2 AmDREB2.1高級結構預測 基因功能的最終表現(xiàn)在于它所編碼的蛋白質(zhì)的功能，而功能的實現(xiàn)取決于其高級結構特征。二級結構預測表明AmDREB2.1的二級結構主要有3種類型，分別為α-螺旋、β-折疊片和無規(guī)則卷曲。3種結構所占比例不同，以無規(guī)則卷曲為主，β-折疊片較少（圖3-A）。三級結構預測結果見圖3-B。

2.2.3 AmDREB2.1的系統(tǒng)進化分析 在NCBI中搜索與AmDREB2.1氨基酸序列相近的10個編碼DREB氨基酸序列：擬南芥（Arabidopsis thaliana）AtDREB2A/BAA36705.1、AtDREB2B /AEE74994.1和AtDREB2C/ AEC09816.1，白刺花（Sophora davidii）SdDREB2/AFP89590.1，大豆（Glycine max）GmDREB1/AAP47161.1、GmDREB2/ABB36645.1和 GmDREB3/ABB36646.1，鹽豆木（Halimodendron halodendron）HhDREB2/ACJ66376.1，水稻（Oryza sativa）OsDREB2A/Q0JQF7.1和玉米（Zea mays）ZmDREB-2A/ANP_001105876.1，已有文獻報道的2個蒙古沙冬青中編碼DREB序列AmDREB1［15］和AmDREB3［16］，與本研究的AmDREB2.1等共計13個DREB的氨基酸序列采用MEGA5.0進行多序列比對，并構建進化樹，結果見圖4和圖5。

圖2 AmDREB2.1的核苷酸序列及推測的蛋白質(zhì)序列特征

圖3 AmDREB2.1的二級結構（A）與三級結構預測（B）

圖4為選取的不同植物13個DREB氨基酸序列比對結果，各序列盡管長短有別，但都具有13個保守的氨基酸，保守氨基酸的存在可能與AP2結構域有關。從構建的系統(tǒng)進化樹（圖5）可知，在選取的13種DREB蛋白質(zhì)中，AmDREB2.1和豆科的鹽豆木HhDREB2、大豆GmDREB2和GmDREB1聚為一類，與HhDREB2親緣關系最近；與擬南芥的AtDREB2A、AtDREB2B和AtDREB2C的關系較遠。此外，本研究的AmDREB2.1與已報道的AmDREB1和AmDREB3的親緣關系相對較遠。

圖4 AmDREB2.1與其他植物已知DREB 蛋白的多序列比對

圖5 AmDREB2.1的系統(tǒng)進化樹分析

2.3 AmDREB2.1基因的表達模式分析

2.3.1 干旱脅迫下AmDREB2.1的表達特征 以20% PEG6000模擬干旱脅迫處理，采用qRT-PCR研究AmDREB2.1在干旱脅迫下不同組織中的響應特點，結果（圖6-A）顯示，AmDREB2.1在根和葉片中的逆境表達模式不同。根中AmDREB2.1在不同的干旱脅迫下皆為顯著上調(diào)表達，1 h表達量為對照水平的4.47倍；6 h表達量達到最大值，為對照水平的12.73倍；隨著脅迫時間延長，24 h和72 h表達量呈明顯的回落趨勢，但高于對照。而葉中AmDREB2.1在不同干旱脅迫條件下表現(xiàn)為下調(diào)表達，1 h表達量顯著下調(diào)，為對照水平的0.31；隨著脅迫時間延長，表達量有上升趨勢。

2.3.2 低溫脅迫下AmDREB2.1的表達特征 以4℃進行處理，采用qRT-PCR研究AmDREB2.1在低溫脅迫下的響應特點，結果（圖6-B）顯示，AmDREB2.1在根和葉片中的逆境表達模式相似，與對照相比皆表現(xiàn)為下調(diào)表達，且隨脅迫時間延長表達量有上升趨勢，但在24 h表達量顯著下調(diào)，其中根中表達量為對照水平的0.36，而葉中表達量為對照水平的0.26。

圖6 AmDREB2.1響應干旱（A）和低溫（B）脅迫的表達特征

3 討論

植物在干旱、低溫等逆境脅迫下，與逆境相關轉(zhuǎn)錄因子的高效表達可激活多個下游基因的轉(zhuǎn)錄和表達，進而達到調(diào)節(jié)多個功能基因的效果。研究表明，在低溫和干旱等逆境脅迫下，DREB 類轉(zhuǎn)錄因子通過與逆境信號途徑中下游基因的啟動子區(qū)域中的DRE 或CRT 順式作用元件結合，進而激活rd（Responsive to dehydration）/COR（Cold responsive /regulated gene）類基因的表達，從而增強植物對逆境脅迫的耐受力［17，18］。DREB類轉(zhuǎn)錄因子成員較多，有的參與低溫響應，有的則與干旱、高鹽/高溫有關。如在擬南芥中，DREB1基因主要受低溫誘導表達，DREB2基因則受干旱、高鹽和高溫誘導表達［18］。DREB類轉(zhuǎn)錄因子對不同脅迫的選擇性應答可能與其自身啟動子結構特點等多種因素有關。

