M ntH與含錳過氧化氫酶共表達(dá)基因工程菌的構(gòu)建與發(fā)酵優(yōu)化

王慧崔云風(fēng)劉巖史吉平趙志軍王紹明

（1.石河子大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，石河子　832000；2.中國科學(xué)院上海高等研究院，上海　201210）

M ntH與含錳過氧化氫酶共表達(dá)基因工程菌的構(gòu)建與發(fā)酵優(yōu)化

王慧1崔云風(fēng)1劉巖2史吉平2趙志軍2王紹明1

（1.石河子大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，石河子832000；2.中國科學(xué)院上海高等研究院，上海201210）

構(gòu)建Mn2+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白MntH與來源于Thermus thermophilus HB27的含錳過氧化氫酶的共表達(dá)基因工程菌，并進(jìn)行了發(fā)酵培養(yǎng)基及培養(yǎng)環(huán)境條件的優(yōu)化，確定培養(yǎng)基中最佳的碳氮源種類及其濃度分別為：甘油 7.0 g/L，酵母粉 3.75 g/L和蛋白胨 11.25 g/L；當(dāng)培養(yǎng)基中的Mn2+濃度為1 mmol/L時(shí)，最佳的IPTG誘導(dǎo)濃度為0.05 mmol/L。此外，最佳的培養(yǎng)基初始pH值及培養(yǎng)溫度分別為：pH 8.0和37℃，在最優(yōu)發(fā)酵條件下工程菌搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)24 h，過氧化氫酶活最高可達(dá)476 U/mL是未優(yōu)化前3倍。在5 L發(fā)酵罐的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)中，過氧化氫酶的酶活進(jìn)一步提高至1 094 U/mL。

錳過氧化氫酶；轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白；共表達(dá)；發(fā)酵優(yōu)化

過氧化氫酶（Catalase，簡稱CAT），催化H2O2分解為H2O和O2。目前CAT已廣泛應(yīng)用于食品、紡織、造紙和醫(yī)藥等行業(yè)，其中在紡織染整工藝中主要用于織物漂白后殘余H2O2的消除，與傳統(tǒng)化學(xué)工藝相比，具有環(huán)境友好、面料后續(xù)印染質(zhì)量高等優(yōu)點(diǎn)［1］。但值得注意的是，印染工序通常是在高溫（T＞70℃）堿性（pH＞9）的環(huán)境中進(jìn)行的，這就需要CAT具備嗜熱嗜堿的應(yīng)用特性。而目前市場上仍缺乏具備優(yōu)良紡織應(yīng)用特性的CAT［2］。

CAT按蛋白催化中心的結(jié)構(gòu)差異可分為兩類：（1）含鐵卟啉結(jié)構(gòu)CAT，又稱鐵過氧化氫酶（FeCAT）；（2）由錳離子代替鐵離子的卟啉結(jié)構(gòu)，又稱錳過氧化氫酶（MnCAT）［3］。盡管目前已發(fā)現(xiàn)的CAT中85%以上屬于FeCAT，但近年來研究發(fā)現(xiàn)個(gè)別來源于高溫堿性環(huán)境中古細(xì)菌的MnCAT具有嗜熱嗜堿的優(yōu)良特性［4-8］。例如，本實(shí)驗(yàn)室在前期研究中首次實(shí)現(xiàn)了Thermus thermophius HB27來源的MnCAT在大腸桿菌中的異源活性表達(dá)，酶學(xué)性質(zhì)研究表明，該Mn-CAT在80℃保溫2 h，酶活力不損失；在pH 9.0-11.0的環(huán)境中放置2 h，殘留酶活在90%以上，具有良好的工業(yè)應(yīng)用潛力［9］。但同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)，該菌株在發(fā)酵過程中需添加終濃度為14 mmol/L MnCl2，產(chǎn)酶量才達(dá)到最高值25 U/mL［9］。由于MnCAT的蛋白活性中心含有兩個(gè)Mn2+，因此在培養(yǎng)基中添加Mn2+，對(duì)MnCAT三維結(jié)構(gòu)的正確折疊具有關(guān)鍵作用。然而過高濃度的Mn2+也會(huì)對(duì)菌體生長產(chǎn)生抑制作用，影響到后續(xù)的正常發(fā)酵；在這種情況下，通過共表達(dá)Mn2+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白MntH提高M(jìn)n2+的吸收速率，從而降低蛋白表達(dá)對(duì)培養(yǎng)基中高濃度Mn2+的需求，可能成為一種解決方案，因此本研究進(jìn)一步構(gòu)建MntH與MnCAT的共表達(dá)基因工程菌E. coli BL21（DE3）/pET28a-MnCAT/pACYC-mntH；同時(shí)，考察共表達(dá)MntH蛋白后培養(yǎng)基中Mn2+濃度變化對(duì)MnCAT活性表達(dá)的影響。此外，在搖瓶水平上還對(duì)該菌株的發(fā)酵培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，并在5 L發(fā)酵罐中進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒 重組大腸桿菌E. coli BL21（DE3）/pET28a-MnCAT/pACYC-mntH，標(biāo)記為EC-01，由實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建保藏。

