玉米JAZ家族基因ZmJAZ4的克隆及功能分析

晏勝偉 孫程 周曉今 陳茹梅

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，北京 100081）

玉米JAZ家族基因ZmJAZ4的克隆及功能分析

晏勝偉 孫程 周曉今 陳茹梅

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，北京 100081）

JAZ（Jasmonate ZIM-domain）蛋白是植物特有的一類轉(zhuǎn)錄因子，通過抑制茉莉素調(diào)控基因的表達，在植物的生長發(fā)育及非生物脅迫等方面發(fā)揮重要的功能。從玉米B73自交系中克隆到一個新的JAZ家族基因ZmJAZ4，該基因cDNA全長為651 bp，編碼蛋白含有216個氨基酸，分子量約為23.1 kD，pI為10.78，屬于堿性蛋白。Real-time RT-PCR結(jié)果表明，ZmJAZ4主要在莖端分生組織、雄穗、發(fā)育早期的種子以及胚乳中表達。系統(tǒng)進化分析顯示，ZmJAZ4與AtJAZ10轉(zhuǎn)錄因子相似性較高。亞細胞定位試驗表明，ZmJAZ4定位于細胞核內(nèi)。ZmJAZ4在酵母細胞中不具有轉(zhuǎn)錄激活活性。激素及脅迫處理表明，ZmJAZ4在地上部的表達受PEG、NaCl、SA、GA和ABA誘導(dǎo)，而在地下部的表達受到ABA和GA誘導(dǎo)。結(jié)果分析表明，ZmJAZ4可能是一個重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，參與調(diào)控多種激素信號通路及非生物脅迫響應(yīng)。

茉莉素；ZmJAZ基因；逆境脅迫

JAZ（Jasmonate ZIM-domain）蛋白是一類新發(fā)現(xiàn)的植物中特有的蛋白家族，其通過抑制茉莉素調(diào)控基因的表達而參與植物的生長發(fā)育［1，2］。JAZ屬于TIFY家族，該家族蛋白序列都含有高度保守的TIF［F/Y］XG氨基酸序列，且JAZs可依靠該TIFY基序形成同源或者異源二聚體。作為TIFY家族中的一個亞家族，JAZ蛋白是茉莉素（JA）信號通路的一個重要的抑制因子［3，4］。在擬南芥中存在12個JAZ蛋白家族成員，它們均含有3個保守區(qū)，分別為NT、TIFY和Jas結(jié)構(gòu)域，其中TIFY結(jié)構(gòu)域包含有ZIM（ZINC-FINGER EXPRESSED IN INFLORESCENCE MERISTEM）結(jié)構(gòu)域［5］。正常生長條件下，植物體內(nèi)具有生物活性的JA（JA-Ile）水平很低，JA介導(dǎo)的應(yīng)答反應(yīng)受JAZ蛋白的抑制，即JAZ蛋白抑制JA下游轉(zhuǎn)錄因子發(fā)揮調(diào)節(jié)作用［6，7］。而當(dāng)植物受到昆蟲咬食或植物腐蝕病原菌感染的脅迫時，植物體內(nèi)JA-Ile的水平升高，通過降解JAZ蛋白釋放被其抑制的轉(zhuǎn)錄因子，進而激活JA應(yīng)答基因的轉(zhuǎn)錄，以發(fā)揮調(diào)控功能［2，6］。

