檀香炭疽病拮抗細(xì)菌的分離篩選及鑒定

田媛媛 周國(guó)英 左杰 劉倩麗 楊權(quán)

（中南林業(yè)科技大學(xué)　經(jīng)濟(jì)林培育與保護(hù)省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長(zhǎng)沙　410004）

檀香炭疽病拮抗細(xì)菌的分離篩選及鑒定

田媛媛 周國(guó)英 左杰 劉倩麗 楊權(quán)

（中南林業(yè)科技大學(xué)經(jīng)濟(jì)林培育與保護(hù)省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長(zhǎng)沙410004）

旨在從海南省國(guó)營(yíng)澄邁林場(chǎng)的土壤中篩選出對(duì)檀香炭疽病具有較強(qiáng)生防效果的拮抗細(xì)菌。采集澄邁林場(chǎng)檀香不同種植區(qū)中優(yōu)良單株的根際土壤，通過稀釋平板法從中分離出71株細(xì)菌，以檀香炭疽病原菌為靶標(biāo)菌，通過平板對(duì)峙法初篩和發(fā)酵液法復(fù)篩，獲得一株具較強(qiáng)拮抗效果的細(xì)菌，編號(hào)為TXJ2-6；抗菌譜測(cè)定表明，該拮抗菌株對(duì)降香黃檀炭疽病、油茶軟腐病、油茶葉枯病、油茶根腐病、油茶炭疽病5種病原真菌也具有明顯拮抗效果；通過形態(tài)學(xué)觀察、生理生化特性及16S rDNA序列分析，鑒定該拮抗菌株為甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌（Bacillus methylotrophicus）。

檀香；炭疽病；拮抗細(xì)菌；篩選；鑒定

檀香（Santalum album Linn.）隸屬于檀香科檀香屬，是一種半寄生小喬木，其用途廣泛，經(jīng)濟(jì)價(jià)值極高，是世界上最昂貴的木材之一。檀香集芳香、藥用、材用于一身，被譽(yù)為“綠色金子”、“香料之王”［1］。目前，為滿足我國(guó)國(guó)內(nèi)的需求，并且經(jīng)過多年栽培推廣，在廣東、海南、四川、云南、廣西、福建及浙江等地引種栽培了一定規(guī)模的檀香［2-6］。海南省在開展了“綠化寶島”大行動(dòng)后，檀香的人工林種植面積明顯增加［7］。然而2013年在對(duì)海南省檀香病蟲害調(diào)查結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，檀香的主要病害有炭疽病、苗木立枯病、煤污病、根腐病、白粉病等，其中炭疽病是危害檀香幼樹生長(zhǎng)的主要病害，并且在近年趨重發(fā)生。發(fā)病初期葉片會(huì)出現(xiàn)紫色或紫褐色病斑，嚴(yán)重時(shí)導(dǎo)致檀香葉片大量提前落葉，對(duì)檀香的健康生長(zhǎng)造成嚴(yán)重影響，因此對(duì)檀香病害的研究與防治具有重要意義。

目前主要通過化學(xué)殺菌劑控制該病害，這種方法容易導(dǎo)致病原菌抗藥性，甚至?xí)廴经h(huán)境。生物制劑具有無污染，無公害，無殘留，不易形成抗性等特點(diǎn)［8］，也是當(dāng)今國(guó)內(nèi)外病害防控研究的熱點(diǎn)。應(yīng)用拮抗微生物防治檀香炭疽病害在國(guó)內(nèi)外尚未有報(bào)道，本研究擬從檀香優(yōu)良單株根際土壤中分離篩選出有效控制檀香炭疽病的生防細(xì)菌，以期為檀香炭疽病的生物防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試病原菌 檀香炭疽病的病原菌（Colletotrichum fructicola），編號(hào)SA-2，由本實(shí)驗(yàn)室分離鑒定并保存。供試5種病原菌，即降香黃檀炭疽病、油茶葉枯病菌、油茶軟腐病菌、油茶根腐病和油茶炭疽病，均由經(jīng)濟(jì)林培育與保護(hù)省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.2 土樣來源 海南省國(guó)營(yíng)澄邁林場(chǎng)，采集不同種植區(qū)中檀香優(yōu)良單株的根際土壤，編號(hào)封存于封口袋中，帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行細(xì)菌的分離。

