斜帶石斑魚IL-10基因的克隆及其原核表達(dá)

肖周婷黃郁蔥簡紀(jì)常魯義善吳灶和

（1.廣東海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，湛江　524088；2.廣東省水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物病原生物學(xué)及流行病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湛江524088；3.廣東省教育廳水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物病害控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湛江　524088；4.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院，廣州　510225）

斜帶石斑魚IL-10基因的克隆及其原核表達(dá)

肖周婷1，2，3黃郁蔥1，2，3簡紀(jì)常1，2，3魯義善1，2，3吳灶和2，3，4

（1.廣東海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，湛江524088；2.廣東省水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物病原生物學(xué)及流行病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湛江524088；3.廣東省教育廳水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物病害控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湛江524088；4.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院，廣州510225）

白介素10（Interleukin-10，IL-10）是一個(gè)重要的多效細(xì)胞因子，主要作用是介導(dǎo)炎癥反應(yīng)和調(diào)控一些免疫細(xì)胞的分化和增殖。利用同源克隆和RACE-PCR技術(shù)獲得全長為1 104 bp的斜帶石斑魚（Epinephelus coioides）IL-10基因。該基因ORF為564 bp，編碼187個(gè)氨基酸，預(yù)測蛋白分子量為21.7 kD，等電點(diǎn)為5.74。氨基酸同源性比對及進(jìn)化分析結(jié)果顯示，斜帶石斑魚IL-10氨基酸序列和吉富羅非魚（O. niloticus）同源性最高，達(dá)72.25%。利用雙酶切及質(zhì)粒重組技術(shù)構(gòu)建IL-10原核表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3）中誘導(dǎo)原核表達(dá)。SDS-PAGE分析顯示，融合蛋白分子量為37.5 kD，與預(yù)期相符；在IPTG為0.02 mmol/L，37℃誘導(dǎo)3 h，蛋白包涵體的表達(dá)量最大。

斜帶石斑魚（Epinephelus coioides）；Interleukin-10；基因克隆；重組表達(dá)

1989年，IL-10首次在鼠類T細(xì)胞中作為細(xì)胞因子合成抑制因子被報(bào)道［1］。除T細(xì)胞外，B細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞、NK細(xì)胞等，幾乎所有淋巴細(xì)胞均能合成IL-10［2］。IL-10主要調(diào)控炎癥反應(yīng)，它不僅能通過抑制單核巨噬細(xì)胞釋放免疫介質(zhì)、抗原呈遞和細(xì)胞吞噬作用，抑制CD4+T細(xì)胞的增殖和細(xì)胞因子合成，抑制呼吸爆發(fā)等，從而抑制免疫作用；也能通過刺激NK細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞的細(xì)胞毒活性增強(qiáng)免疫作用［3-6］。在哺乳動(dòng)物研究中表明，IL-10是以二聚體形式行使其生物學(xué)功能，通過與IL-10R1/R2受體配體復(fù)合物結(jié)合，使JAKSTAT信號(hào)通路上JAK1和Tyk2的磷酸化，從而招募和激活轉(zhuǎn)錄因子STAT3等，選擇性激活或抑制基因轉(zhuǎn)錄，發(fā)揮其抗炎生物學(xué)功能［7-10］。除JAK-STAT信號(hào)通路，IL-10還通過其他信號(hào)通路介導(dǎo)免疫反應(yīng)。

目前為止，IL-10已在河豚、鯉、斑馬魚、黑鱸、鱈魚、金魚、虹鱒等硬骨魚中被發(fā)現(xiàn)［11-17］，其中虹鱒中發(fā)現(xiàn)兩個(gè)同源性92%的IL-10剪切體。但對于斜帶石斑魚IL-10相關(guān)的研究還未見相關(guān)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)對斜帶石斑魚IL-10基因進(jìn)行克隆及其生物信息學(xué)分析，以期為進(jìn)一步研究該基因的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)和免疫調(diào)節(jié)作用奠定基礎(chǔ)；同時(shí)構(gòu)建IL-10原核表達(dá)載體，表達(dá)IL-10融合蛋白，旨在為進(jìn)一步研究斜帶石斑魚IL-10蛋白生物學(xué)功能提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)用魚 實(shí)驗(yàn)用斜帶石斑魚采集自湛江某水產(chǎn)品市場。

