一株產(chǎn)脂肪酶菌株的篩選、鑒定及酶性質(zhì)的研究

莊 巖，夏文旭，雷晨瑤，肖宇軒，舒宗美，趙 萍，陸界瑾，聶 霖，牛 軍，王 雅

（蘭州理工大學生命科學與工程學院，甘肅 蘭州 730050）

一株產(chǎn)脂肪酶菌株的篩選、鑒定及酶性質(zhì)的研究

莊 巖，夏文旭，雷晨瑤，肖宇軒，舒宗美，趙 萍*，陸界瑾，聶 霖，牛 軍，王 雅

（蘭州理工大學生命科學與工程學院，甘肅 蘭州 730050）

本文對從土樣中篩選出具有產(chǎn)脂肪酶的菌株Yz12進行顯微鏡檢及分子鑒定，探索不同因素對菌株Yz12產(chǎn)酶條件的影響以及菌株Yz12酶學性質(zhì)。結果表明，菌株Yz12最適溫度為30℃；最適pH為8.0；碳源為橄欖油與蔗糖（3∶1）；氮源為（NH4）2SO4與牛肉膏（1∶2）以及最佳發(fā)酵時間為72h。Yz12脂肪酶最適溫度為30℃；最適pH為7.0；Ca2+能促進Yz12脂肪酶的活力。經(jīng)鏡檢及分子鑒定后，確定菌株Yz12為米曲霉Aspergillus oryzae。

菌株，脂肪酶，篩選，鑒定，酶活

Keywords∶ The raw coal sample； Heat of combustion； Determination； Renault correction plan

脂肪酶（Lipase）作為生物催化劑，是一類特殊酯鍵水解酶，隨著酶固定化技術等相關研究的突破進展，人們對脂肪酶產(chǎn)生極大的興趣。盡管目前已經(jīng)克隆出低溫脂肪酶的部分功能基因并成功表達，但低溫脂肪酶基因的異源表達性能差限制了其在工業(yè)化生產(chǎn)中的應用［1］。

微生物脂肪酶因具有種類多、制劑純度高等優(yōu)點而得到廣泛應用，尤其在油脂化工和有機合成工業(yè)［2］。伴隨對生產(chǎn)脂肪酶微生物的深入研究，目前主要包括假單胞菌屬（Pseudomonas sp.）、鏈霉菌屬（Streptomyces sp.）、假絲酵母屬（Candida sp.）、黑曲霉（Aspergillus niger）、根霉屬（Rhizopus sp.）等。相對于來自動植物的酶，微生物酶具有大規(guī)模發(fā)酵工藝簡單，易于培養(yǎng)等特點［3］。隨著藥物蛋白臨床治療和工業(yè)酶應用需求的日益增加，利用基因工程和蛋白質(zhì)工程來實現(xiàn)重組酶的高水平表達以及篩選出新特性或高活力的酶來滿足大規(guī)模純化酶的生產(chǎn)需求［4-5］，因此，能否大規(guī)模分離純化相應的微生物酶制品已成為當前生物工程中的一個關鍵性問題［6］。

本研究通過采集蘭州理工大學學生食堂附近長期積油的土壤，從積油土樣中分離篩選出產(chǎn)脂肪酶的菌株，進行多次復篩及純化后，最終得到一株能產(chǎn)脂肪酶的高效菌株，并研究其產(chǎn)酶條件特性和酶學性質(zhì)。

1、材料與方法

1.1材料及培養(yǎng)基

試樣：采自于蘭州理工大學學生食堂附近長期積油的土壤。

馬鈴薯培養(yǎng)基（PDA）：馬鈴薯200g，蔗糖（或葡萄糖）20g，瓊脂18g，水1000mL，pH7，1×105Pa滅菌30min。

羅丹明B顯色培養(yǎng)基：橄欖油2.0g、瓊脂粉5g、K2HPO40.2g、MgSO4·7H2O 0.1g、（NH4）2SO40.4g至250mL蒸餾水，1×105Pa滅菌30min后加1mL 0.001mol/L羅丹明B。