自從JAZ蛋白被報道以來，已對擬南芥、水稻和大豆等物種中的JAZ家族基因開展了較系統(tǒng)和深入的研究。擬南芥JAZ10的過表達植株對茉莉酸不敏感，且可減輕由損傷脅迫引起的生長抑制［8］。水稻OsJAZ10的超表達可以提高水稻對鹽和干旱的耐受性且增加籽粒大小［9］。而野生大豆GsJAZ2在植物的抗逆方面具有一定的功能，如GsJAZ2超表達擬南芥表現(xiàn)出對鹽、堿脅迫的耐受性，且脅迫信號通路相關(guān)基因RD29B、KIN1和DREB等表達上調(diào)［10］。煙草NaJAZd的超表達可抑制花蕾脫落［11］。JAZ蛋白不僅參與植物抗逆，同樣也與抗病相關(guān)［12］。但是，同樣作為十分重要的糧食和經(jīng)濟作物，玉米中的JAZ類基因的研究還鮮有報道。本實驗室以玉米B73自交系為材料，通過基因芯片技術(shù)和生物信息學(xué)方法建立了玉米特異的轉(zhuǎn)錄因子庫，ZmJAZ4基因即選自其中。本研究通過RT-PCR克隆得到ZmJAZ4基因全長序列，分析該基因的氨基酸序列和在玉米不同組織中的表達特性，鑒定ZmJAZ4的亞細胞定位，分析其轉(zhuǎn)錄激活活性，另外通過激素及逆境脅迫誘導(dǎo)分析該基因的調(diào)控機制，旨在為探索玉米中JAZ家族基因的功能以及研究玉米的生長發(fā)育、抗逆等機制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

玉米B73自交系材料種植于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所試驗田。

1.2 方法

1.2.1 玉米ZmJAZ4 基因的克隆 根據(jù)本實驗室轉(zhuǎn)錄因子庫篩選出的ZmJAZ4基因（序列號GRMZM2-G024680），設(shè)計基因全長引物：5'-AAGGATCCATGGCCGCCTCCGGGAACAA-3'和5'-AAGGTTACCTCAGAGCCTGAGCGCGAGCC-3'，提取B73玉米自交系三葉一心時期幼苗總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA后作為模板進行PCR擴增，反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性30 s；95℃變性10 s，56℃退火30 s，72℃延伸45 s，30個循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物連接到pEASYBlunt（北京全式金公司）載體測序，驗證克隆。

1.2.2 ZmJAZ4 氨基酸序列特性分析 通過搜索玉米全基因組數(shù)據(jù)庫（http：//www.gramene.org/和http：//www.maizegdb.org/）對目的基因編碼蛋白等電點和分子量進行分析。使用Clustal W 軟件進行氨基酸序列比對。分子進化樹的構(gòu)建使用MEGA4.1軟件。

1.2.3 ZmJAZ4轉(zhuǎn)錄本表達分析 分別取玉米根、莖、葉、葉鞘、莖尖、雄花，以及授粉后10、15、20和25 d的胚和胚乳，液氮速凍研磨，提取總RNA。激素及逆境脅迫處理：玉米幼苗在蛭石中生長至三葉一心期，將幼苗從蛭石中取出，放于水中平衡2 h后開始逆境與激素處理，并取處理后0、0.5、1、3、6、9和24 h的地上部與地下部；激素處理包括赤霉素（GA，100 μmol/L），水楊酸（SA，100 μmol/L）和脫落酸（ABA，100 μmol/L）。逆境處理方法分為干旱（20% PEG4000）和高鹽（NaCl，250 mmol/L），每個時間點取材分為地上部與地下部，然后液氮速凍研磨，提取總RNA。使用RNAiso Plus（TaKaRa，Japan）提取上述材料總RNA，利用RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit（Thermo Fisher Scientific，USA）進行逆轉(zhuǎn)錄擴增，合成第一鏈cDNA，qRT-PCR 應(yīng)用ABI Prism 7500 system（Applied Biosystems，USA）檢測系統(tǒng)和SYBR Premix Ex Taq（TaKaRa，Japan）試劑盒。ZmJAZ4基因的RT-PCR上下游引物為：5'-CGCTCAGGCTCTGAAACAGTGAAACC-3'和5'-CGACGACAGACACAGTGCCTAAGAAT-3'；以玉米Actin1作為內(nèi)參，其上下游擴增引物為5'-ATGTTTCCTGGGATTGCCGAT-3'和5'-CCAGTTTCGTCATACTCTCCCTTG-3'。

