通心絡(luò)對急性腦梗死大鼠血清脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2及腦微血管變化的影響

劉軍

（湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬襄陽醫(yī)院藥學(xué)部，湖北襄陽441000）

通心絡(luò)對急性腦梗死大鼠血清脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2及腦微血管變化的影響

劉軍

（湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬襄陽醫(yī)院藥學(xué)部，湖北襄陽441000）

目的探討通心絡(luò)對急性腦梗死大鼠腦血清中脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2（Lp-PLA2）及微血管變化的影響。方法建立大鼠大腦左側(cè)半球模型，使其大腦中動脈發(fā)生永久性栓塞，并按隨機方法均分為模型組、假手術(shù)組、通心絡(luò)組及丁苯酞組4組，各60只，每組再分為1 d組和3 d組。其中假手術(shù)組和模型組均采用生理鹽水灌胃，通心絡(luò)組采用通心絡(luò)灌胃給藥，丁苯酞組則采用丁苯酞灌胃給藥。測定大鼠血清中Lp-PLA2的含量，采用2，3，5-氯化三苯四唑進行染色以檢測腦組織的梗死體積比例，經(jīng)HE染色觀察腦微血管的形態(tài)變化，經(jīng)免疫組化法測定各組大鼠中腦組織血管生成素-1（ANG-1）、內(nèi)皮抑素（ES）的表達量。結(jié)果與模型組大鼠相比，通心絡(luò)組及丁苯酞組大鼠血清中Lp-PLA2含量均明顯降低（P<0.05），腦梗死體積比例均降低，腦梗死面積也明顯減少，水腫程度明顯降低；與模型組大鼠相比，通心絡(luò)組及丁苯酞組的1 d組及3 d組的ANG-1表達量均明顯增加（P<0.05），且通心絡(luò)組3 d時明顯高于其他組（P<0.01）；與模型組大鼠相比，通心絡(luò)組和丁苯酞組1 d時ES的表達量明顯增加（P<0.05），3 d時明顯降低（P<0.05）。結(jié)論通心絡(luò)可明顯降低血清中Lp-PLA2的含量，有效減輕腦微血管受損程度，且能通過調(diào)節(jié)ANG-1和ES的表達量來促進后期微血管新生，達到腦保護的目的。

通心絡(luò)；急性腦梗死；脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2；腦微血管；大鼠

急性腦梗死又稱缺血性腦卒中，是最常見的腦卒中類型發(fā)病率、致殘率及死亡率均較高［1-2］。血管生成素-1（ANG-1）是機體內(nèi)特異性最高、作用力最強的促血管生成刺激因子［3］，而內(nèi)皮抑素（ES）則是作用最強的血管生成抑制劑［4］。本研究中分析了通心絡(luò)對腦梗死大鼠血清中脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2（Lp-PLA2）及與微血管中ANG-1和ES表達量的關(guān)系，探討了通心絡(luò)對急性腦梗死大鼠腦微血管的作用機制及其與ANG-1和ES蛋白表達的關(guān)系，現(xiàn)報道如下。

1　材料與方法

1.1動物、試藥與儀器

動物：選取240只健康SPF級雄性SD大鼠，平均體重為（250±20）g，動物合格證號為SCXK（JII 19），由北京維通利華有限公司提供，均按常規(guī)方法飼養(yǎng)。

試藥：通心絡(luò)膠囊（河北以嶺醫(yī)藥公司，國藥準(zhǔn)字Z19980015，規(guī)格為每粒0.26 g），給藥劑量為臨床用量的1∶8，給藥量為每日0.8 g/kg，采用0.5%的羧甲基纖維素鈉配制［5］；丁苯酞膠囊（河北石藥集團有限公司，國藥準(zhǔn)字H20050299，規(guī)格為每粒0.1g），給藥劑量為臨床用量的1∶7，給藥量為每日0.28mL/kg，采用花生油配制，均勻攪拌，充分混合［6］；一抗為兔抗山羊抗體（型號為ANG-1，abcam公司），另一個一抗為兔抗大鼠抗體（型號為ES，Millipore公司），二抗為山羊抗兔/鼠的通用試劑盒（康為世紀(jì)公司）。

儀器：AE160型電子分析天平（瑞士Mettler公司）；CH型光學(xué)顯微鏡（日本OLYMPUS公司）；SXP-1B型顯微鏡（上海醫(yī)用光學(xué)儀器廠）；Eclipse-50i型照相機（日本尼康公司）；L-550型低溫高速離心機（SIGNA公司）；Image-pro plus6.0型顯微圖像分析儀（日本尼康公司）。

