新疆雪蓮水孔蛋白sikPIP1基因的克隆與功能分析

黎玉順 劉逸泠 劉步倉(cāng) 穆建強(qiáng) 祝建波

（石河子大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院　農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，石河子　8320003）

新疆雪蓮水孔蛋白sikPIP1基因的克隆與功能分析

黎玉順 劉逸泠 劉步倉(cāng) 穆建強(qiáng) 祝建波

（石河子大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，石河子8320003）

利用PCR技術(shù)從已建立的新疆雪蓮cDNA文庫(kù)中克隆雪蓮水孔蛋白基因sikPIP1，構(gòu)建植物表達(dá)載體pBI121-sikPIP1，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法獲得轉(zhuǎn)基因煙草，PCR和RT-PCR檢測(cè)證明該基因成功導(dǎo)入并得以轉(zhuǎn)錄，并對(duì)檢測(cè)結(jié)果均為陽(yáng)性的植株通過(guò)水分脅迫和溫度脅迫進(jìn)行抗旱性和抗寒性分析。結(jié)果顯示：（1）克隆得到長(zhǎng)為880 bp，具有水孔蛋白特性的sikPIP1基因，完整ORF為840 bp。（2）水分脅迫中，斷水7 d后轉(zhuǎn)基因煙草生長(zhǎng)表型明顯優(yōu)于野生型煙草，生理指標(biāo)測(cè)定結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因煙草的相對(duì)電導(dǎo)率和丙二醛含量均低于野生型煙草，相對(duì)含水量高于野生型煙草。（3）不同溫度脅迫處理，轉(zhuǎn)基因煙草表型顯著優(yōu)于野生型，特別是0℃以下低溫脅迫，野生型煙草出現(xiàn)嚴(yán)重的萎蔫，而轉(zhuǎn)基因煙草受傷害程度較輕；生理指標(biāo)結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因煙草相對(duì)電導(dǎo)率、丙二醛含量低于野生型煙草。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)sikPIP1基因提高了煙草抗旱能力和抗寒能力。

新疆雪蓮；水孔蛋白；sikPIP1基因；煙草；抗寒性；抗旱性

水分是限制陸地生態(tài)系統(tǒng)生產(chǎn)力的主要環(huán)境因子，而植物自身對(duì)水分的調(diào)節(jié)能力決定了它們對(duì)環(huán)境壓力的耐受性，很多環(huán)境因子如干旱、鹽堿和極端溫度都將影響植物各種生理過(guò)程中對(duì)水分的吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)、儲(chǔ)存和利用。水孔蛋白（Aquaporins，AQPs）是廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物細(xì)胞膜上轉(zhuǎn)運(yùn)水分子的特異通道蛋白，屬于MIP（Major intrinsic protein）家族。人們最早在動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)并命名為AQP［1］，主要是研究它的水通道作用。然而在對(duì)植物AQP的研究中發(fā)現(xiàn)AQPs不僅能特異性的轉(zhuǎn)運(yùn)水分子［2，3］，還能轉(zhuǎn)運(yùn)甘油、H2O2、尿素、NH3、CO2等多種物質(zhì)［4-8］，并且對(duì)植物的生長(zhǎng)、發(fā)育、適應(yīng)環(huán)境變化等方面［9-12］也有著重要的作用。在植物基因組研究中發(fā)現(xiàn)，擬南芥中有35個(gè)AQPs、水稻有33個(gè)AQPs、玉米36個(gè)AQPs，苔蘚23個(gè)AQPs，番茄37個(gè)AQPs、白楊55個(gè)AQPs［13-15］根據(jù)氨基酸序列的同源性及結(jié)構(gòu)特征，植物AQP通常分為5類：質(zhì)膜內(nèi)在蛋白（Plasma membrane intrinsic proteins，PIPs）；液泡膜內(nèi)在蛋白（Tonoplast intrinsic proteins，TIPs）；類 Nod26 膜內(nèi)在蛋白（Nodulin 26-like intrinsic proteins，NIPs）存在于根瘤菌和豆科植物的共生膜上；小分子堿性膜內(nèi)在蛋白（Small and basic intrinsic proteins，SIPs）； 以及類 GlpF（Glycerolfacilitator） 膜 內(nèi) 蛋 白（GlpF-like intrinsic proteins，GIPs）［16］。質(zhì)膜內(nèi)在蛋白（PIPs）作為AQP家族中的重要成員之一，包含PIP1和PIP2兩個(gè)子類。研究表明，它們不僅參與細(xì)胞對(duì)外界水分的選擇性運(yùn)輸，而且對(duì)植物生長(zhǎng)過(guò)程中的干旱、低溫等脅迫都有重要的作用［17-20］。Zhang等［21］研究發(fā)現(xiàn)在酵母細(xì)胞和擬南芥中過(guò)表達(dá)棉花GhPIP2；7基因能顯著提高其對(duì)干旱的耐受能力。李嶸等［22］在水稻中過(guò)表達(dá) OsPIP2；6，在干旱、低氧、高鹽等逆境脅迫下轉(zhuǎn)基因植株耐受能力均顯著高于野生型，植株中OsPIP2；6的表達(dá)量也明顯增高。Matsumoto等［23］發(fā)現(xiàn)PIP1過(guò)表達(dá)水稻植株比野生型對(duì)寒冷有更強(qiáng)的耐受。