1.1.2 培養(yǎng)基 LB培養(yǎng)基（g/L）：蛋白胨10，酵母粉5，氯化鈉10。添加1.5%瓊脂為LB固體培養(yǎng)基。初始發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：甘油 10，蛋白胨 10，酵母粉 5，K2HPO412.54，KH2PO42.31，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01，MgSO4·7H2O 0.5。

1.1.3 試劑 異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）、卡那霉素（Kan）和氯霉素（Cm）等試劑購自上海生工生物工程有限公司；酵母粉、蛋白胨購自O(shè)xoid（英國）公司。其它試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.4引物根據(jù)NCBI 數(shù)據(jù)庫中E. coli BL21（DE3）全基因組序列中的mntH基因序列設(shè)計(jì)引物，上游引物mntH_F為：5'-CATATGACGAACTA TCGCGTTGAGAGTAGC-3'（下劃線部分為限制性內(nèi)切酶Nde I的識(shí)別序列）；下游引物mntH_R為：5'-CTCGAGCTACAATCCCAGCGCCGTC-3'（下劃線部分為限制性內(nèi)切酶Xho I的識(shí)別序列），引物由上海生工生物工程有限公司合成純化。

1.2 方法

1.2.1 重組表達(dá)質(zhì)粒pACYC-mntH的構(gòu)建與鑒定 以E. coli BL21（DE3）的基因組DNA為模板，利用引物mntH_F和mntH_R，PCR擴(kuò)增基因mntH的DNA片段；割膠回收PCR產(chǎn)物，體外連接至載體pMD18-T，轉(zhuǎn)化至菌株E. coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞；挑選陽性克隆，提取質(zhì)粒pMD18-mntH，酶切，電泳鑒定后，由上海生工生物工程有限公司測序，對(duì)測序結(jié)果進(jìn)行分析。

質(zhì)粒pMD18-mntH經(jīng)Nde I/Xho I雙酶切后，與同樣經(jīng)Nde I/Xho I雙酶切的載體pACYCDuet-1 DNA片段進(jìn)行體外T4連接，轉(zhuǎn)化至菌株E. coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞；挑選陽性克隆，提取質(zhì)粒，雙酶切電泳鑒定后，送至上海生工生物工程有限公司測序，對(duì)測序結(jié)果進(jìn)行分析。

1.2.2 培養(yǎng)方法 種子培養(yǎng)：取100 μL 保藏于-80℃甘油管中的菌液接入含35 μg/mL Kan和12.5 μg/mL Cm的LB培養(yǎng)基中（50 mL培養(yǎng)基/250 mL三角瓶），于37℃，200 r/min培養(yǎng)8-10 h。

發(fā)酵培養(yǎng)：將培養(yǎng)8-10 h的種子以5%的接種量接入含35 μg/mL Kan和12.5 μg/mL Cm的發(fā)酵培養(yǎng)基（100 mL培養(yǎng)基/500 mL三角瓶），在37℃、200 r/min培養(yǎng)24 h。