1.1.2 載體與菌株 克隆載體pMD18-T 質(zhì)粒和表達(dá)載體 pET-32a（+）質(zhì)粒均購自TaKaRa公司，大腸桿菌 DH5α和BL21菌株來自本實(shí)驗(yàn)室保存的菌株。

1.1.3 主要試劑 UNIQ-10柱式Trizol總RNA提取試劑盒購自上海生工生物技術(shù)有限公司；質(zhì)粒提取試劑盒及DNA膠回收試劑盒購自Thermo公司；PrimeSTAR HS DNA 聚合酶、Ex Taq DNA聚合酶、限制性核酸內(nèi)切酶Xho I和Bam H I、T4 DNA 連接酶、末端轉(zhuǎn)移酶TdT、dNTPs、DNA Marker、蛋白Marker等購自TaKaRa公司；M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶購自NEB公司；用PCR的引物及序列測定均由上海生工生物技術(shù)有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 斜帶石斑魚總RNA的提取及cDNA第一鏈合成 斜帶石斑魚脾臟總RNA提取按照UNIQ-10柱式Trizol總RNA提取試劑盒說明書進(jìn)行；按照M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶說明書以3adapter為引物合成第一鏈cDNA，進(jìn)行同源克隆及3'-RACE；以5-RECE-D1為引物合成cDNA，按照DNA膠回收試劑盒說明書對cDNA進(jìn)行純化，純化后的cDNA 按照末端轉(zhuǎn)移酶TdT說明書對其加上ployA 尾，產(chǎn)物用于進(jìn)行5'-RACE。

1.2.2 斜帶石斑魚IL-10中間片段獲得 根據(jù)GenBank上已登錄的舌齒鱸Dicentrarchus labrax（DQ821114.1）和鯽Carassius auratus（HQ259106.1）設(shè)計(jì)簡并引物IL-10-F1和IL-10-D1，同源克隆獲得IL-10的基因片段。

1.2.3 斜帶石斑魚IL-10基因3'-RACE 根據(jù)獲得的中間片段設(shè)計(jì)3'-RACE特異引物（3-RACE-F1；3-RACE-F2）。3'-RACE反應(yīng)體系：第一輪PCR：cDNA 2.5 μL，3-RACE-F1（10 μmol/L）1 μL，long（0.4 μmol/L）/short（2 μmol/L）2 μL，PrimeSTAR HS DNA 聚合酶0.25 μL，5×PrimeSTAR Buffer 5 μL，dNTP mix（2.5 mmol/L）2.5 μL，加水補(bǔ)足25 μL。PCR反應(yīng)條件：94℃ 30 s，66℃ 45 s，72℃ 2 min，5個(gè)循環(huán)；94℃ 30 s，60℃ 45 s，72℃ 2 min，25個(gè)循環(huán)，共計(jì)30個(gè)循環(huán)。第二輪PCR：首輪PCR產(chǎn)物稀釋20倍1 μL，3anchor 1 μL，3-RACE-F2（10 μmol/L）1 μL，Ex Taq DNA 聚合酶0.25 μL，10×Ex Taq Buffer 2.5 μL，dNTP mix（2.5 mmol/L）2.5 μL，加水補(bǔ)足25 μL。反應(yīng)條件同第一輪PCR。