1.1.3 供試培養(yǎng)基 PDA培養(yǎng)基［9］（用于植物病原真菌培養(yǎng)及菌株拮抗效果測(cè)定）：馬鈴薯 200.0 g，葡萄糖 20.0 g，瓊脂 15.0-20.0 g，蒸餾水1 000 mL；NA培養(yǎng)基［10］（用于拮抗細(xì)菌分離純化培養(yǎng)）：蛋白胨 10.0 g，牛肉浸膏 5.0 g，瓊脂15.0-20.0 g，蒸餾水 1 000 mL，pH7.2-7.4；NB培養(yǎng)基［11］（用于拮抗細(xì)菌液體培養(yǎng)）：蛋白胨 10.0 g，牛肉浸膏 5.0 g，蒸餾水 1 000 mL，pH7.2-7.4。

1.2 方法

1.2.1 根際細(xì)菌的分離 稱取檀香優(yōu)良單株的新鮮根際土樣10.0 g放入裝有90 mL無菌水并帶有玻璃珠的三角瓶中，搖床振蕩20 min，制成土壤懸液（10-1）。從中取1 mL土壤懸液注入盛有9 mL無菌水的試管中，吹吸3次，振蕩混勻（10-2）。依此類推制成10-3、10-4、10-5、10-6和10-7各種稀釋度的土壤溶液備用。

分別吸取上述不同稀釋度的土壤溶液 0.1 mL 至準(zhǔn)備好的NA平板上，均勻涂布。細(xì)菌一般培養(yǎng)溫度為35-37℃，故選擇35℃下進(jìn)行恒溫培養(yǎng)，48 h后記錄菌量，然后根據(jù)菌落形態(tài)、顏色、透明度、邊緣、干濕等特征，挑取性狀不同的菌落，在NA平板上進(jìn)行劃線純化、編號(hào)、培養(yǎng)，再4℃保存?zhèn)溆茫?2，13］，共分離3個(gè)批次的生防細(xì)菌。分離出的細(xì)菌于28℃和35℃下均可正常生長(zhǎng)。

1.2.2 拮抗菌的篩選 采用平板對(duì)峙法［14］初篩，在PDA平板中央接直徑6 mm的供試病原菌菌塊，在距菌塊3 cm處對(duì)角線接種土壤中已分離純化的細(xì)菌菌株，以只接種病原菌菌塊為對(duì)照。每組設(shè)置3個(gè)重復(fù)，在28℃恒溫培養(yǎng)，5 d后觀測(cè)抑菌圈大小，篩選出對(duì)檀香炭疽病菌有抑制作用的拮抗細(xì)菌。

采用發(fā)酵液法［15］復(fù)篩，將6種初篩選出的拮抗菌株培養(yǎng)2 d后接種到50 mL NA培養(yǎng)液的三角瓶（250 mL）中，30℃、160 r/min搖床振蕩培養(yǎng)48 h。發(fā)酵液經(jīng)0.22 μm細(xì)菌過濾器過濾得到發(fā)酵濾液，將濾液與PDA 培養(yǎng)基按 1∶19混勻后倒平板，中央接檀香炭疽病原菌，以蒸餾水代替濾液為對(duì)照。每組設(shè)置3個(gè)重復(fù)，28℃恒溫培養(yǎng)，5 d后觀測(cè)抑菌圈大小。

1.2.3 拮抗細(xì)菌抗菌譜的測(cè)定 采用平板對(duì)峙法，在離病原菌菌塊中心 3 cm 處對(duì)角線接種4點(diǎn)待測(cè)拮抗細(xì)菌，以中央接病原菌作對(duì)照；28℃恒溫培養(yǎng)6 d。每處理 3 次重復(fù)。測(cè)量病原菌菌落直徑和抑菌帶寬度，計(jì)算拮抗菌對(duì)各供試病菌的抑菌率。

抑制率（%）=［（對(duì)照組菌落直徑-處理組菌落直徑）/（對(duì)照組菌落直徑-原菌餅直徑）］×100%

1.2.4 拮抗菌株的鑒定

1.2.4.1 形態(tài)特征 拮抗細(xì)菌經(jīng)無菌水稀釋適當(dāng)濃度后，接種于NA 培養(yǎng)基上，于35℃恒溫培養(yǎng)2-3 d，長(zhǎng)出單菌落后，觀察記錄菌落形態(tài)［10］。同時(shí)，對(duì)菌體進(jìn)行革蘭氏染色，顯微鏡下觀察其菌體形態(tài)以及大小。