發(fā)酵罐培養(yǎng)：5 L發(fā)酵罐中裝發(fā)酵培養(yǎng)基2.5 L，接種量10%，溫度37℃，初始攪拌轉(zhuǎn)速300 r/min，自動(dòng)流加氨水控制pH值在7.0，發(fā)酵過程中通過調(diào)控?cái)嚢柁D(zhuǎn)速和通風(fēng)量控制溶氧（DO）為30%。

1.2.3 錳過氧化氫酶酶活的測定 參考文獻(xiàn)［10］，取1 mL發(fā)酵液于12 000 r/min離心3 min，收集菌體，用50 mmol/L pH8.0的Tris-HCl緩沖液洗滌兩次，重懸于1 mL相同緩沖液中，超聲破碎10 min（開5 s，關(guān)9 s）后，離心所得上清液即為粗酶液。

采用分光光度法37℃測定CAT的酶活力，反應(yīng)體積為3 mL，包括0.1 mL的酶液樣品和2.9 mL含10 mmol/L H2O2的50 mmol/L pH 8.0 Tris-HCl緩沖液，H2O2的分解速率用紫外分光光度計(jì)在240 nm下測定。酶活活力單位（U/mL）的定義為：在37℃、pH 8.0的條件下每分鐘分解1 μmol H2O2所需的CAT酶量為一個(gè)酶活單位。

2 結(jié)果

2.1 重組質(zhì)粒pACYC-mntH的構(gòu)建及驗(yàn)證

在轉(zhuǎn)化平板上挑選單菌落，培養(yǎng)過夜后提取質(zhì)粒pMD18-mntH，用限制性內(nèi)切酶Nde I和Xho I進(jìn)行雙酶切，得到長度分別約為1 241 bp和2 699 bp的兩個(gè)片段，大小與預(yù)期值相符，測序結(jié)果顯示與NCBI數(shù)據(jù)庫中的mntH基因序列一致，表明重組質(zhì)粒pMD18-mntH構(gòu)建正確。

利用限制性內(nèi)切酶Nde I和Xho I分別雙酶切質(zhì)粒pMD18-mntH和pACYCDuet-1，連接轉(zhuǎn)化后在平板上挑選單菌落，培養(yǎng)過夜后提取質(zhì)粒，進(jìn)行雙酶切鑒定。如圖1所示，DNA凝膠電泳的結(jié)果與預(yù)期值相符，表明重組質(zhì)粒pACYC-mntH構(gòu)建正確。重組表達(dá)質(zhì)粒pACYC-mntH物理圖譜，見圖2所示。

圖1 重組質(zhì)粒pACYC-mntH經(jīng)Nde I/Xho I雙酶切的瓊脂糖凝膠電泳

圖2 重組質(zhì)粒pACYC-mntH的物理圖譜

2.2 mntH和MnCAT共表達(dá)基因工程菌的構(gòu)建

菌株E. coli DH5α/pACYC-mntH在含Cm抗性的LB培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，提取質(zhì)粒pACYC-mntH，并將其轉(zhuǎn)化至E. coli BL21（DE3）/pET28a-MnCAT的感受態(tài)細(xì)胞中，從而獲得 mntH和MnCAT共表達(dá)基因工程菌BL21（DE3）/pET28a-MnCAT/pACYC-mntH，標(biāo)記為EC-01。如圖3所示，SDS-PAGE分析驗(yàn)證MntH與MnCAT共表達(dá)，蛋白大小與理論值或文獻(xiàn)［8］報(bào)道一致。

圖3 重組大腸桿菌EAC-01的SDS-PAGE分析

2.3 基因工程菌的發(fā)酵優(yōu)化

將基因工程菌EC-01在LB培養(yǎng)基中活化過夜后，按5%轉(zhuǎn)接至含有含35 μg/mL Kan和12.5 μg/mL Cm的發(fā)酵初始培養(yǎng)基中，對(duì)發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，考察培養(yǎng)基中的Mn2+添加量、碳氮源、誘導(dǎo)條件、培養(yǎng)溫度、初始pH值等對(duì)基因工程菌發(fā)酵產(chǎn)MnCAT的影響。