1.2.4 斜帶石斑魚IL-10基因5'-RACE 根據(jù)獲得的中間片段設(shè)計(jì)5'-RACE特異引物（5-RECE-D1；5-RACE-D2；5-RACE-D3）。5'-RACE反 應(yīng) 體 系：第一輪PCR：加尾產(chǎn)物 2.5 μL，5-RACE-D2（10 μmol/L）1 μL，5oligodT-anchor 1 μL，Ex Taq DNA 聚合酶0.25 μL，10×Ex Taq Buffer 2.5 μL，dNTP mix（2.5 mmol/L）2.5 μL，加水補(bǔ)足25 μL。PCR反應(yīng)條件：94℃ 30 s，61℃ 45 s，72℃ 1 min，5個(gè)循環(huán)；94℃30 s，58℃ 45 s，72℃ 1 min，5個(gè)循環(huán)；94℃ 30 s，56℃ 45 s，72℃ 1 min，18個(gè)循環(huán)，共計(jì)28個(gè)循環(huán)。第二輪PCR：首輪PCR產(chǎn)物稀釋25倍 1 μL，5anchor 1 μL，5-RACE-D3（10 μmol/L）1 μL，Ex Taq DNA聚合酶0.25 μL，10×Ex Taq Buffer 2.5 μL，dNTP mix（2.5 mmol/L）2.5 μL，加水補(bǔ)足25 μL。反應(yīng)條件同第一輪PCR。本實(shí)驗(yàn)所用引物序列，見表1。

表1 本實(shí)驗(yàn)所用引物

1.2.5 斜帶石斑魚IL-10生物信息學(xué)分析 利用NCBI在線軟件ORF finder（http：//www.ncbi.nlm.nih. gov/gorf/orfig.cgi）確定開放閱讀框（ORF）及蛋白氨基酸序列；運(yùn)用ExPASy ProtParam（http：//web. expasy.org/protparam/）預(yù)測蛋白分子量（Mw）和理論等電點(diǎn)（p I）；采用SignalP 4.1 Server（http：//www. cbs.dtu.dk/services/SignalP/）預(yù)測對信號(hào)肽進(jìn)行預(yù)測；通過TMHMM Server v.2.0（http：//www.cbs.dtu. dk/services/TMHMM/）分析是否存在跨膜結(jié)構(gòu)域；功能位點(diǎn)分析使用ExPASy PROSITE在線軟件（http：// prosite.expasy.org/）；蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測采用PredictProtein（https：//www.predictprotein.org/）、Phyre 2 server（http：//www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/ htm l/page. cgi？id=index）和SWISS Model（http：//swissmodel.ex pasy.org/）；用DNAMAN6.0軟件對斜帶石斑魚IL-10氨基酸序列與其他物種IL-10進(jìn)行同源比對分析及序列拼接；利用MEGA6軟件進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建。

1.2.6 斜帶石斑魚IL-10原核表達(dá)載體pET-32a-IL10構(gòu)建及其原核表達(dá)條件的優(yōu)化 根據(jù)已得到的IL-10基因cDNA 全長設(shè)計(jì)含酶切位點(diǎn)的引物擴(kuò)增IL-10去信號(hào)肽核心片段，引物為IL10F（Bam H I）及IL10R（Xho I）。將用Ex Taq酶PCR擴(kuò)增獲得的含酶切位點(diǎn)的基因片段連接到pMD18-T 載體，對測序正確的陽性克隆和pET-32a（+）載體進(jìn)行用Bam H I和Xho I雙酶切，1.5%瓊脂糖電泳后回收相應(yīng)的目的條帶，用T4 DNA連接酶進(jìn)行連接后轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞中，對陽性克隆進(jìn)行測序。用終濃度為0.1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)4 h進(jìn)行原核表達(dá)。融合蛋白表達(dá)的優(yōu)化按黃瑜等［18］的方法進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1 斜帶石斑魚IL-10基因克隆