1.2.4 亞細胞定位分析 以克隆得到的ZmJAZ4全長cDNA為模板，應(yīng)用引物5'-CTCGAGATGGCCGCCTCCGGGAACAA-3'和5'-TCTAGAGAGCCTGAGCGCGAGCCACG-3'擴增獲得不含終止密碼子的ZmJAZ4全長ORF，并在其兩端引入Xho I與Xba I內(nèi)切酶位點，經(jīng)上述酶切位點將ZmJAZ4 cDNA連入pRTL2-NGFP載體CaMV35S啟動子和GFP的 cDNA之間，使目的基因與GFP cDNA的N端融合，然后經(jīng)測序驗證［13］。通過PEG介導(dǎo)轉(zhuǎn)化玉米原生質(zhì)體［14］，培養(yǎng)12 h后，在共聚焦顯微鏡下觀察蛋白定位結(jié)果。1.2.5 ZmJAZ4的轉(zhuǎn)錄激活活性分析 通過PCR方法在ZmJAZ4的 cDNA兩端分別引入EcoR I和BamH I酶切位點，經(jīng)上述酶切位點將ZmJAZ4 cDNA 與pGBK-T7（CLONTECH）載體的GAL4 DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域融合，融合載體經(jīng)測序驗證。將上述重組載體和空載體pGAD-T7共轉(zhuǎn)化到酵母AH109菌株中，29℃培養(yǎng)3 d后，挑取SD/-Trp/-His篩選培養(yǎng)基上的酵母單菌落于SD/-Trp/-His液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并將菌液滴于SD/-Leu-Trp/-His-Ade缺陷篩選培養(yǎng)基上驗證是否具有轉(zhuǎn)錄激活活性。

2 結(jié)果

2.1 ZmJAZ4 的克隆和序列分析

本研究擴增的ZmJAZ4基因長度為651 bp（圖1），編碼蛋白含有216個氨基酸，分子量約為23.1 kD，pI為10.78，屬于堿性蛋白。為了研究ZmJAZ4與其他已報道的JAZ類轉(zhuǎn)錄因子間的進化關(guān)系，選擇研究比較深入的擬南芥和水稻JAZ家族蛋白與ZmJAZ4進行了比對分析（圖2）。結(jié)果表明，ZmJAZ4含有JAZ家族基因特有的NT、TIFY和Jas保守結(jié)構(gòu)域（圖2-A），但其氨基端和羧基端的NT和Jas結(jié)構(gòu)域保守性較低。將ZmJAZ4氨基酸序列與擬南芥JAZ家族的12個成員進行了進化樹分析（圖2-B）。結(jié)果表明，ZmJAZ4與AtJAZ10相似性最高。而AtJAZ10的過表達植株對茉莉酸不敏感，且可減輕由損傷脅迫引起的生長抑制，推測ZmJAZ4在植物抗逆方面具有與AtJAZ10相似的功能。

圖1 ZmJAZ4基因的RT-PCR瓊脂糖凝膠電泳

2.2 ZmJAZ4 轉(zhuǎn)錄本的時空表達分布

基因的表達模式分析有助于人們更有效地了解其功能。為了鑒定ZmJAZ4的時空分布特征，以玉米B73自交系的不同組織提取的總RNA進行了熒光定量RT-PCR分析。結(jié)果（圖3）顯示，ZmJAZ4的轉(zhuǎn)錄本在莖端分生組織、雄花和籽粒中有表達，在籽粒中主要于胚乳中表達，而在胚中的表達量較低。此外，ZmJAZ4的表達量隨著籽粒的成熟而逐漸上調(diào)。推測ZmJAZ4可能在雄穗及種子的發(fā)育，尤其是在胚乳的發(fā)育過程起一定的調(diào)控作用。

2.3 ZmJAZ4 蛋白的亞細胞定位分析

轉(zhuǎn)錄因子作為反式作用因子，是通過與靶基因啟動子區(qū)結(jié)合或通過與其他轉(zhuǎn)錄因子互作來調(diào)節(jié)靶基因的表達，因此其若發(fā)揮功能則首先應(yīng)該進入到細胞核。為了探究ZmJAZ4蛋白的亞細胞定位特征，將其編碼序列融合到GFP的5'端（圖4-A），通過PEG介導(dǎo)轉(zhuǎn)化玉米原生質(zhì)體使融合蛋白在玉米原生質(zhì)體中瞬時表達，使用激光共聚焦顯微鏡觀察熒光蛋白的亞細胞定位。結(jié)果（圖4-B）顯示，空載GFP對照蛋白定位于細胞質(zhì)和細胞核；而ZmJAZ4-GFP蛋白融合，只定位于細胞核。此結(jié)果說明ZmJAZ4蛋白定位于細胞核，可能參與調(diào)控下游基因的轉(zhuǎn)錄。

