利用基因工程技術(shù)提高微藻油脂含量的研究進(jìn)展

李逸 王潮崗 胡章立

（深圳大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 深圳市海洋生物資源與生態(tài)環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，深圳 518060）

利用基因工程技術(shù)提高微藻油脂含量的研究進(jìn)展

李逸 王潮崗 胡章立

（深圳大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 深圳市海洋生物資源與生態(tài)環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，深圳 518060）

利用微藻油脂制備生物柴油因具有重要的戰(zhàn)略意義而受到世界各國(guó)的重視，成為近年來(lái)的研究熱點(diǎn)。利用微藻制備生物柴油具有生長(zhǎng)周期短、易于大規(guī)模培養(yǎng)、能大量吸收CO2及不占用耕地等優(yōu)點(diǎn)。但是，由于對(duì)藻類(lèi)油脂合成代謝中的調(diào)節(jié)機(jī)制了解不多，導(dǎo)致微藻基因組研究相對(duì)滯后，極大地限制了微藻生物能源的大規(guī)模開(kāi)發(fā)和利用。隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展，通過(guò)基因工程、代謝工程等方法調(diào)控微藻脂類(lèi)的合成代謝，提高藻類(lèi)含油量和生物量已成為可能。概述了微藻中油脂的合成代謝，歸納總結(jié)利用基因工程技術(shù)提高微藻油脂含量的研究進(jìn)展，為獲得含油量高的工程微藻及微藻制備生物柴油提供技術(shù)儲(chǔ)備。

微藻；基因工程；生物柴油；油脂

隨著經(jīng)濟(jì)全球化和人口總量的急劇擴(kuò)增，極大增加了人們對(duì)工業(yè)生產(chǎn)和能源的需求。從21世紀(jì)起，能源已是影響人類(lèi)文明進(jìn)步的重要因素。據(jù)報(bào)道，2050年全球能源需求將會(huì)翻一番，目前，全球大約80% 的能源來(lái)自化石燃料，包括石油、天然氣等。它們作為一種不可再生能源，全球儲(chǔ)量越用越少，已經(jīng)成為影響地區(qū)穩(wěn)定、經(jīng)濟(jì)發(fā)展的主要原因。與此同時(shí)，化石燃料的大量使用還引起了氣候變暖、環(huán)境污染等一系列問(wèn)題。當(dāng)今社會(huì)進(jìn)入新經(jīng)濟(jì)時(shí)代，發(fā)展低碳經(jīng)濟(jì)，使用可再生、低污染的新型可替代能源已經(jīng)成為當(dāng)務(wù)之急。現(xiàn)在，生物柴油已被各國(guó)認(rèn)為是理想的可再生能源，其主要成分脂肪酸甲酯（fatty acid methyl ester，F(xiàn)AME）是以可再生資源為原料通過(guò)酯交換制備而成，具備與石化柴油相近的性能。其優(yōu)勢(shì)如下：是一種可持續(xù)供應(yīng)的可再生資源；具有高度生物降解性，毒性小；基本不會(huì)增加環(huán)境污染物的排放；有較高的氧含量，比從石油中提煉出的柴油有更大的燃燒值；能逐步緩解對(duì)進(jìn)口資源的依賴(lài)性；生物柴油來(lái)源于植物的光合作用，可以緩解生物柴油燃燒所生成的CO2，所以無(wú)論是生產(chǎn)還是使用生物柴油都可以有效的減少溫室效應(yīng)［1，2］。

生物柴油的發(fā)展歷程主要分為3個(gè)階段：第一代生物柴油的原料主要是油菜、大豆、棕櫚油和向日葵。第二代生物柴油的原料主要是麻風(fēng)樹(shù)、麻花、煙草種子、三文魚(yú)油、廢烹調(diào)油、餐廳油脂和動(dòng)物脂肪等。第三代生物柴油的原料主要是微藻。第一代和第二代原料因?yàn)榇嬖谂c人爭(zhēng)地、來(lái)源有限、原料的效率低和可持續(xù)性差等問(wèn)題，無(wú)法滿(mǎn)足人們的需求，逐漸被第三代原料的微藻所取代［3］。利用微藻生產(chǎn)生物燃料的概念早在50多年前就已提出，它具有其他綠色油脂植物所不具備的優(yōu)點(diǎn)：生長(zhǎng)周期短、繁殖速度快、易于大規(guī)模培養(yǎng)、能大量吸收CO2、不占用耕地、單位生物量微藻產(chǎn)油量高于一般油料作物等［2，3］。據(jù)國(guó)內(nèi)外報(bào)道，油脂含量較高的微藻主要集中在綠藻、金藻和硅藻等真核微藻中，常見(jiàn)的高產(chǎn)油微藻有綠藻中的葡萄藻、小球藻和杜氏鹽藻；硅藻中的三角褐指藻等［2］。這些微藻可以?xún)?chǔ)存大量的高能化合物，如三酰甘油和淀粉，這些化合物可直接用于生產(chǎn)生物柴油和酒精等生物燃料［1，3，4］。

利用微藻中的油脂生產(chǎn)生物柴油因?yàn)榫哂兄匾膽?zhàn)略意義而受到世界各國(guó)的關(guān)注，成為近年來(lái)的研究熱點(diǎn)。然而，應(yīng)用微藻制備生物柴油存在以下兩方面的問(wèn)題：獲得油脂含量高的工程藻株以及降低后續(xù)生產(chǎn)成本，這是微藻制備生物燃料能否工業(yè)化生產(chǎn)的關(guān)鍵，特別是獲得油脂含量高的基因工程藻株，對(duì)微藻制備生物燃料的下游生產(chǎn)工藝具有巨大的影響［5-7］。在本篇綜述中，我們將重點(diǎn)闡述通過(guò)基因工程構(gòu)建高產(chǎn)油藻的途徑，歸納總結(jié)近年來(lái)微藻產(chǎn)油的研究進(jìn)展，為獲得含油量高的工程微藻及微藻制備生物燃料提供技術(shù)儲(chǔ)備［8］。

1 微藻油脂合成路徑的探究

人們對(duì)于植物脂肪酸的代謝路徑了解較多，如擬南芥、油菜等，其產(chǎn)油路徑已有報(bào)道。但是，對(duì)于藻類(lèi)的脂肪酸代謝路徑了解還不夠準(zhǔn)確。圖1是根據(jù)植物脂肪酸合成路徑及近年來(lái)的研究推導(dǎo)出的藻類(lèi)脂肪酸合成路徑圖。

圖1 微藻脂代謝路徑圖

微藻中油脂的合成路徑主要分為兩個(gè)部分，包括自由脂肪酸的合成和三酰甘油的合成（即Kennedy路徑），兩個(gè)路徑分別發(fā)生在質(zhì)體和細(xì)胞質(zhì)中，其中的質(zhì)體為葉綠體，在葉綠體中生成自由脂肪酸后，被轉(zhuǎn)運(yùn)到質(zhì)體外進(jìn)行三酰甘油（triacylglycerol，TAG）的組裝合成。藻細(xì)胞中的糖酵解路徑為脂肪酸合成提供原材料乙酰輔酶A（Acetyl-CoA），乙酰輔酶A在乙酰輔酶A羧化酶（Acetyl-CoA carboxylase，ACCase）的催化下生成丙二酸單酰輔酶A（Malonyl-CoA），這步反應(yīng)是不可逆的，是脂肪酸合成的關(guān)鍵步驟。經(jīng)脂肪酸合酶的催化生成自由脂肪酸，并從質(zhì)體中進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上開(kāi)始三酰甘油的組裝。Kennedy路徑主要是由3種酰基轉(zhuǎn)移酶包括甘油3-磷酸?；D(zhuǎn)移酶（glycerol-3-phosphate acyltransferase，GPAT）、溶血磷脂酸?；D(zhuǎn)移酶（lysophosphatidic acid acyltransferase，LPAAT）和二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶（diacylglycerol acyltransferase，DAGAT）起作用，最終合成TAG。