新疆雪蓮（Sasussured involucrata Kar. et Kir），屬菊科（Compositae）菜薊族（Trib. Cynareae Less.）鳳毛菊屬（Saussurea DC.）雪蓮亞屬；多年生一次性開(kāi)花結(jié)實(shí)的高山冰緣宿根草本植物。主要生長(zhǎng)在海拔2 400-4 100 m的高山冰漬石、流石灘、石隙、懸崖峭壁以及沙質(zhì)濕地中［24，25］。新疆雪蓮能在常年低溫、低氧、強(qiáng)紫外且氣候復(fù)雜多變的情況下完成生活史，其自身形成了一套與環(huán)境相適應(yīng)的響應(yīng)機(jī)制，并且在抵抗的過(guò)程中自身也具有與之有關(guān)的抗逆基因［26-28］，從而使雪蓮得以適應(yīng)環(huán)境。因此，對(duì)天山雪蓮基因功能的研究，不僅可以了解天山雪蓮特殊的生理機(jī)能，而且通過(guò)基因工程手段將天山雪蓮的基因轉(zhuǎn)入農(nóng)作物中，對(duì)培育抗逆作物也提供了一種有效的途徑。

目前，針對(duì)PIPs的研究大多是關(guān)注其水分運(yùn)輸以及逆境脅迫下的內(nèi)源表達(dá)，對(duì)單個(gè)基因的功能，以及外源表達(dá)研究較少。為進(jìn)一步研究質(zhì)膜內(nèi)在蛋白基因PIPs與低溫、干旱的關(guān)系，本研究從新疆雪蓮cDNA文庫(kù)中克隆質(zhì)膜內(nèi)在蛋白基因sikPIP1，構(gòu)建植物表達(dá)載體pBI121-sikPIP1，通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化煙草，水分脅迫進(jìn)行抗旱性分析和冷凍脅迫進(jìn)行抗寒性分析，旨在進(jìn)一步了解sikPIP1基因?qū)δ婢车哪褪苄?，從而為水孔蛋白研究和利用提供理論依?jù)與奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α、農(nóng)桿菌GV3101、植物表達(dá)載體pBI121、‘NC89’野生型煙草（Nicotiana tabacum L.）由石河子大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存?？寺≥d體pGM-T Easy購(gòu)自天根生物公司。其它試劑均為國(guó)產(chǎn)或進(jìn)口分析純?cè)噭?，引物合成、測(cè)序均由上海生物工程公司進(jìn)行。

1.2 方法

1.2.1 sikPIP1基因的克隆 從已建立的天山雪蓮cDNA文庫(kù)中隨機(jī)挑取單克隆，采取通用引物M13進(jìn)行PCR擴(kuò)增并測(cè)序。選擇與水孔蛋白基因同源的序列作為模板，利用Primer5.0設(shè)計(jì)PCR引物PP1和PP2。PP1：5'-TGCTCTAGAGCATGAGTTTTAGAG AGAGAAATGTCG-3'（Xba I），PP2：5'-TGCGAGCTCATTAATTTGTAGCATTGCTTCTGA-3'（Sac I）。采用Tiangen公司的Trizol總RNA提取試劑，提取天山雪蓮的總RNA，以O(shè)ligo dT為引物將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以PP1和PP2為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5 min；94℃變性45 s，61℃復(fù)性30 s，72℃延伸45 s，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸7 min；4℃保溫。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%的瓊脂糖凝膠電泳分離后，目的片段命名為sikPIP1；使用瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收目的基因；將回收的目的片段連接至載體pGM-T Easy，將陽(yáng)性克隆命名為pGM-sikPIP1；酶切鑒定后送上海生工測(cè)序。利用DNAman軟件分析測(cè)序結(jié)果序列，確定開(kāi)放閱讀框，推導(dǎo)相應(yīng)的多肽序列。蛋白質(zhì)氨基酸比對(duì)在NCBI的BlastT中分析；運(yùn)用Mega軟件對(duì)推導(dǎo)的多肽序列與已知報(bào)道的植物氨基酸序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析。