本研究從耐逆植物蒙古沙冬青中分離獲得了1個編碼DREB類轉(zhuǎn)錄因子基因AmDREB2.1，生物信息學分析表明其編碼蛋白具有典型的DREB 類轉(zhuǎn)錄因子所共有的保守AP2結構域和保守的氨基酸。AmDREB2.1與同為豆科的鹽豆木HhDREB2、大豆GmDREB1和GmDREB2親緣關系最近，與十字花科的擬南芥AtDREB2A、AtDREB2B和AtDREB2C親緣關系較遠，與已經(jīng)報道的蒙古沙冬青AmDREB1和AmDREB3分屬在不同的進化支上，同種植物不同成員之間的進化關系結果提示可能存在功能上的差異。

Li等［19］在研究大豆GmDREB時發(fā)現(xiàn)GmDREBc僅在根中受鹽、干旱和ABA誘導。本研究結果表明，盡管AmDREB2.1在蒙古沙冬青的根和葉片中均能表達，但在不同脅迫條件下，AmDREB2.1在根與葉片的表達模式不同。AmDREB2.1主要在根中受干旱脅迫的強烈誘導，而不受低溫脅迫誘導，表明AmDREB2.1主要參與蒙古沙冬青應答干旱脅迫的反應，且具有組織特異性，僅在根中積極響應，符合DREB2類基因主要受干旱、高鹽和高溫誘導表達的特征。我們推測這種現(xiàn)象可能與DREB基因復雜的調(diào)控機制有關。研究人員已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，在植物DREB的啟動子區(qū)域分布著多種與光、ABA、GA、乙烯和茉莉酸等激素、溫度、鈣信號相關的順式作用元件［20］，這些順式作用元件與相應的反式作用元件（如ICE1）發(fā)生相互作用，共同決定DREB基因的表達水平。在干旱和低溫脅迫下的蒙古沙冬青葉片和根系中，激素等條件可能會出現(xiàn)差異，這種差異可能會導致本研究觀察到的AmDREB2.1在不同組織中的不同的逆境誘導模式。研究結果提示DREB轉(zhuǎn)錄因子中的不同成員不僅具有應答不同逆境脅迫的分工，同時存在組織特異性表達特征，研究不同脅迫下不同成員的組織表達特征是十分必要的。本研究結果為進一步探索蒙古沙冬青DREB類轉(zhuǎn)錄因子基因在逆境脅迫應答中的作用機理與功能研究提供了試驗依據(jù)。

4 結論

從蒙古沙冬青中分離到1個編碼DREB類轉(zhuǎn)錄因子基因，命名為AmDREB2.1。該序列開放閱讀框編碼176個氨基酸，具有典型的DREB轉(zhuǎn)錄因子保守的AP2結構域。實時熒光定量PCR分析表明，該基因能在根、葉中表達，但對干旱、低溫響應不同，AmDREB2.1主要參與根的干旱脅迫應答。

［1］ 潘伯榮， 葛學軍. 我國沙冬青屬植物保護生物學研究和保護實踐的回顧與展望［A］. 中國生物多樣性保護與研究進展VI—第六屆全國生物多樣性保護與持續(xù)利用研究會論文集（2004）.北京：氣象出版社， 2005：373-392.

［2］ Zhou YJ， Gao F， Liu R， et al. De novo sequencing and analysis of root transcriptome using 454 pyrosequencing to discover putative genes associated with drought tolerance in Ammopiptanthus mongolicus［J］. BMC Genomics， 2012， 13：266.

［3］ Pang T， Ye CY， Xia X， et al. De novo sequencing and transcriptome analysis of the desert shrub， Ammopiptanthus mongolicus， during cold acclimation using Illumina/Solexa［J］. BMC Genomics， 2013，14（1）：488.

［4］ Guo H， Li Z， Zhou M， et al. cDNA-AFLP analysis reveals heat shock proteins play important roles in mediating cold， heat， and drought tolerance in Ammopiptanthus mongolicus［J］. Funct Integr Genomics， 2014， 14（1）：127-133.

［5］ Wei Q， Kuai BK， Hu P， et al. Ectopic expression of an Ammopiptanthus mongolicus H+-pyrophosphatase gene enhances drought and salt tolerance in Arabidopsis［J］. Plant Cell Tiss Organ Cult， 2012，110：359-369.

［6］ Deng LQ， Yu HQ， Liu YP， et al. Heterologous expression of antifreeze protein gene AnAFP from Ammopiptanthus nanus enhances cold tolerance in Escherichia coli and tobacco［J］. Gene，2014， 539（1）：132-140.