1.2方法

1.2.1動物造模

對大鼠的左側(cè)大腦半球進行永久性大腦動脈栓塞，模型建好后對大鼠進行腹腔注射10%的水合氯醛溶液以使其麻醉，頸部正中作切口，將左側(cè)頸外動脈遠心端進行結(jié)扎，使大腦中動脈受阻［7］，假手術(shù)組的大鼠則僅將遠心端的動脈結(jié)扎，而不將栓線插入，最后將手術(shù)切口縫合后放入籠中進行常規(guī)飼養(yǎng)。

1.2.2分組并給藥

將大鼠按隨機平均的方法分為4組，分別為假手術(shù)組、模型組、通心絡(luò)組及丁苯酞組，每組再分為1 d組和3 d組。其中假手術(shù)組和模型組均采用生理鹽水灌胃，通心絡(luò)組采用通心絡(luò)灌胃給藥，給藥量為每日0.8 g/kg；丁苯酞組則采用丁苯酞灌胃給藥，給藥量為每日0.28mL/kg。每組均于術(shù)后6 h進行灌胃給藥，并于每日同一時間點進行重復(fù)灌胃給藥。分別于第1，3天的2個相同時間點將大鼠處死，并取材進行各項指標(biāo)檢測。

1.2.3檢測指標(biāo)

大鼠血清中Lp-PLA2活性檢測：以2μg/mL的Lp-PLA2標(biāo)準(zhǔn)品作為陽性對照，以10μL的DTNB和15μL檢測緩沖液作為空白對照，將10μL的DTNB及10μL的血漿樣品和5μL的檢測緩沖液作為樣品孔，所有檢測孔均采用復(fù)孔進行測定，混勻后每孔中再加200μL的2-Thio PAF溶液作為反應(yīng)底物，于室溫下輕搖30 s后判定結(jié)果，每1 min在酶標(biāo)儀上檢測其405 nm波長下的吸光度（OD）值，共測定5次，并繪制時間-吸光度值的關(guān)系曲線，分別計算各樣本的吸光度變化情況，根據(jù)說明書公式計算Lp-PLA2的活性。

2，3，5-氯化三苯四唑（TTC）染色法檢測腦梗死體積［8］，先將大鼠斷頭取全腦，并迅速將全腦置-20℃的冰箱內(nèi)凍存，15 min后將冠狀面均勻切為5片，每片厚約2 mm，采用TTC對切片進行染色，待染色均勻后將腦組織取出，并置含多聚甲醛液的瓶內(nèi)，固定24 h后再照相、分析和數(shù)據(jù)處理。

HE染色法觀察腦微血管形態(tài)變化［9］：將大鼠進行灌注后固定，立即取腦并將其置于4%的多聚甲醛液內(nèi)進行固定，48 h后采用石蠟進行包埋，并于視交叉前緣作5μm厚的冠狀切片，經(jīng)HE染色后，在光鏡下觀察。

ANG-1與ES的表達情況分析［10］：同上法進行切片，并采用HE進行染色，然后進行ANG-1與ES免疫組化染色，采用DAB進行顯色，將梗死區(qū)細胞的胞漿內(nèi)具有棕黃色顆粒物作為陽性標(biāo)準(zhǔn)，于20倍的光學(xué)顯微鏡進行拍照，并對圖像進行分析，計算出各個表達因子的平均OD值。

1.3統(tǒng)計學(xué)處理

2　結(jié)果

2.1血清Lp-PLA2水平

結(jié)果見表1。

2.2腦梗死體積

采用TTC進行染色后，假手術(shù)組的大鼠腦切片未出現(xiàn)白色的梗死灶，而模型組、通心絡(luò)組和丁苯酞組的切片均有不同程度的白色梗死灶。與模型組的大鼠相比，通心絡(luò)組的腦梗死體積明顯減?。≒<0.05），而丁苯酞組的腦梗死體積也有減小趨勢（P> 0.05），詳見表2。

表1　各組大鼠血清Lp-PLA2水平比較（±s，n=60）

表1　各組大鼠血清Lp-PLA2水平比較（±s，n=60）

組別模型組通心絡(luò)組丁苯酞組Lp-PLA2水平（g/L）82.4±9.7 40.4±8.0*43.5±8.8*給藥劑量等體積生理鹽水0.8 g/kg 0.2mL/kg