油脂培養(yǎng)基：橄欖油2.0g、瓊脂粉5g、K2HPO40.2 g、MgSO4·7H2O 0.1g、（NH4）2SO40.4g至250mL蒸餾水，1×105Pa滅菌30min。

復篩培養(yǎng)基：橄欖油3.0g，K2HPO41.0 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，（NH4）2SO41.5g，葡萄糖1.0g至150mL，1×105Pa滅菌30min。

1.2菌株Yz12的分離與純化

取采集土樣5.0g溶于10mL無菌水中，充分搖勻，靜置片刻，取上層液體1mL于20mL PDA液體培養(yǎng)基中，30℃，150r/min，培養(yǎng)3d后，取1mL轉接到新的PDA液體培養(yǎng)基中，同樣條件下進行3次富集［7］。取最后一次富集菌液1mL到9mL無菌水中10倍稀釋到10-7，取各梯度1mL，分別涂布于羅丹明B顯色培養(yǎng)基和油脂培養(yǎng)基中，30℃，培養(yǎng)2-3d，將變色圈較大的菌落（羅丹明B顯色培養(yǎng)基，365nm）和透明圈較大的菌落（油脂培養(yǎng)基）劃線分離純化，挑至PDA斜面培養(yǎng)基上保藏［8］。將PDA斜面培養(yǎng)基上保藏的菌株，用無菌水配成并稀釋，將稀釋成10-2的菌懸液分別放入復篩培養(yǎng)基中，30℃，150r/min 培養(yǎng)60h后，采用滴定法測定脂肪酶酶活性［9］，選擇酶活最好的一株菌株，標記為：Yz12。

1.3菌株Yz12顯微鏡檢及分子鑒定

制備PDA與油脂培養(yǎng)基，分別將菌株Yz12從斜面轉接到PDA和油脂培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)，并在3d后觀察其形態(tài)。參照《細菌鑒定手冊》與《真菌鑒定手冊》進行形態(tài)學特征初步檢測。

利用ITS rDNA兩端的引物NS1（GTAGTCATATGCTTGTCTC）和NS8（TCCTCCGCTTATTGATATGC）擴增菌株Yz12的ITS rDNA基因，并進行DNA測序。篩選得到的菌株Yz12的PCR擴增及18S rDNA序列測序均由英茂盛業(yè)測序公司完成。

PCR擴增反應體系：基因組DNA 1.0μL、10×Buffer（含2.5mM Mg2+） 2.5μL、Taq聚合酶（5U/μL）0.5μL、dNTP（10mM）1.0μL、NS1（10μM） 0.5μL、NS8（10μM）0.5μL、ddH2O 0.5μL。PCR反應參數(shù)：95℃ 3min；95℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 120s，35個循環(huán)［10］。

利用CLC DNA Workbench 6軟件將獲得序列與GenBank中收錄的DNA序列進行比對，并與相關菌株構建進化樹。根據(jù)形態(tài)學與分子特征來確定菌株Yz12的屬種。

1.4各因素對菌株Yz12產(chǎn)酶條件的影響［11］

1.4.1溫度對菌株Yz12產(chǎn)酶條件的影響

將菌株Yz12轉接到裝有150mL復篩培養(yǎng)基的錐形瓶中，分別在30、35、40、45和50℃下，150r/min，培養(yǎng)60h，檢測其酶活力［12］。

1.4.2pH對菌株Yz12產(chǎn)酶的影響

將菌株Yz12轉接到裝有150mL復篩培養(yǎng)基的錐形瓶中，分別在pH為：5.0、6.0、7.0、8.0和9.0下，30℃，150r/min，培養(yǎng)60h，檢測其酶活力。

1.4.3碳源對菌株Yz12產(chǎn)酶的影響

將菌株Yz12轉接到裝有150mL在復篩培養(yǎng)基基礎上，改變其不同的碳源｛碳源分別為：蔗糖4.0g、葡萄糖4.0g、可溶性淀粉4.0g、葡萄糖+橄欖油（1∶3）4.0g、蔗糖+橄欖油（1∶3）4.0g｝的錐形瓶中，30℃，150r/min，培養(yǎng)60h，檢測其酶活力。