［7］ 李科友， 朱海蘭. 植物非生物逆境脅迫DREB/CBF轉(zhuǎn)錄因子的研究進展［J］. 林業(yè)科學， 2011， 47（1）：124-134.

［8］ Mizoi J， Shinozaki K， Yamaguchi-Shinozaki K. AP2 /ERF family transcription factors in plant abiotic stress responses［J］. Biochim Biophys Acta， 2012， 1819：86-96.

［9］ Liu Q， Kasuga M， Sakuma Y， et al. Two transcription factors， DREB1 and DREB2， with an EREBP/AP2 DNA binding domain separate two cellular signal transduction pathways in drought and low-temperature-responsive gene expression， respectively， in Arabidopsis［J］. Plant Cell， 1998， 10：391-406.

［10］ Wang Q， Guan Y， Wu Y， et al. Overexpression of a rice OsDREB1F gene increases salt， drought， and low temperature tolerance in both Arabidopsis and rice［J］. Plant Mol Biol， 2008， 67：589-602.

［11］ Qin F， Kakimoto M， Sakuma Y. Regulation and functional analysis of ZmDREB2A in response to drought and heat stresses in Zea mays L. ［J］. Plant J， 2007， 50：54-69.

［12］ 耿芳， 郭偉華， 郭玉雙， 等. 煙草DREB轉(zhuǎn)錄因子新基因的克隆與功能分析［J］. 浙江大學學報：農(nóng)業(yè)與生命科學版，2011， 37（1）：22-30.

［13］ Xu ZS， Chen M， Li LC， et al. Functions and application of the AP2 /ERF transcription factor family in crop improvement［J］. J Integr Plant Biol， 2011， 53（7）：570-585.

［14］ 陳靜， 高飛， 周宜君， 等. 改良Trizol法提取蒙古沙冬青總RNA［J］. 生物技術通報， 2013（10）：87-92.

［15］ 楊杞， 白肖飛， 高陽， 等. 沙冬青CBF/DREB1轉(zhuǎn)錄因子cDNA的克隆及序列分析［J］. 基因組學與應用生物學， 2009， 28（6）：1043-1048.

［16］ 張鋒， 王學峰， 董博， 等. 沙冬青AmDREB3基因的克隆及植物表達載體構建［J］. 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學學報， 2012（33）：5-6.

［17］ Stockinger EJ， Gilmour SJ， Thomashow MF. Arabidopsis thaliana CBF1 encodes an AP2 domain containing transcription activator that binds to the C-repeat /DRE， a cis-acting DNA regulatory element that stimulates transcription in response to low temperature and water deficit［J］. Proc Natl Acad Sci USA， 1997， 94：1035-1040.

［18］ Lata C， Prasad M. Role of DREBs in regulation of abiotic stress responses in plants［J］. J Exp Bot， 2011， 62（14）：4731-4748.

［19］ Li XP， Tian AG， Luo GZ， et al. Soybean DRE-binding transcription factors that are responsive to abiotic stresses［J］. Theor Appl Genet， 2005， 110（8）：1355-1362.

［20］ Srivastav A， Mehta S， Lindlof A， et al. Over-represented promoter motifs in abiotic stress-induced DREB genes of rice and sorghum and their probable role in regulation of gene expression［J］. Plant Signal Behav， 2010， 5（7）：775-784.

（責任編輯 馬鑫）

Cloning and Expression Analysis of AmDREB2.1 in Ammopiptanthus mongolicus

Li Zhanglei Gao Fei Cao Yuzhen Zhang Zhiwei Wang Ning Li Huayun Zhou Yijun
（College of Life and Environmental Sciences，Minzu University of China，Beijing 100081）

A new dehydration responsive element binding protein（DREB）transcription factor gene， which was named as AmDREB2.1，was isolated from Ammopiptanthus mongolicus（Masxim.）（Cheng f.）root transcriptome database， that it had been established in our previous work. The full length of the AmDREB2.1 cDNA was 978 bp， including a single 531 bp opening reading frame which encoded a 176-amino acid peptide with a conserved AP2 domain. Quantitative real-time PCR analysis revealed that the AmDREB2.1 expressed in leaf and root of A. mongolicus， but there were different expression patterns under drought or low temperature stress respectively， and it could be mainly induced by drought in root.

Ammopiptanthus mongolicus；AmDREB2.1；sequence analysis；expression pattern

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.04.015

2014-08-20

國家自然科學基金項目（31370356），中央民族大學一流大學一流學科建設項目（YLDX01013），國家大學生創(chuàng)新訓練項目（GCCX2013110015），中央民族大學研究生科研創(chuàng)新項目（K2014044）

李章磊，男，碩士，研究方向：植物分子生物學；E-mail：lizhanglei2008@126.com

周宜君，女，博士，教授，研究方向：植物分子生物學；E-mail：queenzhou@263.net