2.3.1 Mn2+添加量對(duì)重組菌發(fā)酵產(chǎn)MnCAT的影響 適量Mn2+的存在是MnCAT蛋白晶體正確三維構(gòu)象的必要條件，但當(dāng)Mn2+濃度過高時(shí)會(huì)抑制菌株的生長。在本研究中，當(dāng)菌株EC-01在發(fā)酵培養(yǎng)基中生長至OD6000.8-1時(shí)，添加0.1 mmol/L IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，同時(shí)在培養(yǎng)基中分別填加0、1、2、4、6、8、10、12、14和16 mmol/L MnCl2，考察不同Mn2+濃度對(duì)重組菌發(fā)酵產(chǎn)MnCAT的影響。

如圖4所示，當(dāng)培養(yǎng)液中的Mn2+濃度范圍為1-6 mmol/L 時(shí)，重組菌發(fā)酵產(chǎn)MnCAT的活力較高，其中當(dāng)Mn2+添加終濃度1 mmol/L時(shí)，最終所測得CAT酶活力可達(dá)158 U/mL，且在1-6 mmol/L Mn2+濃度范圍內(nèi)，菌體的生長量基本相同。本研究在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中選擇1 mmol/L低濃度的Mn2+添加量。

圖4 M n2+濃度對(duì)重組菌生長及產(chǎn)M nCAT的影響

2.3.2 碳源對(duì)重組菌發(fā)酵產(chǎn)MnCAT的影響 碳源是菌體合成自身骨架的主要物質(zhì)，是影響菌體生長和外源基因表達(dá)的關(guān)鍵因素之一。本實(shí)驗(yàn)中菌株EC-01在碳源分別為總摩爾數(shù)相同（以10 g/L的甘油為基準(zhǔn)）的可溶性淀粉、蔗糖、乳糖、葡萄糖、麥芽糖和甘油培養(yǎng)基中培養(yǎng)，考察不同碳源對(duì)發(fā)酵產(chǎn)MnCAT的影響。

如圖5所示，菌株EC-01對(duì)6種碳源的利用情況差異較大，當(dāng)分別以甘油、葡萄糖、可溶性淀粉為單一碳源時(shí)，菌體培養(yǎng)24 h后的生長量均較高，麥芽糖次之，而蔗糖為碳源時(shí)菌體生長量最低；就產(chǎn)酶情況而言，以甘油為碳源時(shí)，檢測到的CAT酶活力最高，乳糖和蔗糖次之，因此確定甘油為最佳碳源。在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步考察了不同甘油濃度對(duì)菌體生長和產(chǎn)酶的影響。

圖5 碳源種類對(duì)重組菌生長及產(chǎn)MnCAT的影響

由圖6所示，當(dāng)甘油濃度為7 g/L時(shí)，檢測到的酶活力最高，達(dá)到183 U/mL；隨著甘油添加量的增加，菌體的生長量緩慢降低，產(chǎn)酶量也呈下降趨勢。

圖6 甘油濃度對(duì)重組菌生長及產(chǎn)M nCAT的影響

2.3.3 氮源對(duì)重組菌發(fā)酵產(chǎn)MnCAT的影響 菌株EC-01以甘油為碳源，分別以總氮摩爾數(shù)相同（以初始培養(yǎng)基中的蛋白胨10 g/L和酵母粉5 g/L為基準(zhǔn)）的NH4Cl、（NH4）2SO4、NaNO3、尿素、蛋白胨、酵母粉和玉米漿作為氮源，考察不同氮源對(duì)發(fā)酵產(chǎn)MnCAT的影響。