2 三酰甘油合成路徑的改造

對(duì)于微藻基因組的研究在近幾十年已有很大進(jìn)步，建立了表達(dá)序列標(biāo)簽（EST）數(shù)據(jù)庫(kù)，一些微藻的核、線(xiàn)粒體和葉綠體基因組也已經(jīng)測(cè)序完畢。目前總基因組測(cè)序完畢的有萊茵衣藻（Chlamydomo-nas reinhardtii）、三角褐指藻（Phaeodactylum tricornutum）、假微型海鏈藻（Thalassiosira pseudonana）、紅藻（Cyanidioschyzon merolae）及綠色鞭毛藻（Ostreococcus lucimarinus）等［9，10］。

2.1 微藻中CO2的固定

在工業(yè)化培養(yǎng)的光生物反應(yīng)器和農(nóng)業(yè)化培養(yǎng)的開(kāi)放池中培養(yǎng)藻時(shí)，提高太陽(yáng)能利用率很重要，不僅在微藻中，在現(xiàn)代化農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，如何提高農(nóng)作物光合效率也成為研究重點(diǎn)［11，12］。改造的關(guān)鍵在于葉綠體，大多數(shù)葉綠體的基因組可以進(jìn)行高效同源重組，微藻葉綠體轉(zhuǎn)化技術(shù)也相對(duì)成熟，如基因槍的應(yīng)用和篩選標(biāo)記的開(kāi)發(fā)。通過(guò)基因工程方法改造微藻葉綠體基因，提高其光合效率，可以促進(jìn)微藻對(duì)環(huán)境中二氧化碳的利用。研究發(fā)現(xiàn)，利用基因工程將萊茵衣藻中的葉綠體基因組導(dǎo)入酵母細(xì)胞中，實(shí)現(xiàn)了二氧化碳固定效率和光合效率的提高［13］。

二磷酸核酮糖羧化酶（RuBisCO）是一種初級(jí)二氧化碳固定酶，屬于光合作用C3路徑中的重要羧化酶。微藻細(xì)胞在進(jìn)行光合作用時(shí)，利用核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶（Ribulose-1，5-bisphosphate carboxylase/oxygenase，RuBisCO）將CO2催化生成3-磷酸-甘油酸。盡管研究人員已經(jīng)通過(guò)不同的試驗(yàn)在植物和藻類(lèi)中證明了RuBisCO的功能，且它在所有的光合有機(jī)體中含量最多，但它的效率是最低的［14］。對(duì)RuBisCO進(jìn)行改造可以提高其固碳率，增加光合效率，從而增加微藻的產(chǎn)量。近年來(lái)一些文獻(xiàn)報(bào)道，RuBisCO在促進(jìn)脂肪酸合成的同時(shí)也發(fā)揮一定的作用。研究發(fā)現(xiàn)，在油菜種子中RuBisCO的活性與油脂的形成有關(guān)，同時(shí)可以促進(jìn)種子中乙酰輔酶A的含量提升。由此推測(cè)，RuBisCO活性的增加可以使更多的碳源流向后續(xù)反應(yīng)，從而影響油脂的代謝，微藻中RuBisCO的研究并沒(méi)有太多報(bào)道，還需要更多的研究去證實(shí)［1，9］。

與固碳作用有關(guān)的另外一種酶是碳酸酐酶（carbonic anhydrase，CA）。在微藻中，碳酸酐酶可以催化CO2和HCO3-之間的轉(zhuǎn)換［15］。碳酸酐酶分為α型、β型和γ型3種，已經(jīng)在藍(lán)細(xì)菌（Cyanobacteria）中發(fā)現(xiàn)了類(lèi)似CA功能的蛋白，萊茵衣藻（Chlamydomonas rerhardtii）中存在的是α型和β型，涉及到的基因有12個(gè)。Sinetova等［16］在2012年發(fā)現(xiàn)，萊茵衣藻的CA缺陷株與野生型相比，在二氧化碳濃度增加的條件下，細(xì)胞膜上多不飽和脂肪酸含量增加幅度較小，因此推測(cè)碳酸酐酶與微藻的產(chǎn)油量存在一定關(guān)系。

2.2 自由脂肪酸合成路徑的改造

最早關(guān)于微藻脂肪酸合成相關(guān)酶的研究是乙酰輔酶A羧化酶（ACCase），它是脂肪酸合成過(guò)程中的關(guān)鍵酶，負(fù)責(zé)催化脂肪酸合成的第一步反應(yīng)，將乙酰輔酶A催化成丙酮酸輔酶A。ACCase分為2類(lèi)，即異質(zhì)型和同質(zhì)型［17-19］。

在酵母和其他高等真核生物中ACCase的活性和表達(dá)量與脂肪酸含量有密切關(guān)系，Shi等［20］發(fā)現(xiàn)在釀酒酵母（S. cerevisiae）中過(guò)量表達(dá)改造后酶活性提高的ACCase時(shí)，釀酒酵母油脂含量最多增加65%。大腸桿菌中（Escherichia coli）中ACCase的過(guò)量表達(dá)使得總脂含量增加為原來(lái)的6倍［21］。但是，通過(guò)增加ACCase的表達(dá)量促進(jìn)脂肪酸合成在微藻中并不成功。Dunahay等［22］增加硅藻（C. cryptica和N. saprophila）中ACCase的表達(dá)量，盡管ACCase的表達(dá)量增加2-3倍，但脂肪酸含量無(wú)明顯增加。在隱秘小環(huán)藻（Cyclotella cryptica）、舟形藻（Navicula saprophila）中過(guò)量表達(dá)ACCase均未導(dǎo)致脂類(lèi)含量明顯增加。存在的原因可能有兩個(gè)，一是ACCase酶結(jié)構(gòu)復(fù)雜，堿基數(shù)多，對(duì)其改造難度較大；二是ACCase雖然是限速酶，但與終產(chǎn)物三酰甘油的距離較遠(yuǎn)，加上微藻中還存在反饋抑制的調(diào)控，這大大減弱了ACCase的作用。

脂肪酸合酶（fatty acid synthase，F(xiàn)AS）是一個(gè)多亞基多酶復(fù)合體，脂肪酸合酶以丙二酰輔酶A為底物，每進(jìn)行一個(gè)循環(huán)增加2個(gè)碳原子，最后形成16碳的軟脂酰-ACP和18碳的硬脂酰-ACP，再形成二十二碳六烯酸（docosahexaenois，DHA）和花生四烯酸（arachidonic acid，ARA）等長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸［1，23］，很多藻的FAS已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)。FAS作為一個(gè)多酶復(fù)合體，它的底物通常有多個(gè)酶結(jié)合位點(diǎn)，產(chǎn)物的合成由多個(gè)酶調(diào)節(jié)。因此，單一的改變其中一種酶活性，只能改變某一種油脂成分的含量，對(duì)脂肪酸總量的影響不大。2001年，Dehesh等［23］克隆了菠菜中3-酮脂酰-酰基載體蛋白合成酶III（KASIII）的cDNA序列，分別在煙草細(xì)胞、橄欖型油菜和擬南芥中進(jìn)行過(guò)表達(dá)，結(jié)果增加了這3種植物中飽和脂肪酸（16∶0）的含量，總脂的合成率沒(méi)有明顯提高。以上研究說(shuō)明，F(xiàn)AS多亞基、多調(diào)控機(jī)制的特性導(dǎo)致人們不能通過(guò)單一的酶基因改變來(lái)提高總的脂肪酸含量（表1）。