1.4.4氮源對菌株Yz12產(chǎn)酶的影響

將菌株Yz12轉接到裝有150mL在復篩培養(yǎng)基基礎上，改變其不同的氮源｛氮源分別為：（NH4）2SO41.5g、NH4Cl 1.5g、牛肉膏1.5g、蛋白胨1.5g、牛肉膏+（NH4）2SO4（2∶1）1.5g、蛋白胨+（NH4）2SO4（2∶1） 1.5g［13］｝的錐形瓶中，30℃，150r/min，培養(yǎng)60h，檢測其酶活力。

1.4.5發(fā)酵時間對菌株Yz12產(chǎn)酶的影響

將菌株Yz12轉接到含150mL復篩培養(yǎng)基的形瓶中，30℃，150r/min，分別培養(yǎng)36、48、60、72和84h，檢測其酶活力。

1.5菌株Yz12酶學性質(zhì)的測定［14］

1.5.1溫度對菌株Yz12酶活的影響

將含有10mL 0.01mol/L硬脂酸鈉與1g橄欖油的100mL乳化液（蒸餾水補足），加入5mL酶液后，分別在溫度為25、30、35、40、45℃，并在各反應溫度的10、20、30min后，分別測定其酶活（3次重復，下同）。

1.5.2pH對菌株Yz12脂肪酶活力的影響

將含有10mL 0.01mol/L硬脂酸鈉與1g橄欖油的100mL乳化液（蒸餾水補足），加入5mL酶液后，分別在pH值為5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，30℃，并在各pH值條件下，反應10、20、30min后，分別測定其酶活。

1.5.3金屬離子對菌株Yz12酶活的影響

取10mL 0.5mmol/L的Mg2+、Cu2+、Fe2+、K+和Ca2+溶液分別加入到100mL的乳化液和未加離子的反應對照組中，加入5mL酶液，30℃，10min后，分別測定其酶活。

2、結果與分析

2.1菌株Yz12的鏡檢及18S rDNA基因鑒定結果

菌株Yz12在PDA培養(yǎng)基上生長迅速，菌落質(zhì)地疏松，初白色，漸淡黃色，后為淡綠色至綠褐色；在油脂培養(yǎng)基上菌落生長緩慢，菌落呈黃綠色；分生孢子頭呈放射狀，直徑約為200μm。分生孢子梗莖約為2mm，近頂囊處直徑20μm左右，頂囊近球形小梗為單層，分生孢子呈球形（見圖1）。

圖1　Yz12 PDA培養(yǎng)基形態(tài)和棉藍染色后分生孢子形態(tài)（400X）Fig. 1 the morphology of the Yz12 in the PDA culture medium and the spores of the cotton blue staining （400X）

利用CLC DNA Workbench 6軟件將菌株Yz12的部分序列與GenBank中相關菌株的DNA序列進行比對，并構建進化樹（見圖2），同時根據(jù)GB/T 5009.22-2003中黃曲霉毒素B1的測定方法進一步檢驗菌株Yz12，最終確定該菌株為米曲霉Aspergillus oryzae。菌株Yz12的部分序列已提交至GenBank中，收錄號為JX489381。

圖2　菌株Yz12的18S rDNA序列系統(tǒng)發(fā)育分析Figure 2 The analysis of sequence phylogenetic of 18S rDNA of strain Yz12

2.2各因素對菌株Yz12產(chǎn)酶條件的影響

2.2.1溫度對菌株Yz12產(chǎn)酶的影響

由圖3可知，溫度20-30℃，菌株Yz12的產(chǎn)酶能力隨著溫度增加而增加，在30℃以后產(chǎn)酶能力逐漸降低，因此，認為菌株Yz12的最適產(chǎn)酶溫度為30℃。經(jīng)鑒定，菌株Yz12為真菌，與細菌不同，溫度對真菌的產(chǎn)酶影響較大且發(fā)酵溫度在35℃以下比較適宜，產(chǎn)酶能力較好。