圖7 氮源種類對(duì)重組菌生長及產(chǎn)MnCAT的影響

由圖7所示，以蛋白胨為氮源時(shí)菌體的產(chǎn)酶量較高；而當(dāng)以酵母粉為氮源時(shí)，菌體的生長量最大；對(duì)照培養(yǎng)基中采用蛋白胨和酵母粉復(fù)合氮源，此時(shí)菌體的生長量和MnCAT產(chǎn)量均比較高；而以其它物質(zhì)作為單一氮源時(shí)，菌體的生長量和產(chǎn)酶量均受到嚴(yán)重影響。在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步考察了在質(zhì)量總量相同的情況下，考察了不同比例的酵母粉∶蛋白胨配比（1∶1，1∶2，1∶3，1∶4，1∶5）對(duì)菌體生長和產(chǎn)酶的影響。

由圖8所示，當(dāng)酵母粉和蛋白胨的復(fù)配比例為1∶1時(shí)，菌體的生長量最高；而當(dāng)酵母粉和蛋白胨的復(fù)配比例為1∶3時(shí)，菌體的產(chǎn)酶量最高，檢測酶活可達(dá)223 U/mL，是對(duì)照復(fù)配比1∶2條件下的1.2倍。綜合考慮，在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中選擇酵母粉和蛋白胨的復(fù)配比例為1∶3。

圖8 酵母粉和蛋白胨復(fù)配比例對(duì)重組菌生長及產(chǎn)M nCAT的影響

2.3.4 IPTG濃度對(duì)重組菌發(fā)酵產(chǎn)MnCAT的影響 IPTG作為誘導(dǎo)劑，其濃度對(duì)重組蛋白的合成速率和表達(dá)水平具有重要影響，本實(shí)驗(yàn)選擇IPTG誘導(dǎo)濃度分別為0.02、0.05、0.08、0.1、0.15、0.3、0.5 mmol/L，考察IPTG濃度對(duì)發(fā)酵產(chǎn)MnCAT的影響。

由圖9所示，盡管隨著IPTG濃度的增加，MnCAT的誘導(dǎo)表達(dá)強(qiáng)度會(huì)逐漸增強(qiáng)，但I(xiàn)PTG對(duì)菌體的毒性作用也逐漸顯現(xiàn)；當(dāng)IPTG濃度大于0.05 mmol/L時(shí)，菌體的生長量和產(chǎn)酶量均開始下降，因此，最佳的IPTG誘導(dǎo)濃度為0.05 mmol/L。

圖9 IPTG濃度對(duì)重組菌生長及產(chǎn)MnCAT的影響

2.3.5 初始誘導(dǎo)菌體濃度對(duì)重組菌發(fā)酵產(chǎn)MnCAT的影響 由于IPTG具有一定的生理毒性，添加至培養(yǎng)基中時(shí)會(huì)對(duì)菌體的正常生理代謝活動(dòng)產(chǎn)生影響，因此在添加IPTG前，先讓菌體生長至一定菌濃，將有助于重組酶的活性表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)分別選取菌株生長至OD600為1、5、10時(shí)，添加0.05 mmol/L IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，這3個(gè)OD600值分別處于菌體生長的延滯期、對(duì)數(shù)生長前期和對(duì)數(shù)生長后期。

由圖10所示，改變初始誘導(dǎo)菌體濃度后，菌體的生長量變化不大，但對(duì)菌體的產(chǎn)酶量影響顯著。當(dāng)初始誘導(dǎo)菌體濃度為5時(shí)，檢測到CAT酶活值達(dá)到378 U/mL，是對(duì)照條件下（初始誘導(dǎo)菌體濃度為1）時(shí)1.7倍，可見在對(duì)數(shù)生長前期進(jìn)行IPTG誘導(dǎo)發(fā)酵，產(chǎn)酶效果最佳。

圖10 初始誘導(dǎo)菌體濃度對(duì)重組菌發(fā)酵生產(chǎn)MnCAT的影響

2.3.6 溫度對(duì)重組菌發(fā)酵生產(chǎn)MnCAT的影響 當(dāng)重組菌EC-01在37℃培養(yǎng)至OD600約為5時(shí)，添加0.05 mmol/L IPTG，分別選擇25℃、30℃、37℃和42℃誘導(dǎo)培養(yǎng)，考察不同誘導(dǎo)溫度對(duì)重組菌發(fā)酵生產(chǎn)MnCAT的影響。