1.2.4.2 生理生化特性測(cè)定 參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》［16］和《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》［17］的方法，進(jìn)行拮抗細(xì)菌常規(guī)生理生化反應(yīng)測(cè)定。

1.2.4.3 分子生物學(xué)鑒定 將培養(yǎng)3 d的拮抗菌株接種到40 mL NB培養(yǎng)液的三角瓶（100 mL）中，于35℃、160 r/min，恒溫振蕩培養(yǎng)48 h后制成菌體懸浮液，離心收集菌體，采用常規(guī)CTAB法［18］用DNA提取試劑盒（北京天根生化科技有限公司）提取病原菌基因組DNA。采用細(xì)菌通用引物27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）和1492R（5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'）對(duì)提取的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

將擴(kuò)增后的DNA產(chǎn)物送至上海生工生物有限公司進(jìn)行純化測(cè)序。并且把測(cè)序結(jié)果與GenBank中的序列進(jìn)行blast比對(duì)。以16S rDNA相似序列，利用MEGA5.0軟件的Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果

2.1 拮抗細(xì)菌的分離與篩選

從海南省國(guó)營(yíng)澄邁林場(chǎng)檀香優(yōu)良單株的根際土壤中，3個(gè)批次共分離得到71株細(xì)菌。以檀香炭疽病原菌為指示菌，篩選出抑菌帶寬度D≥6 mm的拮抗菌6株，分別為TXJ1-11、TXJ1-17、TXJ2-6、TXJ2-23、TXJ3-14和TXJ3-17（表1）。篩選出的6株拮抗細(xì)菌經(jīng)發(fā)酵液法復(fù)篩，得到TXJ2-6菌株的抑菌效果最好，抑菌率為76.9%（表2）。 因此，將TXJ2-6作為檀香炭疽病的拮抗菌株進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

表1 拮抗細(xì)菌對(duì)檀香炭疽病菌的抑制作用

表2 拮抗細(xì)菌發(fā)酵液對(duì)檀香炭疽病菌的抑制作用

在PDA平板對(duì)峙法中，接種TXJ2-6菌株后，拮抗菌對(duì)檀香炭疽病菌SA-2具有明顯的抑菌帶，病原菌菌絲生長(zhǎng)受到較明顯抑制，并且在病原菌菌落的邊緣與抑菌帶接觸部位的菌絲發(fā)生溶解，整個(gè)菌落的生長(zhǎng)受到明顯抑制（圖1）。

圖1 菌株TXJ2-6對(duì)檀香炭疽病病原菌的拮抗作用

2.2 拮抗細(xì)菌抗菌譜實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由表3可知，拮抗細(xì)菌TXJ2-6對(duì)5種病原真菌，即降香黃檀炭疽病菌、油茶軟腐病菌、油茶葉枯病菌、油茶根腐病菌及油茶炭疽病菌均有抑菌作用，其中對(duì)降香黃檀炭疽病菌、油茶軟腐病菌和油茶炭疽病菌的抑菌率分別達(dá)到77.8%、75.6%和75.6%。因此，可初步說明TXJ2-6菌株對(duì)植物病原真菌有一定的廣譜性，具有生防應(yīng)用前景。

表3 拮抗細(xì)菌TXJ2-6對(duì)5種病原真菌的抑制作用

2.3 拮抗菌株的鑒定

2.3.1 形態(tài)特征 圖2顯示，菌株TXJ2-6在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上呈乳白色菌落，圓形或近圓形，表面濕潤(rùn)不透明，邊緣波狀，有褶皺。菌體呈桿狀，芽孢中生，孢囊不膨大，革蘭氏染色呈陽性（圖2）。

圖2 TXJ2-6的形態(tài)特征

2.3.2 生理生化特征 通過對(duì)菌株TXJ2-6的部分生理生化特性實(shí)驗(yàn)（表4）結(jié)果并結(jié)合其形態(tài)特征，對(duì)照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》和《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》，初步鑒定TXJ2-6菌株為芽孢桿菌屬。

表4 TXJ2-6的生理生化特征

2.3.3 分子生物學(xué)鑒定 以TXJ2-6基因組DNA為模板，用通用引物27F和1492R對(duì)16S rDNA序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，得到大小為1 411 bp的核苷酸序列。將該序列通過BLAST程序與 GenBank中序列進(jìn)行對(duì)比分析，結(jié)果顯示菌株TXJ2-6與其比對(duì)的芽孢桿菌屬同源，相似度高達(dá)100%，采用MEGA5.0軟件以GenBank中16S rDNA相似序列及其模式菌株16S rDNA序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。結(jié)果（圖3）表明，菌株TXJ2-6與菌株SK13（GenBank 登錄號(hào)KC790303.1）和菌株P(guān)Y1（GenBank登錄號(hào)KC790265.1 ）的親緣關(guān)系最近，且此兩株菌均為甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌菌綜合菌株的形態(tài)學(xué)特征、生理生化特征及分子生物學(xué)鑒定，拮抗菌株可初步鑒定為甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌（Bacillus methylotrophicus）。