2.4 ZmJAZ4 的轉(zhuǎn)錄活性分析

為了驗證ZmJAZ4是否具有轉(zhuǎn)錄因子的功能，將ZmJAZ4的cDNA與pGBK-T7載體的GAL4 DNA結(jié)合域融合，然后與pGAD-T7載體共轉(zhuǎn)化到酵母AH109菌株中，結(jié)果（圖5）表明ZmJAZ4不具有轉(zhuǎn)錄激活活性。已知ZmJAZ4 蛋白定位于細胞核，因此可以推測ZmJAZ4可能通過與其他轉(zhuǎn)錄因子互作發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子的作用。

2.5 玉米ZmJAZ4 于非生物脅迫下的表達特性分析

采用qRT-PCR方法，以玉米B73自交系為材料分析了ZmJAZ4在GA、SA、ABA、PEG、NaCl和H2O六種處理下的表達特性。結(jié)果（圖6）顯示，在玉米的地上部分，ZmJAZ4主要受到GA、SA、PEG和NaCl四種脅迫誘導(dǎo)表達，其中在GA誘導(dǎo)下表達量最高，即在誘導(dǎo)后1 h增加60多倍。在根中，ZmJAZ4受GA和ABA誘導(dǎo)，且在ABA誘導(dǎo)后1 h表達量達到最高值，增加約30倍。此結(jié)果說明ZmJAZ4受鹽、干旱、GA、SA以及ABA脅迫誘導(dǎo)表達，可能在激素及逆境脅迫信號通路中起一定的調(diào)控作用，且ZmJAZ4在玉米的根和葉中響應(yīng)脅迫的方式有一定的差異。

圖2 ZmJAZ4的氨基酸序列（A）及其進化樹分析（B）

圖3 ZmJAZ4 mRNA的時空表達分布

圖4 ZmJAZ4的亞細胞定位分析

圖5 ZmJAZ4轉(zhuǎn)錄激活活性分析

圖6 不同激素及脅迫處理下ZmJAZ4在B73玉米植株地上部分（A）及根部（B）的表達特性分析

3 討論

JAZ是特異存在于植物中的一類轉(zhuǎn)錄因子家族，屬于TIFY超家族。目前，人們對JAZ蛋白的調(diào)控機制逐步有了深入了解。已有研究結(jié)果表明，JAZ蛋白調(diào)控的信號通路在植物生長發(fā)育以及逆境脅迫方面具有重要的功能，如擬南芥JAZ家族基因可以被多種非生物逆境誘導(dǎo)表達［15］，AtJAZ10在擬南芥中過表達會導(dǎo)致擬南芥對茉莉酸不敏感，并且降低損傷導(dǎo)致的生長抑制［8］。而水稻中的大部分JAZ基因受茉莉酸和非生物脅迫的誘導(dǎo)，且其在水稻中過表達后顯著提高植株對高鹽和干旱的抗性［16］。于大豆中過表達GsJAZ2可以增加植株對鹽堿的敏感性，并可調(diào)控RD29B、DREB、KIN1等基因的表達［10］。有研究表明，蕓苔屬植物中JAZ5a能夠顯著提高抽薹期植物的耐熱性［17］。煙草中過表達NaJAZd和 NaJAZh可以分別抑制花蕾脫落和促進尼古丁的合成［11，18］?？梢钥闯觯琂AZ家族基因雖然在不同物種中所表現(xiàn)出的功能不盡相同，但在植物生長發(fā)育及響應(yīng)逆境脅迫中扮演著十分重要的角色。然而，玉米中的JAZ至今鮮有報道。若能夠?qū)τ衩字蠮AZ家族蛋白進行系統(tǒng)而又深入的研究，將能夠為玉米育種工作提供重要的幫助。ZmJAZ4作為一個轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子，可以受鹽、干旱、GA、SA以及ABA多種脅迫誘導(dǎo)表達，可能在植物的生長發(fā)育及抗逆等方面扮演重要角色。下一步的試驗中，計劃將ZmJAZ4基因在玉米中過量表達和抑制表達，進一步探究其在玉米中發(fā)揮的調(diào)控功能。