結(jié)果（圖1）顯示，獲得全長1 104 bp的IL-10基因，ORF為564 bp，編碼187個(gè)氨基酸。GenBank登錄號(hào)為KJ741852。蛋白理論分子量（Mw）為21.7 kD，理論等電點(diǎn)（p I）為5.74，存在一個(gè)22個(gè)氨基酸的信號(hào)肽，無跨膜區(qū)。ExPASy預(yù)測斜帶石斑魚IL-10蛋白存在4個(gè)蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)（24、73-75、135-137、177-179），3個(gè)酪蛋白激酶II磷酸化位點(diǎn)（69-72、85-88、150-153），1個(gè)N端酰基化位點(diǎn)（146-149）及1個(gè)N端糖基化位點(diǎn)（156-161）。

2.2 斜帶石斑魚IL-10氨基酸同源性及進(jìn)化分析

多序列比對結(jié)果（圖2）顯示，斜帶石斑魚IL-10的氨基酸序列與吉富羅非魚的同源性較高，為72.25%，而與人和猴的僅有26.18%和25.13%。在IL-10多肽鏈的30、80、110和116位存在4個(gè)非常保守的半胱氨酸。運(yùn)用MEGA6 軟件，以N-J法構(gòu)建IL-10的系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果（圖3）顯示，斜帶石斑魚IL-10與維多利亞湖慈鯛（P. nyererei）、斑馬宮麗魚（M. zebra）和吉富羅非魚（O. niloticus）聚為一支。

2.3 斜帶石斑魚IL-10的結(jié)構(gòu)分析

軟件分析顯示IL-10蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)中有117處α-螺旋，占總二級(jí)結(jié)構(gòu)的62.57%；42處無規(guī)則卷曲，占總二級(jí)結(jié)構(gòu)的22.46%；14處β-轉(zhuǎn)角和14處共有延伸鏈，各占總二級(jí)結(jié)構(gòu)的7.49%。PredictProtein和SWISS MODEL的結(jié)果（圖4）顯示，斜帶石斑魚IL-10蛋白存在6個(gè)α螺旋，三維結(jié)構(gòu)以二聚體形式存在，其空間結(jié)構(gòu)與人IL-10相似。

圖1 IL-10 cDNA核苷酸及其編碼的氨基酸序列

2.4 斜帶石斑魚IL-10原核表達(dá)載體pET-32a-IL10構(gòu)建及原核表達(dá)條件優(yōu)化

對測序正確的陽性菌與pET-32a（+）質(zhì)粒的空載體菌分別在0.1 mmol/L IPTG的濃度下誘導(dǎo)4 h進(jìn)行預(yù)誘導(dǎo)，結(jié)果（圖5-A）顯示分子量為37.5 kD的融合蛋白在大腸桿菌BL21中表達(dá)。在IPTG為0.1 mmol/L濃度時(shí)，融合蛋白在3 h后表達(dá)量不再增加（圖5-B）；在IPTG濃度為0.02、0.06、0.1、0.4、0.6及1 mmol/L，誘導(dǎo)4 h后，蛋白在0.02 mmol/L和0.6 mmol/L時(shí)表達(dá)量最大（圖5-C）；在IPTG濃度為0.1 mmol/L時(shí)，溫度為16℃、28℃和37℃，誘導(dǎo)4 h后，37℃時(shí)蛋白在沉淀中表達(dá)量最大，而28℃時(shí)，上清中融合蛋白較多（圖5-D）。