圖3　溫度對Yz12產(chǎn)酶的影響Figure 3 The influence of temperature on enzyme of Yz12

2.2.2pH對菌株Yz12產(chǎn)酶條件的影響

如圖4所示，培養(yǎng)基初始pH從5.0到9.0變化時，菌株Yz12起初產(chǎn)的酶能力隨著pH增加而增加，在8.0時開始趨于平緩，因此認為菌株Yz12的最適產(chǎn)酶pH為8.0，說明菌株Yz12在弱堿性條件下，有較好的產(chǎn)酶能力，這可能與菌株代謝產(chǎn)生酸性物質(zhì)影響脂肪酶合成，釋放有關，當pH繼續(xù)增大時，產(chǎn)酶能力下降，這可能說明高的pH不適應這些菌株的生長。

圖4　不同pH對Yz12產(chǎn)酶的影響Figure 4 The influence of different pH value of enzyme of Yz12

2.2.3碳源對菌株Yz12產(chǎn)酶條件的影響

在不同碳源組的檢測酶活中，蔗糖組酶活為5.89U/mL，葡萄糖組酶活為7.20U/mL，橄欖油組酶活為4.47U/mL，橄欖油+葡萄糖組酶活為9.65U/mL，橄欖油+蔗糖組酶活為10.25 U/mL，可溶性淀粉組酶活為8.24U/mL。以橄欖油為C源時，Yz12產(chǎn)酶活最低，而當C源為橄欖油+蔗糖的混合時，產(chǎn)酶能力最高。一些研究指出以葡萄糖或蔗糖作為真菌產(chǎn)酶的C源可獲得理想的發(fā)酵效果［15］，而本試驗發(fā)現(xiàn)當C源為油脂和蔗糖的混合時，效果明顯優(yōu)于葡萄糖、蔗糖等，這一現(xiàn)象可能與微生物種類不同和測試方法不同所致。

2.2.4氮源對菌株Yz12產(chǎn)酶條件的影響

檢測不同N源組酶活時，發(fā)現(xiàn)（NH4）2SO4組酶活為10.42U/mL，NH4Cl組酶活為10.27U/mL，牛肉膏組酶活為11.74U/mL，蛋白胨組酶活為9.43U/mL，（NH4）2SO4+牛肉膏組酶活為12.64U/mL，（NH4）2SO4+蛋白胨組酶活為11.22U/mL。N源是無機鹽和有機氮時產(chǎn)酶能力相差不大，而當N源為（NH4）2SO4+牛肉膏混合時，產(chǎn)酶能力最高。據(jù)報道，脂肪酶的發(fā)酵生產(chǎn)多以牛肉膏、蛋白胨為N源［8］，而本試驗發(fā)現(xiàn)當N源為牛肉膏+無機氮時，產(chǎn)酶效果要好于牛肉膏或蛋白胨。

2.2.5發(fā)酵時間對菌株Yz12產(chǎn)酶條件的影響

如圖5可知，發(fā)酵時間從36-72h時，菌株Yz12的產(chǎn)酶能力隨著時間增加而增加，在72h時開始降低，因此，菌株Yz12的最佳產(chǎn)酶發(fā)酵時間為72h。發(fā)酵時間越短，產(chǎn)酶能力基本與菌株的數(shù)量成正比，隨著發(fā)酵時間的增長菌株趨于平穩(wěn)，脂肪酶產(chǎn)生速率最高，但隨著代謝不斷的進行，酸性物質(zhì)產(chǎn)生，影響膜的通透性，同時也抑制酶的生成。隨著脂肪酶合成與釋放減少，脂肪酶被其他蛋白酶代謝，其數(shù)量逐漸降低［16］。

圖5　發(fā)酵時間對Yz12產(chǎn)酶量的影響Figure 5 The influence of fermentation time on enzyme production of Yz12

2.3菌株Yz12的酶學性質(zhì)