如圖11所示，當(dāng)采用37℃進(jìn)行誘導(dǎo)發(fā)酵時(shí)，菌株的產(chǎn)酶量最高，酶活分別是30℃和42℃的4.1倍和1.2倍；當(dāng)采用25℃進(jìn)行誘導(dǎo)發(fā)酵時(shí)，菌株基本不產(chǎn)MnCAT。

2.3.7 初始pH值對(duì)重組菌發(fā)酵生產(chǎn)MnCAT的影響 改變發(fā)酵培養(yǎng)基的初始pH，從而考察不同初始pH對(duì)菌體生長和產(chǎn)酶的影響。如圖12所示，當(dāng)初始培養(yǎng)基pH為8時(shí)，菌體的生長量和產(chǎn)酶量均最高，檢測酶活性可達(dá)476 U/mL。

圖11 誘導(dǎo)溫度對(duì)重組菌發(fā)酵生產(chǎn)M nCAT的影響

圖12 初始pH對(duì)重組菌發(fā)酵生產(chǎn)M nCAT的影響

2.4 E. coli EC-01在發(fā)酵罐中的發(fā)酵產(chǎn)酶過程

根據(jù)搖瓶發(fā)酵優(yōu)化的最佳營養(yǎng)及環(huán)境條件，選擇在5 L發(fā)酵罐中進(jìn)行驗(yàn)證；發(fā)酵過程中當(dāng)初始碳源耗盡后，采用pH-stat方式進(jìn)行了甘油的流加。如圖13所示，在發(fā)酵0-6 h，菌株生長處于延滯期，之后菌體進(jìn)入對(duì)數(shù)生長期；當(dāng)在對(duì)數(shù)生長期前期添加IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)后，MnCAT開始大量合成，在發(fā)酵12-18 h期間MnCAT快速增加，之后進(jìn)入緩慢增加的狀態(tài)，當(dāng)發(fā)酵30 h時(shí)，菌體的產(chǎn)酶量最高，檢測酶活性可達(dá)1 094 U/mL；在發(fā)酵30 h以后，菌體進(jìn)入穩(wěn)定期；在發(fā)酵41 h后，菌體生長進(jìn)入了衰退期。

圖13 重組菌株EC-01發(fā)酵產(chǎn)M nCAT的過程曲線

3 討論

高溫嗜堿過氧化氫酶是紡織工業(yè)清潔生產(chǎn)的一種重要酶制劑，其菌種選育一直受到研究者的關(guān)注。目前，文獻(xiàn)報(bào)道的CAT主要以FeCAT為主，其酶學(xué)性質(zhì)隨篩選環(huán)境的不同而顯示差異。例如，趙志軍等［10］從堿性紡織廢水中篩選獲得了產(chǎn)過氧化氫酶菌株 Bacillus subtilis WSHDZ-01，其所產(chǎn)CAT的最適pH范圍為pH 9.0-11.0，但最適溫度范圍為30-50℃，屬于中溫嗜堿酶。而Zeng等［11，12］篩選獲得一株產(chǎn)CAT的沙雷氏菌SYBC08，其所產(chǎn)CAT的最適溫度范圍為50-70℃，但最適pH范圍為pH 6.0-8.0屬中性酶。與這些FeCAT相比，一些來源于火山口古細(xì)菌的MnCAT具有良好的嗜熱嗜堿特性。例如，來源于Metallosphaera hakonensis和Thermus thermophius的MnCAT的最適pH最適溫度均能滿足紡織印染工序環(huán)境條件（T＞70℃，pH＞9）的要求［7，8］。