3 討論

本研究成功克隆了全長為1 104 bp的斜帶石斑魚IL-10基因，ORF為564 bp，編碼187個(gè)氨基酸，在3'端非編碼區(qū)存在2個(gè)mRNA不穩(wěn)定基序（ATTTA），表明該基因可能在炎癥反應(yīng)和免疫應(yīng)答中較為活躍［19］。在斜帶石斑魚IL-10氨基酸序列中存在LLDESVEESFKSPFGCHAMNSILEFYLNTVL和GLFKAMGDLDVLFNYIE兩個(gè)屬于IL-10特征基序L-［FILMV］-X3-［ILV］-X3-［FILMV］-X5-C-X5-［ILMV］和G-X2-KA-X2-［ED］-X-D-［ILV］-［FLY］-［FILMV］-X2-［ILMV］-［EKQZ］的序列。4個(gè)非常保守的半胱氨酸（Cys-30、Cys-80、Cys-110和Cys-116）在斜帶石斑魚IL-10多肽鏈中被發(fā)現(xiàn)，在人和哺乳動(dòng)物IL-10研究表明，IL-10存在對蛋白空間結(jié)構(gòu)的形成非常重要的兩個(gè)二硫鍵，對蛋白行使生物學(xué)功能不可或缺［8，9］。不同于人和哺乳動(dòng)物IL-10，斜帶石斑魚IL-10成熟肽還存在一個(gè)額外的半胱氨酸（Cys-26），在其他已報(bào)道的魚類IL-10，如斑馬魚［13］、鯉［12］、虹鱒［17］等，也存在類似的現(xiàn)象，IL-10通常以二聚體行使生物學(xué)功能，這一可能的二硫鍵形成位點(diǎn)，是否對IL-10的蛋白具有生物學(xué)意義還有待研究。哺乳動(dòng)物IL-10通過磷酸化行使其一些生物學(xué)功能［20］，在鼠IL-10發(fā)現(xiàn)一個(gè)潛在的糖基化位點(diǎn)，但不是蛋白功能所必需的［21］。斜帶石斑魚IL-10蛋白分析顯示其存在4個(gè)蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)、3個(gè)酪蛋白激酶II磷酸化位點(diǎn)以及1個(gè)N端?；稽c(diǎn)和1個(gè)N端糖基化位點(diǎn)，這些修飾位點(diǎn)對蛋白功能是否有影響可以通過蛋白點(diǎn)突變來驗(yàn)證。

圖2 IL-10氨基酸序列的同源性比對

圖3 IL-10氨基酸的系統(tǒng)進(jìn)化樹

圖4 預(yù)測斜帶石斑魚IL-10（A）與人的IL-10（B）的空間結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)比較

圖5 IL-10蛋白的原核表達(dá)

氨基酸同源性比對顯示斜帶石斑魚IL-10的氨基酸序列與吉富羅非魚的同源性最高，為72.25%，而與人類和猴的同源性較低。斜帶石斑魚IL-0蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測顯示斜帶石斑魚IL-10含有6個(gè)α螺旋，以二聚體形式存在于生物體中，與對人和哺乳動(dòng)物的研究一致。其三級(jí)結(jié)構(gòu)與人IL-10空間結(jié)構(gòu)類似，蛋白的結(jié)構(gòu)與蛋白功能之間的關(guān)系非常密切，斜帶石斑魚IL-10可能和哺乳動(dòng)物功能相同，以二聚體形式與其受體相結(jié)合，通過Jak-Sata信號(hào)通路來實(shí)現(xiàn)其對細(xì)胞的免疫調(diào)控［7，10，20］。Grayfer等［16，22］基于對金魚和斑馬魚IL-10及其受體IL10R特征和功能的研究，也認(rèn)為IL-10的功能在進(jìn)化上可能高度保守。