2.3.1溫度對菌株Yz12酶活的影響

由表1可知，菌株Yz12的脂肪酶最適溫度為30℃，溫度在35℃以下具有良好的穩(wěn)定性，溫度超過40℃時酶活活性快速下降。在45℃，30min后測定脂肪酶殘留活力僅初始反應的20%左右。脂肪酶的熱穩(wěn)定性一直是脂肪酶生產(chǎn)和應用的關鍵問題，從自然界篩選高溫脂肪酶菌種并獲得對應基因，應利用基因克隆和重組等技術解決該問題。

表1　溫度對Yz12菌株脂肪酶活力的影響（U/mL）Table 1 Effects of temperature on Yz12 lipase activity

2.3.2pH對菌株Yz12酶活的影響

由表2可知，菌株Yz12脂肪酶最適pH為7。隨后pH值增大，菌株Yz12的酶活迅速下降。在3個反應體系中，pH在5.0-9.0中，菌株Yz12酶活都具有良好的穩(wěn)定性。pH的高低會影響到酶在溶液中的分子結構，進而影響酶的活性，其次研究的溶液極性大小對酶分子的結構影響，能了解酶的催化特征，進而有效利用酶的活性［17］。

表2　pH對Yz12脂肪酶活力和穩(wěn)定性的影響（U/mL）Table 2 Effects of pH on Yz12 lipase activity

2.3.3金屬離子對菌株Yz12酶活的影響

脂肪酶的催化一般不需輔助因子，但如Mg2+、Ca2+等二價金屬離子會對一些真菌脂肪酶有促進作用。在不同離子組及對照組的檢測酶活中，發(fā)現(xiàn)對照組的酶活為10.81U/mL，Mg2+組的酶活為11.82U/mL，Cu2+組的酶活為9.53U/mL，F(xiàn)e2+組的酶活為9.15U/mL，K+組的酶活為11.02U/mL，Ca2+組的酶活為12.53U/mL，由此可知，Ca2+組能促進菌株Yz12脂肪酶的活力；Mg2+、K+組比對照組稍高；Cu2+、Fe2+組比對照組稍低。

3、討論

3.1經(jīng)過選擇性培養(yǎng)篩選出有明顯白色水解圈和復篩測定酶活和觀察白色水解圈，獲得一株高效脂肪酶酶活菌株Yz12，結合微生物形態(tài)學與分子鑒定判定菌株Yz12為米曲霉Aspergillus oryzae。

3.2菌株Yz12最適產(chǎn)酶溫度為30℃；最適產(chǎn)酶pH為8.0；碳源為橄欖油與蔗糖（3∶1）、氮源為（NH4）2SO4與牛肉膏（1∶2）；最佳產(chǎn)酶發(fā)酵時間為72h。

3.3菌株Yz12脂肪酶最適溫度為30℃，在35℃以下具有良好的穩(wěn)定性；最適pH 7.0，在pH 5.0-9.0時酶活較穩(wěn)定；Ca2+能促進Yz12脂肪酶的活力。

［1］ 談重芳，王雁萍，陳林海. 微生物脂肪酶在工業(yè)中的應用及研究進展［J］. 食品工業(yè)科技， 2006， 27（7）： 193-195.

［2］ Van Dyck SMO， Lemiere GLF， Jonckers THM， et al. Kinetic resolution of a dihydrobenzofuran-type neolignan by lipase-catalysed acetylation［J］. Tetrahedron： Asymmetry， 2001， 12： 785-789.

［3］ MOH′D S， JUERGEN W. Lipases from extremophiles and potential for industrial applications ［J］. Advances in Applied Microbiology， 2007， 61： 253-283.

［4］ Slim Cherif， Ahmed Fendri， Nabil Miled. Crab digestive lipase acting at high temperature purification and biochemical characterization［J］. Biochimie， 2007， 89（8）：1012-1018.

［5］ Chiara Giulia Laudani， Maja Habulin， eljko Knez， et al.Immobilized lipase-mediated Long-chain fatty acid esterification in dense carbon dioxide： bench-scale packed-bed reactor study［J］. The Journal of Supercritical Fluids， 2007， 41（1）：74-81.