表1 部分基因在提高脂肪酸含量中的應(yīng)用

2.3 TAG組裝路徑（Kennedy路徑）的改造

TAG路徑是指三酰甘油的形成路徑，脂肪酸在質(zhì)體中形成后，被運(yùn)送到細(xì)胞質(zhì)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上，與甘油進(jìn)行組裝，主要包括：3-磷酸甘油脫氫酶（glycerol-3-phosphate dehydrogenase，G3PDH）、甘油-3-磷酸?；D(zhuǎn)移酶（glycerol-3-phosphate acyltransferase，GPAT）、溶血磷脂酸酰基轉(zhuǎn)移酶和二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶［24］。在脅迫條件下，TAG合成量的顯著增加就是與4種酶有密切的關(guān)系，它們是合成TAG的關(guān)鍵酶。目前，關(guān)于這些酶的研究主要集中在擬南芥、油菜等高等植物，在大腸桿菌、酵母和微藻中也有少量研究［25］。在不同的物種中?；D(zhuǎn)移酶的存在形式是不同的。如圖2，為三酰甘油主要合成過(guò)程。

2.3.1 甘油-3-磷酸脫氫酶（G3PDH，EC1.1.1.8）

G3PDH負(fù)責(zé)將磷酸二羥基丙酮（dihydroxyacetoneph-osphate，DHAP）催化形成甘油-3-磷酸（glycerol-3-phosphate，G-3-P），反應(yīng)公式如圖2所示，該反應(yīng)是甘油代謝途徑中的限速步驟，在還原態(tài)煙酰胺腺嘌呤二核苷酸 NADH的參與下催化DHAP生成3-磷酸甘油，它決定了甘油合成量的多少［26］。這步反應(yīng)嚴(yán)格說(shuō)雖不算Kennedy途徑，但為Kennedy路徑提供前體物質(zhì)，決定了目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)量。

在哺乳動(dòng)物中，G3PDH與脂肪酸含量的關(guān)系研究較多，早在1979年就已經(jīng)確定，在小鼠的3T3細(xì)胞脂肪轉(zhuǎn)換時(shí)，G3PDH可以作為晚期分化的重要標(biāo)志［27］。2014年，Kim等［28］發(fā)現(xiàn)用藥物處理小鼠的前脂肪細(xì)胞時(shí)，前脂肪細(xì)胞的分化被抑制，同時(shí)G3PDH的酶活被抑制。與之相似，Yi等［29］發(fā)現(xiàn)用脂肪酸結(jié)合蛋白3（H-FABP，F(xiàn)ABP3）刺激小鼠脂肪細(xì)胞，三酰甘油總量提高的同時(shí)，g3pdh基因的表達(dá)量明顯升高，這說(shuō)明哺乳動(dòng)物中G3PDH的酶活與脂肪細(xì)胞密切相關(guān)。

圖2 TAG合成公式

G3PDH在植物和藻類(lèi)中的研究報(bào)道較少。Vigeolas等［30］將一種胞質(zhì)酵母的甘油-3-磷酸脫氫酶基因gpd1轉(zhuǎn)化到油菜種子中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)油菜種子中的含油量增加了40%，因?yàn)槲⒃逯信c脂代謝相關(guān)的大部分基因序列與陸生植物的同源性較高。由此推測(cè)，G3PDH的過(guò)表達(dá)或酶活性提高對(duì)微藻的油脂量變化有影響，目前本實(shí)驗(yàn)室已根據(jù)萊茵衣藻密碼子偏好性合成該基因，并轉(zhuǎn)入了萊茵衣藻中進(jìn)行功能分析，獲得了一些有意義的結(jié)果。

2.3.2 甘油-3-磷酸酰基轉(zhuǎn)移酶（GPAT，EC 2.3.1.15）

GPAT是Kennedy路徑的第一個(gè)酰基轉(zhuǎn)移酶，負(fù)責(zé)催化脂肪酰基轉(zhuǎn)移到3-磷酸甘油的sn-1位上，生成1-?；?3-磷酸甘油。目前，多種高等植物和藻類(lèi)的GPAT基因序列已經(jīng)分離出來(lái)。Jain等［32］在研究萊茵衣藻膜脂代謝時(shí)發(fā)現(xiàn)，在光刺激條件下，萊茵衣藻膜脂代謝增加的同時(shí)，GPAT的酶活性提高至少10倍。由此推測(cè)微藻中脂產(chǎn)量與GPAT的活性有密切關(guān)系。通過(guò)分子生物學(xué)手段將大腸桿菌和紅花（safflower）的GPAT基因轉(zhuǎn)移到擬南芥中，可以增加種子的含油量和重量，使得擬南芥油脂含量分別提高了15%和22%。Misra等［31］對(duì)7種藻類(lèi)和3種高等植物質(zhì)體中的GPAT進(jìn)行了序列結(jié)構(gòu)分析，研究GPAT的進(jìn)化過(guò)程發(fā)現(xiàn)，萊茵衣藻、擬南芥和大豆的GPAT序列雖然不同，但都有保守的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)14α螺旋和9β折疊。這些研究為利用gpat構(gòu)建基因工程藻提供了重要依據(jù)。

2.3.3 溶血磷脂酸酰基轉(zhuǎn)移酶（LPAAT，EC 2.3.1.51）

LPAAT負(fù)責(zé)催化脂酰-CoA上的脂肪酸?；D(zhuǎn)移到溶血磷脂酸的sn-2位，生成磷脂酸（PA）。對(duì)高等植物中的研究主要集中在花生、擬南芥和油菜中，它提高產(chǎn)油量的效果顯著。將一個(gè)酵母的sn-2?；D(zhuǎn)移酶（SLC1-1）轉(zhuǎn)入到基因缺陷型的酵母中，證明該基因編碼的酶可以催化sn-1位溶血磷脂酸，轉(zhuǎn)入擬南芥后，它能使種子中的油脂含量提高8%-48%不等，其中超長(zhǎng)鏈脂肪酸所占比例明顯增多［33］。Knutzon等［34］將來(lái)自椰子中的lpaat基因和福尼亞月桂樹(shù)中的硫酯酶基因共同轉(zhuǎn)入油菜中，使得月桂酸產(chǎn)量提高，除了出現(xiàn)在固定位置sn-1和sn-3積累外，在sn-2位上也有積累，菜籽油中的月桂酸含量增加了50%。

研究發(fā)現(xiàn)，萊茵衣藻在脅迫條件下脂肪酸含量增加時(shí)，lpaat等基因的表達(dá)量也相應(yīng)升高，利用基因敲除技術(shù)減少lpaat表達(dá)量后，中性脂含量降低了20%［35］，由此推測(cè)，調(diào)節(jié)lpaat基因的表達(dá)量或者增加LPAAT酶的活性可以增加藻類(lèi)脂肪酸含量。最近的研究表明，LPAAT酶等作用下生成的磷脂對(duì)人類(lèi)疾病，如Chanarin-Dorfman綜合征、癌癥、過(guò)渡肥胖和二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid，DHA，22∶6）的產(chǎn)量等均有影響［36，37］。