1.2.2 植物表達(dá)載體的構(gòu)建與轉(zhuǎn)化 用Xba I/Sac I雙酶切重組質(zhì)粒pGM-sikPIP1和植物表達(dá)載體pBI121，1%的瓊脂糖凝膠電泳后，使用瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收目的基因和載體大片段。兩片段經(jīng)T4 DNA連接酶16℃連接過(guò)夜，重組子轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α，含卡那霉素（60 mg/L）的平板培養(yǎng)過(guò)夜，挑選單菌落培養(yǎng)，PCR檢測(cè)，提取PCR檢測(cè)為陽(yáng)性質(zhì)粒并進(jìn)行酶切鑒定。鑒定為雙陽(yáng)性的質(zhì)粒即是pBI121-sikPIP1，將重組質(zhì)粒用電擊法轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101。

1.2.3 轉(zhuǎn)基因煙草的獲得及鑒定 經(jīng)農(nóng)桿菌pBI121-sikPIP1/GV3101介導(dǎo)葉盤(pán)法轉(zhuǎn)化煙草‘NC89’，獲得再生植株，移栽入營(yíng)養(yǎng)土中。采用CTAB法提取再生煙草植株的基因組DNA，以pBI121-sikPIP1質(zhì)粒為陽(yáng)性對(duì)照，野生型受體DNA 為陰性對(duì)照，對(duì)目的基因進(jìn)行PCR檢測(cè)。用TRIzol法提取PCR檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性的煙草植株以及受體煙草的總RNA，采用RT-PCR檢測(cè)目的基因的轉(zhuǎn)錄水平。

1.2.4 轉(zhuǎn)基因煙草水分脅迫實(shí)驗(yàn) 選擇室內(nèi)培養(yǎng)2個(gè)月，長(zhǎng)勢(shì)相近的野生型煙草和來(lái)自不同株系的轉(zhuǎn)sikPIP1煙草各3株。實(shí)驗(yàn)前充分澆水，待底部托盤(pán)無(wú)水分進(jìn)出時(shí)開(kāi)始計(jì)時(shí)，進(jìn)行自然干旱處理。停止供水13 d，第14天復(fù)水，實(shí)驗(yàn)共進(jìn)行16 d。從第1天斷水開(kāi)始，每隔3 d根據(jù)李合生［29］的方法測(cè)量一次相對(duì)電導(dǎo)率、丙二醛、葉片相對(duì)含水量，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，并記錄煙草形態(tài)變化。

1.2.5 轉(zhuǎn)基因煙草冷凍脅迫實(shí)驗(yàn) 整體植株的冷凍處理，選擇室內(nèi)培養(yǎng)2個(gè)月，長(zhǎng)勢(shì)相近的野生型煙草和來(lái)自不同株系的轉(zhuǎn)sikPIP1煙草各3株，分別放入4℃、0℃、-2℃和-4℃的生化培養(yǎng)箱進(jìn)行冷凍脅迫，4℃處理12 h，0℃、-2℃和-4℃處理4 h。記錄各階段煙草形態(tài)變化，測(cè)定煙草相對(duì)電導(dǎo)率和丙二醛含量，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.6 數(shù)據(jù)分析 所有數(shù)據(jù)處理均用Excel2003和SPSS Statistics軟件分析處理，氨基酸序列分析用DNAman、Mega以及在線工具完成。

2 結(jié)果

2.1 s ikPIP1基因的克隆與分析

以天山雪蓮cDNA為模板，利用設(shè)計(jì)好PCR引物PP1和PP2進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，獲得大小約為880 bp DNA片段，將目的片段sikPIP1克隆于pGM-T Easy載體，獲得pGM-sikPIP1，用Xba I/Sac I雙酶切鑒定，證明新疆雪蓮水孔蛋白基因sikPIP1克隆成功。測(cè)序結(jié)果分析表明，sikPIP1基因的最大開(kāi)放閱讀框?yàn)?40 bp，編碼279個(gè)氨基酸，分子量為29.01 kD，pI為9.26。

圖1 sikPIP1的氨基酸序列

目前研究發(fā)現(xiàn)在PIP、TIP、NIM和SIP四個(gè)亞家族中都具有共同的特征，即都有6個(gè)跨膜區(qū)、較短的保守AA基序PA和信號(hào)序列SGXHXNPAVT［30］。序列分析（圖1）表明，sikPIP1不但具有MIP家族信號(hào)序列GGGANXXXXGY和TGI/TNPAR-SI/FGAAI/VI/VF/YN［12］。此外，序列分析還表明sik-PIP1具有一個(gè)PKA磷酸化位點(diǎn)（Ser113）和一個(gè)PKC的磷酸化位點(diǎn)（Ser186）。