表2　各組大鼠腦梗死體積變化比較（±s，cm3，n=60）

表2　各組大鼠腦梗死體積變化比較（±s，cm3，n=60）

組別假手術(shù)組模型組通心絡(luò)組丁苯酞組1 d 0 0.26±0.04 0.18±0.07 0.22±0.12 3 d 0 0.20±0.03 0.17±0.05 0.18±0.04

2.3腦微血管一般形態(tài)

與假手術(shù)組大鼠相比，模型組的1 d組和3 d組梗死區(qū)的血管腔內(nèi)紅細胞呈線性排列，管腔處于閉塞狀態(tài)，管周的間隙加大并伴有嚴重水腫，半暗區(qū)的血管周圍出現(xiàn)浸潤的炎性細胞且少量已進入間隙，管周的膠質(zhì)細胞也呈水腫狀態(tài)；與模型組大鼠相比，通心絡(luò)組的腦微血管受損程度明顯減少，微血管周圍也有水腫狀態(tài)出現(xiàn)，但大鼠的缺血半暗帶、梗死區(qū)及海馬區(qū)的大部分微血管的管腔均呈開放狀態(tài)，改善了腦部血液的供給。

2.4ANG-1與ES表達

大鼠腦缺血半暗帶的血管內(nèi)皮細胞、神經(jīng)元細胞及星形膠質(zhì)細胞的胞漿內(nèi)會表達呈棕黃色的ANG-1與ES陽性顆粒。正常情況下，ANG-1的表達量較多而ES的表達量則較少。當(dāng)腦發(fā)生缺血受損時，ANG-1的表達量發(fā)生減少，從而使免疫陽性顆粒的染色變淺；ES的表達量升高而使陽性的顆粒染色變深。本研究中，與假手術(shù)組大鼠相比，模型組的1 d組大鼠中的ANG-1表達升高，ES的表達也明顯上升（P<0.05）；與模型組大鼠相比，通心絡(luò)組及丁苯酞組的ANG-1的表達量均明顯上升（P<0.05）；通心絡(luò)組大鼠的ES表達量增加，丁苯酞組的ES的表達量明顯上升（P<0.05）；與假手術(shù)組大鼠比較，模型組的3 d組的ANG-1表達量明顯降低（P<0.05），ES表達量顯著升高（P< 0.01）；與模型組大鼠相比，通心絡(luò)組的3 d組（P<0.01）和丁苯酞組（P<0.01）ANG-1的表達量均明顯上升，且通心絡(luò)組的上升更明顯。丁苯酞組的ES表達量則下降，通心絡(luò)組的ES表達量明顯下降（P<0.05）；與通心絡(luò)組l d組相比，通心絡(luò)組的3 d組的ANG-1表達量明顯升高，而ES表達量明顯下降。詳見表3。

表3　各組大鼠腦缺血半暗帶ANG-1和ES的表達量比較（±s，n=30）

表3　各組大鼠腦缺血半暗帶ANG-1和ES的表達量比較（±s，n=30）

組別假手術(shù)組模型組通心絡(luò)組丁苯酞組ANG-1（ng/mL）ES（ng/mL）1 d 0.17±0.03 0.17±0.03 0.18±0.03 0.19±0.03 3 d 0.17±0.04 0.16±0.02 0.19±0.03 0.18±0.02 1 d 0.158±0.014 0.163±0.012 0.169±0.019 0.166±0.011 3 d 0.158±0.016 0.174±0.012 0.166±0.010 0.165±0.015

3　討論

腦梗死灶是由位于腦中心的壞死區(qū)及缺血半暗帶構(gòu)成的，其中壞死區(qū)神經(jīng)元在發(fā)生腦梗死后即引發(fā)不可逆性受損，缺血半暗帶神經(jīng)元則由可逆受損發(fā)展到不可逆性損傷，并與多種因素相關(guān)，其中血氧供給的恢復(fù)是首要因素［11］。如將血流灌注及時恢復(fù)，則神經(jīng)元可恢復(fù)原有功能，反之缺血半暗帶的神經(jīng)元則會發(fā)展為不可逆壞死，此時即使血流灌注得以恢復(fù)，神經(jīng)元功能也將無法復(fù)原，甚至造成再灌注受損［12］。由此可見，促進缺血區(qū)的微血管新生對于神經(jīng)元的保護至關(guān)重要，為治療腦梗死提供了新方案。