2.3.4 甘油二酯酰基轉(zhuǎn)移酶（DGAT，EC 2.3.1.20）

甘油二酯?；D(zhuǎn)移酶（diacylglycerol acyltransferase，DGAT）是三酰甘油合成的最后一個(gè)酶，催化二酰甘油（DAG）生成三酰甘油，同時(shí)也可以催化磷脂酸生成二酰甘油，使其進(jìn)入油脂生物合成路徑，是TAG合成反應(yīng)的重要限速酶。DGAT主要分為4種類(lèi)型：DGAT1、DGAT2、Cyto DGAT和WS/DGAT。DGAT1和DGAT2蛋白主要結(jié)合在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上，是微粒體酶；Cyto DGAT和WS/DGAT是近年發(fā)現(xiàn)的新類(lèi)型。

DGAT的過(guò)表達(dá)已經(jīng)在酵母、哺乳動(dòng)物、植物和昆蟲(chóng)中實(shí)現(xiàn)［38-40］，證實(shí)對(duì)于脂肪酸含量都有影響。最早關(guān)于DGAT影響產(chǎn)油量的報(bào)道是在2001年，Jako等［41］將DGAT的cDNA導(dǎo)入野生型擬南芥中進(jìn)行過(guò)量表達(dá)，結(jié)果DGAT的活性增加了10%-70%，種子含油量也有所增加。將擬南芥的dgat基因分別在酵母和煙草中進(jìn)行過(guò)量表達(dá)，使得酵母中DGAT活性增加了200-600倍，TAG含量提高為原來(lái)的3-9倍，煙草中TAG含量提高7倍。Zhang等［2］用特異性hpRNA沉默煙草中的DGAT1基因，煙草種子的含油量下降了9%-49%。過(guò)量表達(dá)DGAT使得脂肪酸含量顯著提高，這可能是因?yàn)镈GAT催化兩條相關(guān)代謝步驟，使得更多的二酰甘油生成TAG。

萊茵衣藻因其培養(yǎng)簡(jiǎn)單、背景清晰、轉(zhuǎn)化技術(shù)成熟成為微藻研究領(lǐng)域的模式生物，也是研究脂肪酸合成代謝最好的試驗(yàn)材料。Lv等［35］在對(duì)萊茵衣藻積累脂肪酸時(shí)的轉(zhuǎn)錄進(jìn)行分析時(shí)發(fā)現(xiàn)，超過(guò)2 500種基因的上調(diào)，lpaat和dgat被抑制后，脂肪酸產(chǎn)量下降。本實(shí)驗(yàn)室目前將經(jīng)過(guò)密碼子優(yōu)化的lpaat和gpd1基因轉(zhuǎn)入萊茵衣藻中，研究其基因表達(dá)量和脂肪酸含量提高程度，取得了較好的研究結(jié)果，為獲得油脂含量高的基因工程藻提供了新思路。

3 旁路代謝路徑的調(diào)控

旁路代謝路徑是指除脂肪酸代謝路徑之外的其他代謝路徑，如三羧酸循環(huán)等。這些路徑分擔(dān)了部分碳流，使得流向脂肪酸合成的碳源變少，所以對(duì)于這些代謝路徑中關(guān)鍵酶的調(diào)節(jié)通常會(huì)影響到脂肪酸的含量。

3.1 磷酸烯醇丙酮酸羧化酶（PEPC，EC4.1.1.31）

磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（phosphoenolpyruvate carboxylase，PEPC）是一種在有機(jī)體中廣泛存在的細(xì)胞質(zhì)酶，主要存在于古細(xì)菌、細(xì)菌、單細(xì)胞綠藻和維管束植物等有機(jī)體中［42］。在C4植物和景天酸代謝（crassulacean acid metabolism，CAM）植物中，PEPC在CO2固定過(guò)程中起到重要作用；在C3植物和非光合組織中，PEPC在檸檬酸反應(yīng)中催化不可逆反應(yīng)，使得磷酸烯醇式丙酮酸鹽（PEP）生成草酰乙酸鹽（OAA）。所以，PEPC是碳源是否流向脂肪酸合成鏈的關(guān)鍵酶。

在對(duì)磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的研究中，可以利用RNA沉默技術(shù)抑制pepc的表達(dá)。1999年Chen等［3］發(fā)現(xiàn)，油菜籽中的pepc沉默后，其產(chǎn)油量提高了6.4%-18%，表明脂肪酸含量與PEPC酶活性為負(fù)相關(guān)，同樣的研究結(jié)果也出現(xiàn)在微藻中。在萊茵衣藻和三角褐指藻中，利用RNAi技術(shù)使pepc1和pepc2基因沉默后，萊茵衣藻（C. reinhardtii）的油脂含量分別提高了14%-28%和20%［43］。另外，通過(guò)抑制PEPC酶活性，同樣可以顯著提高微藻（如綠藻，硅藻等）的脂含量［44，45］。

3.2 檸檬酸合成酶（CIS，E.C. 2.3.3.1）

檸檬酸合成酶是三羧酸反應(yīng)循環(huán)的第一步，有多種同工酶，存在各種亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)中，在多種生理代謝路徑中起作用，位于線(xiàn)粒體中的檸檬酸合成酶在三羧酸循環(huán)中起到限制性酶的作用，負(fù)責(zé)將乙酰輔酶A催化成檸檬酸。

在對(duì)植物和動(dòng)物的研究中發(fā)現(xiàn)，檸檬酸合成酶的作用主要集中在如下3方面：（1）該基因的過(guò)表達(dá)可以促進(jìn)農(nóng)作物分泌檸檬酸，促進(jìn)磷在土壤中的溶解，增加土壤中磷的利用率［46，47］；（2）增加細(xì)胞對(duì)鋁毒素的抵抗作用［48］；（3）CIS基因的表達(dá)與水果成熟過(guò)程中有機(jī)酸的積累有關(guān)。Zhang等［49，50］發(fā)現(xiàn)，在松子果成熟期間，檸檬酸含量與CIS的活性有關(guān)。

早在1973年，Taylor等［51］研究了4種藍(lán)藻的CIS活性發(fā)現(xiàn)，在脅迫條件下更多的碳原子進(jìn)行脂肪酸合成時(shí)，CIS活性下降。Deng等［52］最近研究了萊茵衣藻中的CrCIS與脂肪酸含量的關(guān)系，利用RNAi抑制CrCIS的活性，使得萊茵衣藻中的TAG含量增加了169.5%，結(jié)果表明萊茵衣藻中檸檬酸合成酶的活性可以影響脂肪酸的積累代謝。

近年來(lái)，RNA干擾技術(shù)逐漸被microRNA技術(shù)所代替，microRNA是一類(lèi)長(zhǎng)度很短的非編碼調(diào)控單鏈小分子RNA，由一段具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的長(zhǎng)度為70-80 nt的單鏈RNA前體經(jīng)過(guò)Dicer加工之后的一類(lèi)非編碼的小RNA分子（約21-23個(gè)核苷酸），在動(dòng)物和植物中廣泛表達(dá)，是一類(lèi)新型的調(diào)控基因表達(dá)的小分子RNA，它作為基因表達(dá)的負(fù)調(diào)控因子，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)。因此，利用microRNA技術(shù)調(diào)控的專(zhuān)一性更強(qiáng)，表達(dá)也更穩(wěn)定，可控性更好［45，53］。