本實(shí)驗(yàn)成功表達(dá)出分子量為37.5 kD的斜帶石斑魚IL-10融合蛋白。選擇pET-32a（+）質(zhì)粒構(gòu)建原核表達(dá)載體是因?yàn)閜ET系列擁有T7強(qiáng)啟動(dòng)子的載體，能短時(shí)間內(nèi)大量表達(dá)目的蛋白，而表達(dá)的融合蛋白帶有6個(gè)組氨酸標(biāo)簽有利于蛋白后續(xù)的分離與純化，且多數(shù)情況下表達(dá)的融合蛋白不影響蛋白的免疫原性和免疫反應(yīng)性。原核表達(dá)條件優(yōu)化顯示，在IPTG濃度為0.02 mmol/L，37℃誘導(dǎo)3 h，蛋白包涵體的表達(dá)量最大。這些結(jié)果為后續(xù)進(jìn)行IL-10蛋白的富集及抗體的制備奠定基礎(chǔ)。而斜帶石斑魚IL-10融合蛋白在低溫誘導(dǎo)時(shí)，上清也有明顯表達(dá)，可以省去包涵體蛋白復(fù)性等相關(guān)復(fù)雜操作，獲取活性蛋白。本研究的后續(xù)實(shí)驗(yàn)將進(jìn)行IL-10的分離純化，參照Grayfera等［16］的實(shí)驗(yàn)操作，研究其對細(xì)胞呼吸爆發(fā)的影響，以及IL-10對細(xì)胞內(nèi)一些免疫相關(guān)基因表達(dá)的調(diào)控，探討IL-10在石斑魚免疫反應(yīng)中的作用與哺乳動(dòng)物是否類似。

4 結(jié)論

本研究從斜帶石斑魚成功克隆了IL-10基因。該基因全長1 104 bp，編碼187個(gè)氨基酸，理論分子量為21.7 kD，理論等電點(diǎn)為5.74，同源分析顯示與吉富羅非魚親緣關(guān)系較近。并對斜帶石斑魚IL-10的重組表達(dá)和表達(dá)條件進(jìn)行了探索，其優(yōu)化條件為：0.02 mmol/L的IPTG，37℃誘導(dǎo)3 h。

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（責(zé)任編輯 馬鑫）

Cloning and Prokaryotic Expression of IL-10 Gene of Epinephelus coioides

Xiao Zhouting1，2，3Huang Yucong1，2，3Jian Jichang1，2，3Lu Yishan1，2，3Wu Zaohe2，3，4
（1. College of Fisheries，Guangdong Ocean University，Zhanjiang524088；2. Guangdong Provincial Key Laboratory of Pathogenic Biology and Epidemiology for Aquatic Economic Animals，Zhanjiang524088；3. Key Laboratory of Diseases Controlling for Aquatic Economic Animals of Guangdong Higher Education Institutions，Zhanjiang524088；4. Zhongkai University of Agriculture and Engineering，Guangzhou510225）

Interleukin 10（IL-10）is the critical multiple-functional cytokine playing the major role of mediating inflammatory responses and regulating the differentiation and proliferation of some immune cells. The full-length cDNA of IL-10 of Epinephelus coioides was cloned using homological cloning and rapid amplification of cDNA ends（RACE-PCR）. Results showed the full-length of IL-10’s cDNA was 1 104 bp，containing an open reading frame of 564 bp encoding 187 amino acids with an estimated molecular weight of 21.7 kD and an estimated isoelectric point of 5.74， and it had a signal peptide of 22 amino acid residues and no transmembranous region. Amino acid homology analysis showed that the amino acid sequences of IL-10 with Oreochromis niloticus had the highest homology and up to 72.25%. SDS-PAGE indicated that the molecular weight of the fusion protein was 37.5 kD which was in accord with the estimated. The optimal condition of inducible expression for IL-10 protein in Escherichia coli was at 37℃ for 3 h with 0.02 mmol/L of IPTG.

Epinephelus coioides；Interleukin-10；gene cloning；prokaryotic expression

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.09.018

2014-12-07

廣東教育廳科技創(chuàng)新重點(diǎn)項(xiàng)目（2012CXZD0026），十二五國家科技支撐計(jì)劃（2012BAD17B03）

肖周婷，女，碩士研究生，研究方向：水產(chǎn)動(dòng)物病害防治；E-mail：xihu1tingyu@163.com

簡紀(jì)常，教授，研究方向：水產(chǎn)動(dòng)物免疫學(xué)及病害控制；E-mail：jianjc@gmail.com