血管新生受一定的刺激因子所調(diào)節(jié)，其中促血管生成因子表達上升或抑制因子表達下降均能促進血管的形成，其生成能力取決于2種刺激因子的動態(tài)平衡［13］。發(fā)生腦缺血后，ANG-1能促進缺血腦組織及其側(cè)支的血液循環(huán)并使血管穩(wěn)定，進而延緩了血管的退化，加強了內(nèi)皮細胞間的緊密程度，并能使血腦屏障得以完整維持，改善了缺血腦組織進行血流灌注的能力，促進了腦缺血后的神經(jīng)功能快速恢復(fù)。ES是當(dāng)前作用較強的血管再生抑制劑，能顯著抑制內(nèi)皮細胞的大量增殖及遷移，并能誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞發(fā)生凋亡，進而抑制血管的再生。通心絡(luò)還可明顯降低大鼠血清中Lp-PLA2的含量，有效降低氧化修飾的低密度脂蛋白（ox-LDL）對血管的損傷。

急性腦梗死在中醫(yī)屬“中風(fēng)”范疇，其發(fā)病機制是由于患者脈絡(luò)法閉阻，無法進行溫煦及正常的防護營衛(wèi)，進而致使氣血的滲灌失常，導(dǎo)致腦神失養(yǎng)、神機失守，臨床表現(xiàn)為神昏暈厥或半身不遂等癥狀。通心絡(luò)從腦微血管入手，進入血管內(nèi)皮對腦微環(huán)境進行調(diào)控，使神經(jīng)元的結(jié)構(gòu)及功能發(fā)生改變，改善腦缺血體征［14］。通心絡(luò)以人參作為君藥，使氣血得以旺行，并佐以如水蛭或全蝎等活血及破血的藥物，去除脈絡(luò)的血瘀，打通患處脈絡(luò)，祛瘀通血，最終表現(xiàn)為臟腑及氣血能夠濡養(yǎng)。本研究結(jié)果表明，通心絡(luò)改善了急性腦梗死大鼠的缺血半暗帶處的微血管受損，使血清中Lp-PLA2的含量下降，使腦中ANG-1的表達上升，而使腦中ES的表達下降。表明通心絡(luò)具有促進腦微血管新生的作用，大大改善了神經(jīng)功能的恢復(fù)效果。

［1］韓建科.通絡(luò)干預(yù)對過勞致血管內(nèi)皮功能障礙的保護作用研究［D］.石家莊：河北醫(yī)科大學(xué)，2011.

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Effect of Tongxinluo on Lp-PLA2in Serum and Changes of Brain M icrovessels in Acute Cerebral Infarction Rats

Liu Jun
（Department of Pharmacyl，Xiangyang Hospital Affiliated to Hubei Medical College，Xiangyang，Hubei，China 441000）

Objective To analyze the effect of Tongxinluo on Lp-PLA2in serum and changes of brain microvessels in acute cerebral infarction rats.M ethods The middle side of cerebral artery of the experimental rats was blocked so as to establish the model permanent middle cerebral artery occlusion.After the filtration，the rats were randomly divided into 4 groups，i.e.，sham-operation group，model group，Tongxinluo group and Butylphthalide group，60 rats in each group.And each of the group was divided into 2 mini groups，name the 1st day group，the 3rd day group.The cerebral infarction volume fraction was determined by TTC staining.The level of Lp-PLA2in serum were tested，the morphological structure changes of cerebral microvessels were stained by HE and were recorded，and with immune-hitochemical method to detect the level of ANG-1 and ES.Results Compared with the model group，the level of Lp-PLA2in the serum of Tongxinluo group and Butylphthalide group was obviously lower，the cerebral infarction volume was reduced and the infarction size was significantly reduced，the water level of brain tissue was dropped obviously.Compared with the model group，the ANG-1 expression of Tongxinluo group and Butylphthalide group were increased at the first and third day（P<0.05），and the 3rd day Tongxinluo group was the most increased（P<0.01）.Compared with the model group，the level of ES expression of the 1st day，the Tongxinluo group increased strongly，the 3rd day of Butylphthalide group was significantly higher（P<0.05），the 3rd day of Butylphthalide group was decreased，the 3rd day of the Tongxinluo group was significantly lower（P<0.05）.Conclusion Tongxinluo can reduce the level of cerebral microvessels lesions.And it shows obvious protective effects on angiogenesis by regulating the expression level of ANG-1 and ES.

Tongxinluo；acute cerebral infarction；Lp-PLA2；angiogenesis；rats

R285.6；R286

A

1006-4931（2015）24-0094-03

劉軍（1973-），男，回族，湖北谷城人，副主任藥師，研究方向為醫(yī)院藥學(xué)，（電子信箱）2330123732@qq.com。

2015-07-23）