4 脂肪酸分解代謝路徑

脂肪酸和TAG合成相關(guān)基因的激活或者脂肪酸β-氧化酶對(duì)應(yīng)基因的失活，都可以增加脂肪酸產(chǎn)量。在提高微藻脂肪酸產(chǎn)量的策略中，減少脂肪酸的分解代謝也是重要的方法之一。脂肪酸的分解代謝路徑主要是β-氧化，具體的脂肪酸分解路徑，如圖3，它存在于真核生物的線(xiàn)粒體基質(zhì)和原核生物的細(xì)胞溶膠中，現(xiàn)階段該方法多在高等植物和酵母中實(shí)驗(yàn)成功。

圖3 脂肪酸分解代謝路徑圖

在一些情況下，細(xì)胞依靠脂肪酸β氧化提供能量，敲除脂肪酸分解代謝對(duì)應(yīng)基因后，在增加脂肪酸儲(chǔ)存量的同時(shí)也會(huì)影響細(xì)胞的生長(zhǎng)和增值。例如，在擬南芥中，將過(guò)氧化物酶長(zhǎng)鏈乙酰輔酶A合成酶抑制后，同工酶LACS6和LACS7失活，雖然種子的油脂含量增加了，但是種子由于碳源的缺失使得生長(zhǎng)速度受到抑制［17］。Germain等［18］還將3-酮脂酰-CoA硫解酶（KAT2）失活，結(jié)果也是相同的。

脂肪酸氧化有多個(gè)酶共同參與，完全抑制這個(gè)過(guò)程的難度較大。擬南芥中含有短鏈乙酰輔酶A氧化酶，包括ACX3和ACX4，如果只是突變其中一個(gè)基因，擬南芥種子的生長(zhǎng)和脂肪酸的代謝并未受到影響，如果兩個(gè)基因同時(shí)突變會(huì)導(dǎo)致擬南芥死亡［19］。通過(guò)基因工程技術(shù)敲除釀酒酵母（S. cerevisiae）中的β氧化酶基因，不僅使得內(nèi)源性脂肪酸含量增加，還可以促進(jìn)脂肪酸的胞外分泌［14，54，55］。

5 誘發(fā)突變

突變?cè)谧匀唤缰袕V泛存在，實(shí)驗(yàn)中用到的多為誘發(fā)突變，即人為條件下誘發(fā)產(chǎn)生的基因突變。通過(guò)基因突變改造微藻，使其產(chǎn)油量提高，也是一種可行性較高的方法。誘發(fā)突變的方法常用的有紫外誘變、抗性基因插入等，這些方法適用范圍廣，且便于操作。還可以通過(guò)抑制其他化合物代謝路徑（如淀粉合成路徑）來(lái)增加脂肪酸合成。研究顯示，利用插入突變得到萊茵衣藻的兩個(gè)淀粉合成缺陷株sta6和sta7，發(fā)現(xiàn)其ADP-葡糖焦磷酸化酶基因異淀粉酶基因功能受損［1］。2006年，Ramazanov等［56］通過(guò)紫外誘變獲得小球藻（Chlorella pyrenoidosa）的淀粉突變株，它的不飽和脂肪酸含量有所提高。2013年，劉飛飛等［57］將博來(lái)霉素抗性基因ble隨機(jī)插入三角褐指藻基因組中，構(gòu)建突變體文庫(kù)，篩選得到含油量顯著變化的突變株。但是，利用誘發(fā)突變篩選突變株的不確定性高，目的性不強(qiáng)，篩選工作量大。

6 分泌型藻株

利用微藻制備生物柴油需要通過(guò)大規(guī)模的培養(yǎng)獲得足夠多的微藻來(lái)提取油脂，微藻由于體積微小導(dǎo)致后續(xù)收集成本較高，除了步驟繁瑣，花費(fèi)也比較大。例如，利用靜置沉淀或者絮凝沉淀等收集藻細(xì)胞可以節(jié)約成本，但存在耗時(shí)長(zhǎng)、需要進(jìn)一步脫水處理等問(wèn)題。目前可替代的方法是離心法和過(guò)濾法，其優(yōu)點(diǎn)是耗時(shí)短，但成本較高。大多數(shù)產(chǎn)油微藻有堅(jiān)硬的細(xì)胞壁，這使得提取油脂難度加大。有一種解決方法是改造微藻細(xì)胞，使其將油脂自動(dòng)分泌到培養(yǎng)液中，通過(guò)油水分離可以獲得藻細(xì)胞中合成的油脂。

6.1 酵母中自由脂肪酸的分泌

如上所述，在脂代謝中，β-氧化酶基因的失活在某些情況下會(huì)導(dǎo)致脂肪酸分泌，通過(guò)對(duì)缺陷型酵母的研究，確定了這些基因在脂肪酸分泌中有重要作用［14，54］。釀酒酵母（S. cerevisiae）中有5種基因與脂肪酸乙酰輔酶A合成酶活性有關(guān)，包括編碼FAA1和FAA4的基因。FAA1和FAA4同時(shí)失活或者FAA1和乙酰輔酶A氧化酶同時(shí)失活都會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)自由脂肪酸的累積和分泌，但脂肪酸的分泌往往會(huì)減少細(xì)胞數(shù)目［14］，原因是脂肪酸的分泌主要發(fā)生在酵母的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，而脂肪酸的積累則發(fā)生在細(xì)胞的平臺(tái)期［55］。酵母中TAG或者自由脂肪酸分泌的機(jī)制尚不清晰。根據(jù)研究可知，任何使得酵母細(xì)胞積累高水平自由脂肪酸的機(jī)制都可以使自由脂肪酸從細(xì)胞中分泌出來(lái)。Roessler等［58］通過(guò)合成基因組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)了藍(lán)細(xì)菌也存在類(lèi)似的脂肪酸分泌機(jī)制。

6.2 脂肪酸和相關(guān)化合物的分泌機(jī)制

目前，一些親脂性化合物的分泌路徑已明確，包括從肝細(xì)胞分泌的含有TAG的極低密度脂（VLDL）小泡、從乳腺分泌的含TAG小泡和由多種碳?xì)浠衔锝M成的植物蠟的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制［59，60］。除了細(xì)胞輸出路徑，還有許多細(xì)胞內(nèi)不同細(xì)胞器之間的脂肪酸運(yùn)輸也已經(jīng)了解清楚，如脂肪酸進(jìn)入線(xiàn)粒體和過(guò)氧物酶體進(jìn)行β氧化，或許可以利用這些機(jī)制將脂肪酸運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞外。這些路徑中一些主要的基因已經(jīng)明確，ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體（transporters）的轉(zhuǎn)基因表達(dá)已經(jīng)應(yīng)用于藥物運(yùn)輸。然而，這些成功的轉(zhuǎn)基因表達(dá)和脂肪酸分泌路徑的改造是否適合生物燃料的生產(chǎn)，有待進(jìn)一步證實(shí)［61，62］，明確的分泌機(jī)制也有待進(jìn)一步探索。