［6］ Moh'd Salameh， Juergen Wiegel. Lipases from Extremophiles and Potential for Industrial Applications［J］. Advances in Applied Microbiology， 2007， 61： 253-283.

［7］ 胡朝陽， 韋晗寧， 李春苑， 等. 產(chǎn)脂肪酶菌株的篩選及酶學特性研究［J］.廣西農(nóng)業(yè)生物科學， 2006， 25（3）： 261-268.

［8］ 張搏， 楊江科， 蘇華武， 等. 脂肪酶產(chǎn)生菌的篩選、鑒定及其產(chǎn)酶條件優(yōu)化［J］.生物技術，2007， 17（1）： 23-26.

［9］ 高貴，韓四平，王智.等. 脂肪酶活力檢測方法的比較［J］.藥物生物技術， 2002， 5（9）：281-284.

［10］ Cheng HR， Jiang N. Extremely rapid extraction of DNA from bacteria and yeasts ［J］. Biotechnology Letters， 2006， 28 （1）： 55-59.

［11］ Battinelli L， Cernia E， Delbo M， et al. New class of poly（vinyl alcohol） polymers as columnchromatography stationary phases for Candida rugosalipase isoforms separation［J］. J Chromatogr， 2006， 53：47-55.

［12］ L Ancona Mendez， C A Sandoval Castro， R Belmar Cassoetcs， et al. Effect of substrate and harvest on the aminoacid profile of Oystermushroom （Pleurotus ostreatus） ［J］. Journal of Food Composition and Analysis， 2005， 18 （5）： 447-450

［13］ 曾璐， 林親錄， 王偉. 脂肪酶產(chǎn)生菌產(chǎn)酶條件的研究［J］. 現(xiàn)代食品科技， 2007， 23 （7）， 15-19.

［14］ Surinenaite B， Bendikiene V， Baehnlatova1. Charaetenzations and Physicochemical properties of a lipase from pseudomonas mendocina3121-l［J］. Biotechnol Appl. Biochem.， 2002， 36（8）：47.

［15］ Malcata F X， Hector R Reyes， Hugo S Garcia， et al. Kinetics and mechanism of reactions catalysed by immobilized lipases［J］. Enzyme Microb. Technol.， 1992， 14： 426-446.

［16］ Balcao V M， Paiva A L， Malcata F X. Bioreactors with immobilized lipases： state of the art［J］. Enzyme. Microb. Technol.， 1996，18： 392-416.

［17］ 陸界瑾. 產(chǎn)脂肪酶菌株的篩選、鑒定及酶學性質(zhì)的研究［D］. 蘭州：蘭州理工大學碩士學位論文，2011.

Isolation， identification and the enzyme properties research of a lipase producing strain

ZHUANG Yan， XIA Wen-xu， LEI Chen-yao， XIAO Yu-xuan， SHU Zong-mei， ZHAO Ping*，LU Jie-jin， NIE Lin， NIU Jun， WANG Ya（School of life science and engineering， Lanzhou University of Technology， Lanzhou， Gansu 730050， China）

To isolate and screen a strain Yz12 with high efficiency lipase from the soil sample， the isolation of Yz12 was carried out by microscopic examination and molecular identification. The influence of different factors on the production of Yz12 was studied， and the properties of Yz12 were determined. The most suitable temperature was 30. The optimal pH was 8. Carbon source was good for olive oil and sucrose （3∶1）， nitrogen source for ammonium sulfate and beef extract （1∶2）. The optimal fermentation time was 72h. Yz12 lipase activity was the most suitable temperature of 30. The best pH was 7. Ca2+ can promote the activity of Yz12 lipase. After microscopic examination and molecular identification， the strain Yz12 was identified as Aspergillus oryzae.

strains， lipase， screening， identification， enzyme activities

S154.39

A

甘肅省青年科技研究基金項目（1310RJYA022），國家科技支撐計劃（2011BAD15B03）

莊巖（1982-），男，講師，碩士，研究方向為生物質(zhì)資源的開發(fā)與利用。

趙萍（1964- ），女，教授，碩士，碩士生導師，研究方向為食品科學、副產(chǎn)物綜合利用研究，