3 討論

對(duì)海南省檀香的病害普查結(jié)果發(fā)現(xiàn)，炭疽病是檀香苗木及其幼樹生長(zhǎng)的主要病害，目前此病害的林間防治方法主要是化學(xué)防治，即在病害發(fā)生的早期，交替使用多菌靈、甲基托布津、波爾多液等藥劑。但是，化學(xué)藥劑的預(yù)防作用很好，治療作用效果較差。另外，芽孢桿菌具有較強(qiáng)的抗菌防病功能，已成功作為生物農(nóng)藥用于植物病害的生物防治［18，19］。目前關(guān)于檀香炭疽病及其防治尚無相關(guān)報(bào)道和系統(tǒng)研究。本實(shí)驗(yàn)首次將甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌用于該病的生物防治，同時(shí)，該菌株拮抗作用具有一定的廣譜性，對(duì)油茶軟腐病、油茶葉枯病、油茶根腐病、油茶炭疽病和熱帶樹種降香黃檀炭疽病均具較強(qiáng)拮抗效果，尤其對(duì)降香黃檀炭疽病的抑菌效果顯著，抑菌率達(dá)77.8%。由于降香黃檀常作為檀香長(zhǎng)期寄主二者通?；旖?，因此選擇對(duì)二者都具有良好效果的拮抗菌株更有意義。本研究所分離篩選到的甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌是在室內(nèi)條件下對(duì)病原菌進(jìn)行的拮抗實(shí)驗(yàn)，但在田間的防效如何尚不得而知，另外對(duì)檀香苗木生長(zhǎng)有無促進(jìn)作用，如何開發(fā)為生物農(nóng)藥及其使用方法等還需進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)從海南省國(guó)營(yíng)澄邁林場(chǎng)土壤中分離純化得到71株細(xì)菌，篩選出對(duì)檀香炭疽病拮抗效果最好的一株，并且通過拮抗菌譜實(shí)驗(yàn)初步確定其具廣譜性，將該菌株命名為TXJ2-6。綜合形態(tài)學(xué)觀察、生理生化特性及16S rDNA序列分析，將TXJ2-6菌株鑒定為甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌（Bacillus methylotrophicus）。

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（責(zé)任編輯 馬鑫）

Isolation，Screening and Identification of Bacteria Antagonistic to Colletotrichum fructicola

Tian Yuanyuan Zhou Guoying Zuo Jie Liu Qianli Yang Quan
（Key Laboratory of Cultivation and Protection for Non-wood Forest Trees of Ministry of Education，Central South University of Forestry and Technology，Changsha410004）

It is aimed to obtain a bacterial strain that has strongly antagonistic activity to Colletotrichum fructicola. Collecting rhizosphere soil from different superior individual of Sandalwood in different parts of Chengmai Forest Farm in Hainan Province and using dilution culture method， 71 strains of bacteria were isolated. Then using C. fructicola as the indicating bacterium， primary screening by flat confrontation and rescreening by fermentation liquid， one strain of bacterium with promising antagonistic activity was obtained， numbered as TXJ2-6. Antibacterial spectrum tests showed it had significantly antagonistic activities to 5 plant pathogens（Colletotrichum gloeosporioides， Agaricodochium camellia， Fusarium proliferatum， Pestalotiopsis microspora， and Colletotrichum gloeosporioides）. Based on the morphological， physiological and biochemical characteristics and 16S rDNA phylogenetic analysis， strain TXJ2-6 was identified as Bacillus methylotrophicus.

Santalum album L.；anthracnose；antagonistic bacteria；screening；identification

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.09.022

2014-11-25

國(guó)家林業(yè)公益性行業(yè)科研專項(xiàng)（201304402）

田媛媛，女，碩士研究生，研究方向：森林微生物；E-mail：yuanyuan3356@163.com

周國(guó)英，女，教授，研究方向：森林保護(hù)與應(yīng)用微生物；E-mail：gyzhou2118@163.com