目前，促進(jìn)微藻分泌脂肪酸最直接的方法就是利用ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體。ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體可以介導(dǎo)植物細(xì)胞中蠟質(zhì)的分泌，也可以將長(zhǎng)鏈脂肪酸運(yùn)輸?shù)竭^(guò)氧化物酶體中進(jìn)行β-氧化。擬南芥（A. thaliana）中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)超過(guò)120種不同的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體，它們除了轉(zhuǎn)運(yùn)超長(zhǎng)鏈脂肪酸外，還可以轉(zhuǎn)運(yùn)其他次級(jí)代謝產(chǎn)物，如萜類(lèi)化合物。研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥中的Desperado/ AtWBC11轉(zhuǎn)運(yùn)體和Cer5/AtWBC12轉(zhuǎn)運(yùn)體能夠促進(jìn)蠟分泌到植物表層［63，64］。另外，ABC轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)相關(guān)酶基因的轉(zhuǎn)基因表達(dá)可以增加卡那霉素、膽固醇和固醇等化合物的輸出［65-67］。

總之，利用微藻制備生物柴油尚處于試驗(yàn)階段，通過(guò)基因工程技術(shù)促進(jìn)脂肪酸分泌到培養(yǎng)系統(tǒng)，并利用油水分離收集脂肪酸，其成本較傳統(tǒng)的生產(chǎn)工藝低很多，但是脂肪酸的分泌量還很難達(dá)到工業(yè)化生產(chǎn)的需要，需要人們對(duì)脂肪酸分泌機(jī)制了解更多，最終實(shí)現(xiàn)可應(yīng)用的脂肪酸分泌系統(tǒng)和技術(shù)［68，69］。

7 展望

隨著陸地資源的減少，海洋資源的開(kāi)發(fā)逐漸被人們關(guān)注，其中，微藻能源的開(kāi)發(fā)就是研究的重點(diǎn)。微藻是多樣化的有機(jī)體，具有許多獨(dú)特的代謝特性：高光合傳遞速率、快速的生物量生產(chǎn)速率、適應(yīng)多種環(huán)境和可以生產(chǎn)多種類(lèi)的生物柴油等特點(diǎn)。基于微藻制備生物燃料的戰(zhàn)略意義，多國(guó)包括中國(guó)投入了大量的人力、物力，已經(jīng)取得了階段性的成果。許多藻類(lèi)的基因組序列已經(jīng)測(cè)序完畢，如萊茵衣藻、三角褐指藻和小球藻等。微藻的遺傳轉(zhuǎn)化體系也日漸完善，萊茵衣藻、小球藻、鹽藻和硅藻等已建立了高效的表達(dá)體系。另外，微藻積累脂肪酸的機(jī)制、脂肪酸合成相關(guān)基因的克隆及功能研究也已經(jīng)完成，對(duì)其合成調(diào)控機(jī)制有了初步認(rèn)識(shí)。同時(shí)，利用基因工程手段提高脂肪酸合成相關(guān)酶基因的轉(zhuǎn)錄及表達(dá)水平的研究也表現(xiàn)出不同的效果，某些FAS酶和TAG組裝酶對(duì)油脂合成的影響較明顯，Kennedy路徑中任何一種酰基轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)量增加都會(huì)導(dǎo)致TAG含量增加［1］。生物體內(nèi)的代謝路徑相互聯(lián)系、相互影響，對(duì)于其他代謝路徑，如三羧酸循環(huán)和磷脂酸合成路徑的調(diào)節(jié)均會(huì)影響到脂肪酸含量的變化。如用反義RNA技術(shù)對(duì)pepc基因進(jìn)行調(diào)控，使得微藻萊茵衣藻的脂肪酸含量提高了20%［44］。以上研究也說(shuō)明微藻中脂肪酸代謝體系比較復(fù)雜，是一個(gè)多酶參加的生物合成過(guò)程，受到多種因素的影響，還有未知的調(diào)控機(jī)制在起作用。因此，也有人試圖通過(guò)轉(zhuǎn)錄因子來(lái)調(diào)控脂肪酸的合成代謝，它不只是調(diào)控一種酶而是對(duì)應(yīng)著多個(gè)基因，效果會(huì)更明顯，這也是未來(lái)微藻油脂合成調(diào)控研究的重要方向。

盡管微藻產(chǎn)油存在多種優(yōu)勢(shì)，但相比陸地植物來(lái)說(shuō)，其大規(guī)模培養(yǎng)仍然受限，尚有許多問(wèn)題需要解決，如脂肪酸代謝路徑、密碼子偏好性、高表達(dá)載體等方面。微藻大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)及獲得油脂含量達(dá)到商業(yè)開(kāi)發(fā)水平的工程藻仍是整個(gè)生產(chǎn)環(huán)節(jié)的關(guān)鍵。微藻的培養(yǎng)和收集模式以及后期脂肪酸提取方法的革新都可能會(huì)降低生產(chǎn)成本。未來(lái)關(guān)于基因工程藻的研究可能集中在如下幾個(gè)方向：（1）Kennedy路徑中各個(gè)?；D(zhuǎn)移酶的改造；（2）利用轉(zhuǎn)錄因子綜合調(diào)控脂類(lèi)代謝過(guò)程；（3）研究脂肪酸自動(dòng)分泌的相關(guān)基因，以減少脂肪酸的提取成本。

［1］Radakovits R， Jinkerson RE， Darzins A， et al. Genetic engineering of algae for enhanced biofuel production［J］. Eukaryotic Cell， 2010，9（4）：486-501.

［2］Zhang FY， Yang MF， Xu YN. Silencing of DGAT1 in tobacco causes a reduction in seed oil content［J］. Plant Science， 2005， 169（4）：689-694.

［3］陳錦清， 郎春秀， 胡張華， 等. 反義PEP基因調(diào)控油菜籽粒蛋白質(zhì)/油脂含量比率的研究［J］. 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào)， 1999， 7（4）：316-320.

［4］ 姚茹， 程麗華， 徐新華， 等. 微藻的高油脂化技術(shù)研究進(jìn)展［J］.化學(xué)進(jìn)展， 2010， 22（6）：1221-1232.

［5］夏金蘭， 萬(wàn)民熙， 王潤(rùn)民， 等. 微藻生物柴油的現(xiàn)狀與進(jìn)展［J］.中國(guó)生物工程雜志， 2009， 29（7）：118-126.

［6］Merchant SS， Prochnik SE， Vallon O， et al. The Chlamydomonas genome reveals the evolution of key animal and plant functions［J］. Science， 2007， 318（5848）：245-250.

［7］王金娜， 嚴(yán)小軍， 周成旭， 等. 產(chǎn)油微藻的篩選及中性脂動(dòng)態(tài)積累過(guò)程的檢測(cè)［J］. 生物物理學(xué)報(bào)， 2010， 26（6）：472-480.

［8］朱順妮， 王忠銘， 尚?；ǎ?等. 微藻脂肪合成與代謝調(diào)控［J］.化學(xué)進(jìn)展， 2011， 23（10）：2169-2176.

［9］李興軍， 林文亞. 利用遺傳工程提高油料作物含油量的研究進(jìn)展［J］. 糧食科技與經(jīng)濟(jì)， 2010， 35（6）：33-36.

［10］Hu Q， Sommerfeld M， Jarvis E， et al. Microalgal triacylglycerols as feedstocks for biofuel production：perspectives and advances［J］. The Plant Journal， 2008， 54：621-639.

［11］赫冬梅， 段舜山. 代謝調(diào)控在微藻油脂累積中的作用［J］. 生態(tài)科學(xué)， 2009， 28（1）：85-89.