4 結(jié)論

本研究利用基因芯片技術(shù)獲得的玉米轉(zhuǎn)錄因子數(shù)據(jù)庫，結(jié)合RT-PCR技術(shù)，獲得ZmJAZ4基因的cDNA序列。序列分析發(fā)現(xiàn)ZmJAZ4具有JAZ家族的保守結(jié)構(gòu)域，利用進化樹分析發(fā)現(xiàn)ZmJAZ4與擬南芥中的AtJAZ10相似性最高。利用qRT-PCR對其在不同組織及發(fā)育階段的表達特征進行分析，結(jié)果顯示ZmJAZ4在莖端分生組織、雄花和籽粒中有表達，而籽粒中主要于胚乳表達，且其表達量隨著籽粒的成熟而上調(diào)。ZmJAZ4定位于細胞核，為不具有轉(zhuǎn)錄激活活性的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子。非生物脅迫處理結(jié)果表明ZmJAZ4受鹽、干旱、GA、SA以及ABA脅迫誘導(dǎo)表達，且在玉米的根和葉中相應(yīng)脅迫的表達模式有一定的差異。結(jié)果表明，ZmJAZ4編碼的蛋白在細胞核中可能作為一個轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，在激素及逆境脅迫信號通路中發(fā)揮一定的調(diào)控作用。

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（責(zé)任編輯 馬鑫）

Cloning and Characterization Analysis of ZmJAZ4，a JAZ Family Gene in Maize（Zea mays L.）

Yan Shengwei Sun Cheng Zhou Xiaojin Chen Rumei
（Biotechnology Research Institute，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100081）

Jasmonate ZIM-domain（JAZ）proteins are a group of plant-specific transcription factors， which have important function in plant growing development and abiotic stress by inhibiting the expression of genes associated with JA regulation. In this study， a novel JAZ family gene， named ZmJAZ4， was isolated from maize（Zea mays L.）inbred lines B73. The ZmJAZ4 cDNA has a total length of 651 bp and encodes a protein of 216 amino acids with a molecular weight of about 23.1 kD and a isoelectric points of 10.78， belonging to the basic protein. Real-time RT-PCR showed that ZmJAZ4 was mainly expressed in shoot apex meristem， tassel， developing seeds and endosperm. Phylogenetic analysis revealed that ZmJAZ4 was related to AtJAZ10 from Arabidopsis. Subcellular localization experiment showed that ZmJAZ4 was localized to the nucleus. ZmJAZ4 possessed no transcriptional activating activity in yeast cells. Various treatments were performed to detect the expression level of ZmJAZ4 in response to phytohormones or abiotic stresses. The transcripts of ZmJAZ4 was induced by PEG， NaCl， SA， GA and ABA treatment in shoots and that was induced by ABA and GA in roots. The above results showed that ZmJAZ4 may be an important transcriptional regulator，which participates in many hormones signaling pathways and abiotic stress.

Jasmonate；Zea mays Jasmonate ZIM-domain gene；Abiotic stress

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.04.013

2014-10-13

國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃“863”項目（2012AA10A306），國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃“973”項目（2014CB138200），轉(zhuǎn)基因?qū)ｍ棧?008ZX08003-002）

晏勝偉，男，碩士研究生，研究方向：植物分子生物學(xué)與基因工程；E-mail：zhongdayan109@163.com

陳茹梅，女，研究員，研究方向：植物分子生物學(xué)與基因工程；E-mail：chenrumei@caas.cn