值得的注意的是，盡管上述MnCAT的具有良好的酶學(xué)特性，但該類酶目前報(bào)道的酶活值最高僅為20-25 U/mL［9］，而已報(bào)道的FeCAT酶活值最高可達(dá)50 369 U/mL［13］，這主要是由于該類MnCAT的原始菌株篩選至火山口等惡劣環(huán)境中，原始菌株的規(guī)?；囵B(yǎng)存在困難，而其基因工程菌的構(gòu)建與發(fā)酵優(yōu)化方面的研究才剛剛起步［6］。本研究結(jié)果表明，當(dāng)Mn2+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白MntH與來源于Thermus thermophilus HB27的MnCAT的進(jìn)行共表達(dá)時(shí)，培養(yǎng)基中添加少量的Mn2+就可以滿足MnCAT蛋白正確折疊的需求；而同時(shí)隨著培養(yǎng)液中Mn2+濃度的降低，可大幅降低Mn2+對(duì)菌體正常生長的抑制作用，為后續(xù)的發(fā)酵條件優(yōu)化研究奠定基礎(chǔ)。通過搖瓶培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件的優(yōu)化，菌株的產(chǎn)酶量達(dá)到可達(dá)476 U/mL，是優(yōu)化前（158 U/mL）的3倍，是單獨(dú)表達(dá)MnCAT時(shí)酶活（25 U/mL）的19倍；當(dāng)將搖瓶最佳培養(yǎng)基及最佳培養(yǎng)條件在5 L發(fā)酵罐中進(jìn)行驗(yàn)證時(shí)，MnCAT的酶活值進(jìn)一步提高至1094 U/mL，為目前文獻(xiàn)報(bào)道的大腸桿菌表達(dá)該類嗜熱耐堿含錳過氧化氫酶的最高酶活水平。這些研究成果表明該類高溫嗜堿MnCAT基因工程菌在發(fā)酵優(yōu)化方面仍有較大的提升潛力。

4 結(jié)論

本研究成功構(gòu)建了Mn2+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白MntH與MnCAT共表達(dá)的大腸桿菌基因工程菌，使得MnCAT在低濃度Mn2+培養(yǎng)液中實(shí)現(xiàn)了高效活性表達(dá)；通過單因素實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步優(yōu)化了發(fā)酵培養(yǎng)基組分和發(fā)酵環(huán)境條件，大幅提高了MnCAT的表達(dá)活性，增強(qiáng)了該酶的應(yīng)用前景。

［1］ 張東旭， 堵國成， 陳堅(jiān). 微生物過氧化氫酶的發(fā)酵生產(chǎn)及其在紡織工業(yè)的應(yīng)用［J］. 生物工程學(xué)報(bào)， 2010， 26（11）：1473-1481.

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［13］ 周麗萍， 過氧化氫酶基因工程菌的構(gòu)建與發(fā)酵優(yōu)化［D］. 無錫：

江南大學(xué)， 2011.

（責(zé)任編輯 李楠）

Construction of Co-expressed M ntH and M n-catalase Gene in Escherichia coli and Optim ization of Fermentation Conditions

Wang Hui1Cui Yunfeng1Liu Yan2Shi Jiping2Zhao Zhijun2Wang Shaoming1
（1. College of Life Science，Shihezi University，Shihezi832000；2. Shanghai Advanced Research Institute of Chinese Academy of Sciences，Shanghai201210）

Mn-catalase from Thermus thermophilus HB27 and Mn2+transport protein MntH from Escherichia coli were co-expressed in E. coli BL21（DE3）. The optimization of fermentation medium and environment for the production of Mn-catalase was carried out at the shake flask level. The optimal carbon and nitrogen source were 7.0 g/L glycerine， 3.75 g/L yeast extract and 11.25 g/L peptone respectively. The optimum induced concentration of IPTG was 0.05 mmol/L while the Mn2+in media was 1 mmol/L. In addition， the optimal initial pH of the medium and culture temperature were pH 8.0 and 37℃ respectively. Under the optimal conditions， the maximal activity of catalase reached 476 U/mL， which was 3-fold of the control. Finally， in a 5 L fermentor the activity of catalase increased to 1 094 U/mL.

Mn-catalase；transport protein；co-expression；optimization of fermentation

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.09.026

2015-01-06

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（31300048）

王慧，女，碩士，研究方向：酶學(xué)；E-mail：wanghui2014xy@126.com

王紹明，男，博士，研究方向：生態(tài)學(xué)；E-mail：westwild@vip.sina.com