［12］Georgianna DR， Mayfield SP. Exploiting diversity and synthetic biology for the production of algal biofuels［J］. Nature， 2012，488：329-330.

［13］Sheehan J， Dunahay T， Benemann J， et al. A look back at the US Department of Energy's aquatic species program：biodiesel from algae［M］. Colorado：National Renewable Energy Laboratory，1998：328.

［14］Michinaka Y， Shimauchi T， Aki T， et al. Extracellular secretion of free fatty acids by disruption of a fatty acyl-CoA synthetase gene in Saccharomyces cerevisiae［J］. Journal of Bioscience andBioengineering， 2003， 95（5）：435-440.

［15］于水燕， 趙權(quán)宇， 史吉平. 固碳產(chǎn)油微藻的基因工程改造［J］.中國(guó)生物工程雜志， 2012， 32（12）：117-124.

［16］Sinetova MA， Kupriyanova EV， Markelova AG， et al. Identification and functional role of the carbonic anhydrase Cah3 in thylakoid membranes of pyrenoid of Chlamydomonas reinhardtii［J］. Biochimica et Biophysica Acta， 2012， 1817：1248-1255.

［17］Fulda M， Schnurr J， Abbadi A， et al. Peroxisomal acyl-CoA synthetase activity is essential for seedling development in Arabidopsis thaliana［J］. The Plant Cell， 2004， 16（2）：394-405.

［18］Germain V， Rylott EL， Larson TR， et al. Requirement for 3-ketoacyl-CoA thiolase-2 in peroxisome development， fatty acid β-oxidation and breakdown of triacylglycerol in lipid bodies of Arabidopsis seedlings［J］. The Plant Journal， 2001， 28（1）：1-12.

［19］Rylott EL， Rogers CA， Gilday AD， et al. Arabidopsis mutants in short- and medium-chain acyl-CoA oxidase activities accumulate acyl-CoAs and reveal that fatty acid β-oxidation is essential for embryo development［J］. The Journal of Biological Chemistry，2003， 278：21370-21377.

［20］Shi S， Chen Y， Siewers V， et al. Improving production of malonyl coenzyme A-derived metabolites by abolishing Snf1-dependent regulation of Acc1［J］. MBio， 2014， 5：1-8.

［21］Davis MS， Solbiati J， Cronan JE. Overproduction of acetyl-CoA carboxylase activity increases the rate of fatty acid biosynthesis in Escherichia coli［J］. Journal of Biological Chemistry， 2000， 275：28593-28598.

［22］Dunahay TG， Jarvis EE， Roessler PG. Genetic transformation of the diatoms Cyclotella cryptica and Navicula saprophila［J］. Journal of Phycology， 1995， 31（6）：1004-1012.

［23］Dehesh K， Tai H， Edwards P， et al. Overexpression of 3-ketoacylacyl-carrier protein synthase IIIs in plants reduces the rate of lipid synthesis［J］. Plant Physiology， 2001， 125：1103-1114.

［24］ Griffiths MJ， Harrison STL. Lipid productivity as a key characteristic for choosing algal species for biodiesel production［J］. Journal of Applied Phycology， 2009， 21：493-507.

［25］ Mutanda T， Ramesh D， Karthikeyan S， et al. Bioprospecting for hyper-lipid producing microalgal strains for sustainable biofuel production［J］. Bioresource Technology， 2011， 102：57-70.

［26］Larkum AWD， Ross IL， Kruse O， et al. Selection， breeding and engineering of microalgae for bioenergy and biofuel production［J］. Trends in Biotechnology， 2011， 30：198-205.

［27］馮國(guó)棟， 程麗華， 徐新華， 等. 微藻高油脂化基因工程研究策略［J］. 化學(xué)進(jìn)展， 2012， 24：1413-1426.

［28］Kim JW. Topical prostaglandin analogue drugs inhibit adipocyte differentiation［J］. Korean Journal of Ophthalmology， 2014， 28：257-264.

［29］Yi B， Wang J， Wang S， et al. Overexpression of Banna mini-pig inbred line fatty acid binding protein 3 promotes adipogenesis in 3T3-L1 preadipocytes［J］. Cell Biology International， 2014， 38：918-923.

［30］ Vigeolas H， Waldeck P， Zank T， et al. Increasing seed oil content in oil-seed rape（Brassica napus L. ）by over-expression of a yeast glycerol-3-phosphate dehydrogenase under the control of a seedspecific promoter［J］. Plant Biotechnology Journal， 2007， 5：431-441.

［31］Misra N， Panda PK. In search of actionable targets for agrigenomics and microalgal biofuel production：sequence-structural diversity studies on algal and higher plants with a focus on GPAT protein［J］. OMICS：A Journal of Integrative Biology， 2013，17：173-186.

［32］Jain RK， Coffey M， Lai K， et al. Enhancement of seed oil content by expression of glycerol-3-phosphate acyltransferase genes［J］. Biochemical Society Transactions， 2000， 28：958-961.

［33］Zou J， Katavic V， Giblin EM， et al. Modification of seed oil content and acyl composition in the brassicaceae by expression of a yeast sn-2 acyltransferase gene［J］. The Plant Cell， 1997， 9：909-923.

［34］Knutzon DS， Hayes TR， Wyrick A， et al. Lysophosphatidic acid acyltransferase from coconut endosperm mediates the insertion of laurate at the sn-2 position of triacylglycerols in lauric rapeseed oil and can increase total laurate levels［J］. Plant Physiology， 1999，120：739-746.

［35］Lv H， Qu G， Qi X， et al. Transcriptome analysis of Chlamydomonas reinhardtii during the process of lipid accumulation［J］. Genomics， 2013， 101：229-237.

［36］Pingitore P， Pirazzi C， Mancina RM， et al. Recombinant PNPLA3 protein shows triglyceride hydrolase activity and its I148M mutation results in loss of function［J］. Biochimica et Biophysica Acta，2014， 1841：574-580.

［37］Eto M， Shindou H， Shimizu T. A novel lysophosphatidic acid acyl-transferase enzyme（LPAAT4）with a possible role for incorporating docosahexaenoic acid into brain glycerophospholipids［J］. Biochemical and Biophysical Research Communications， 2014，443：718-724.

［38］Lardizabal K， Effertz R， Levering C， et al. Expression of Umbelopsis ramanniana DGAT2A in seed increases oil in soybean［J］. Plant Physiology， 2008， 148：89-96.

［39］Zheng P， Allen WB， Roesler K， et al. A phenylalanine in DGAT is a key determinant of oil content and composition in maize［J］. Nature Genetics， 2008， 40：367-372.

［40］Bouvier-Navé P， Benveniste P， Oelkers P， et al. Expression in yeast and tobacco of plant cDNAs encoding acyl CoA：diacylglycerol acyltransferase［J］. European Journal of Biochemistry， 2000，267：85-96.

［41］Jako C， Kumar A， Wei Y， et al. Seed-specific over-expression of an Arabidopsis cDNA encoding a diacylglycerol acyltransferase enhances seed oil content and seed weight［J］. Plant Physiology，2001， 126：861-874.

［42］Deng X， Li Y， Fei X. The mRNA abundance of pepc2 gene is negatively correlated with oil content in Chlamydomonas reinhardtii［J］. Biomass and Bioenergy， 2011， 35（5）：1811-1817.

［43］Deng X， Cai J， Li Y， et al. Expression and knockdown of the PEPC1 gene affect carbon flux in the biosynthesis of triacylglycerols by the green alga Chlamydomonas reinhardtii［J］. Biotechnology Letters， 2014， 108：56-67.

［44］De Riso V， Raniello R， Maumus F， et al. Gene silencing in the marine diatom Phaeodactylum tricornutum［J］. Nucleic Acids Research， 2009， 57：66-78.

［45］Molnar A， Bassett A， Thuenemann E， et al. Highly specific gene silencing by artificial microRNAs in the unicellular alga Chlamydomonas reinhardtii［J］. The Plant Journal， 2009， 58（1）：165-174.

［46］Tong J， Zhang GM， Wang XF， et al. Cloning of citrate synthase gene in rapeseed（Brassica napus L. ）and its expression under stresses［J］. Acta Agronomica Sinica， 2009， 35：33-40.

［47］Hu LH， Wu HM， Zhou ZM， et al. Introduction of citrate synthase gene（CS）into an elite indica rice restorer line Minghui 86 by agrobacterium -mediated method［J］. Molecular Plant Breeding，2006， 4：160-166.

［48］Barone P， Rosellini D， LaFayette P， et al. Bacterial citrate synthase expression and soil aluminum tolerance in transgenic alfalfa［J］. Plant Cell Reports， 2008， 27（5）：893-901.

［49］Chi GH， Zhou XL， Li MY， et al. Cloning and bioinformatics analysis of MaGCS encoding a homolog citrate synthase from banana［J］. Chinese Journal of Tropical Agriculture， 2009， 29：12-18.

［50］Zhang XM， Du LQ， Sun GM， et al. Changes in organic acid concentrations and the relative enzyme activities during the development of Cayenne pineapple fruit［J］. Journal of Fruit Science， 2007， 24：381-384.

［51］Taylor BF. Fine control of citrate synthase activity in blue-green algae［J］. Arch Mikrobiol， 1973， 92（3）：245-249.

［52］Deng X， Cai J， Fei X. Effect of the expression and knockdown of citrate synthase gene on carbon flux during triacylglycerol biosynthesis by green algae Chlamydomonas reinhardtii［J］. BMC Biochemistry， 2013， 14：38-49.

［53］Zhao T， Wang W， Bai X， et al. Gene silencing by artificial microRNAs in Chlamydomonas［J］. The Plant Journal， 2009， 58（1）：157-164.

［54］Nojima Y， Kibayashi A， Matsuzaki H， et al. Isolation and characterization of triacylglycerol-secreting mutant strain from yeast， Saccharomyces cerevisiae［J］. The Journal of General and Applied Microbiology， 1999， 45：1-6.

［55］Scharnewski M， Pongdontri P， Mora G， et al. Mutants of Saccharomyces cerevisiae deficient in acyl-CoA synthetases secrete fatty acids due to interrupted fatty acid recycling［J］. FEBS Journal， 2008， 275（11）：2765-2778.

［56］Ramazanov A， Ramazanov Z. Isolation and characterization of a starchless mutant of Chlorella pyrenoidosa STL-PI with a high growth rate， and high protein and polyunsaturated fatty acid content［J］. Phycological Research， 2006， 54（4）：255-259.

［57］劉飛飛， 李秀波， 方仙桃， 等. 三角褐指藻產(chǎn)油突變株的篩選［J］. 水生生物學(xué)報(bào)， 2013， 37（4）：799-802.

［58］Roessler PG， Chen Y， Liu B， et al. Secretion of fatty acids by photosynthetic microorganisms：US， US20080333280［P］. 2009-12-3.

［59］Gibbons GF， Islam K， Pease RJ. Mobilisation of triacylglycerol stores［J］. Biochimica et Biophysica Acta， 2000， 1483（1）：37-57.

［60］Lehner R， Vance DE. Cloning and expression of a cDNAencoding a hepatic microsomal lipase that mobilizes stored triacylglycerol［J］. Biochemical Journal， 1999， 343：1-10.

［61］ Tietge UJF， Bakillah A， Maugeais C， et al. Hepatic overexpression of microsomal triglyceride transfer protein（MTP）results in increased in vivo secretion of VLDL triglycerides and apolipoprotein B［J］. The Journal of Lipid Research， 1999， 40：2134-2139.

［62］McManaman JL， Russell TD， Schaack J， et al. Molecular determinants of milk lipid secretion［J］. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia， 2007， 12（4）：259-268.

［63］Panikashvili D， Savaldi-Goldstein S， Mandel T， et al. The Arabidopsis DESPERADO/AtWBC11 transporter is required for cutin and wax secretion［J］. Plant Physiology， 2007， 145：1345-1360.

［64］Pighin JA， Zheng H， Balakshin LJ， et al. Plant cuticular lipid export requires an ABC transporter［J］. Science， 2004， 306：702-704.

［65］Janvilisri T， Venter H， Shahi S， et al. Sterol transport by the human breast cancer resistance protein（ABCG2）expressed in Lactococcus lactis［J］. The Journal of Biological Chemistry， 2003， 278：20645-20651.

［66］Mentewab A， Stewart CN. Overexpression of an Arabidopsis thaliana ABC transporter confers kanamycin resistance to transgenic plants［J］. Nature Biotechnology， 2005， 23：1177-1180.

［67］Yu L， Gupta S， Xu F， et al. Expression of ABCG5 and ABCG8 is required for regulation of biliary cholesterol secretion［J］. The Journal of Biological Chemistry， 2005， 280：8742-8747.

［68］Hayashi M， Nito K， Takei-Hoshi R， et al. Ped3p is a peroxisomal ATP-binding cassette transporter that might supply substrates for fatty acid beta-oxidation［J］. Plant and Cell Physiology， 2002， 43（1）：1-11.

［69］Zolman BK， Silva ID， Bartel B. The Arabidopsis pxa1 mutant is defective in an ATP-binding cassette transporter-like protein required for peroxisomal fatty acid beta-oxidation［J］. Plant Physiology， 2001， 127（3）：1266-1278.

（責(zé)任編輯 狄艷紅）

Research Advances of Genetic Engineering of Microalgae for Improving Lipid Production

Li Yi Wang Chaogang Hu Zhangli
（Shenzhen Key Laboratory of Marine Bioresources and Ecology，College of Life Sciences，Shenzhen University，Shenzhen 518060）

In recent years， microalgae oil biodiesel has become a hot spot because of its strategic importance. Microalgae are a promising feedstock for biodiesel due to their short growth cycle， easy to mass culture， ability to absorb CO2and no taking farmland， etc. However， largescale development and utilization of microalgae biomass energy is limited by less knowledge about metabolic mechanisms of lipid synthesis and lagging research of genome in microalgae. With the development of modern biotechnology， improving lipid content and biomass of microalgae may achieve through genetic engineering and metabolic engineering methods. This review describes recent efforts to metabolic mechanisms on lipid biosynthesis and genetic engineering techniques on increasing lipid content， which provide technical reserves for attaining high lipid transgenic microalgae and producing microalgae biodiesel.

microalgae；genetic engineering；biodiesel；lipid

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.04.010

2014-08-03

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（41176106，31000162和31070323），深圳市科技計(jì)劃項(xiàng)目（CXB201104210005A，JCYJ201206131125-12654，JSGG20130411160539208）

李逸，女，碩士研究生，研究方向：藻分子生物學(xué)；E-mail：811054831@qq.com

王潮崗，男，博士，研究方向：藻類(lèi)學(xué)；E-mail：charlesw@szu.edu.cn