根據(jù)推定的天山雪蓮質(zhì)膜水孔蛋白基因sikPIP1多肽序列在NCBI進(jìn)行BLAST比對(duì)，挑選同源性高的比對(duì)結(jié)果，利用Mega軟件構(gòu)建不同物種間植物水孔蛋白基因的分子進(jìn)化樹(shù)（圖2）發(fā)現(xiàn)，該蛋白與葡萄（Vitis vinifera）、無(wú)?；担≦uercus petraea）、甜菜（Beta vulgaris）親緣關(guān)系最近，此外還與擬南芥（Arabidopsis thaliana）、陸地棉（Gossypium hirsutum）、胡桃（Juglans regia）等不同科屬間植物親緣關(guān)系較近，說(shuō)明水孔蛋白基因在物種間進(jìn)化比較保守，比對(duì)發(fā)現(xiàn)這些基因多為PIP2亞家族，因此可推測(cè)雪蓮水孔蛋白基因sikPIP1也應(yīng)屬于PIP2亞家族。

圖2 sikPIP1蛋白系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

2.2 植物表達(dá)載體pBI121-sikPIP1的構(gòu)建

用Xba I/Sac I雙酶切植物表達(dá)載體pBI121和陽(yáng)性克隆載體pGM-sikPIP1，構(gòu)建植物表達(dá)載體pBI121-sikPIP1。提取PCR鑒定為陽(yáng)性菌落的質(zhì)粒，用Xba I/Sac I進(jìn)行雙酶切鑒定（圖3），證明植物表達(dá)載體pBI121-sikPIP1構(gòu)建成功。構(gòu)建成功的植物表達(dá)載體通過(guò)電擊法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101，挑選單菌落進(jìn)行PCR鑒定（圖4）。

2.3 轉(zhuǎn)基因煙草的獲得及鑒定

以野生型煙草“NC89”為受體，用農(nóng)桿菌pBI121-sikPIP1/GV3101介導(dǎo)轉(zhuǎn)化，經(jīng)卡那霉素篩選獲得抗性再生植株，移栽入營(yíng)養(yǎng)缽。對(duì)移栽煙草植株進(jìn)行PCR（圖5）和RT-PCR鑒定（圖6）。將鑒定結(jié)果均為陽(yáng)性的煙草進(jìn)行進(jìn)一步的生理指標(biāo)測(cè)定。

圖3 pBI121-sikPIP1質(zhì)粒酶切鑒定

圖4 pBI121-sikPIP1/GV3101 PCR檢測(cè)

圖5 pBI121-sikPIP1轉(zhuǎn)基因煙草PCR檢測(cè)

圖6 pBI121-sikPIP1轉(zhuǎn)基因煙草RT-PCR檢測(cè)結(jié)果

2.4 水分脅迫下轉(zhuǎn)基因煙草的形態(tài)特征及生理指標(biāo)

2.4.1 形態(tài)特征 斷水后7 d野生型煙草基部開(kāi)始出現(xiàn)輕度萎蔫，葉片由下而上開(kāi)始出現(xiàn)黃化，第10天已經(jīng)嚴(yán)重萎蔫，第13天野生型煙草整株萎蔫；而轉(zhuǎn)基因煙草第10天才出現(xiàn)輕度萎蔫現(xiàn)象，第13天葉片中度萎蔫（圖7），復(fù)水2 d后轉(zhuǎn)基因煙草恢復(fù)情況明顯優(yōu)于野生型煙草。可見(jiàn)，轉(zhuǎn)雪蓮sikPIP1基因煙草比對(duì)照野生型煙草表現(xiàn)出更強(qiáng)的耐旱性。

圖7 水分脅迫下野生型煙草與轉(zhuǎn)sikPIP1基因煙草的形態(tài)特征

2.4.2 生理指標(biāo) 對(duì)水分脅迫下各階段轉(zhuǎn)sikPIP1基因煙草和野生型對(duì)照煙草的相對(duì)電導(dǎo)率、丙二醛（MDA）含量、相對(duì)含水量進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果（圖8）表明，轉(zhuǎn)基因煙草在水分脅迫中表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗旱性。除第1天外，轉(zhuǎn)基因煙草的相對(duì)電導(dǎo)率和MDA含量均低于野生型煙草，隨著脅迫時(shí)間的增長(zhǎng)，轉(zhuǎn)基因煙草和野生型煙草的相對(duì)電導(dǎo)率和MDA含量都呈逐漸上升趨勢(shì)，但野生型增加幅度和速度均大于轉(zhuǎn)基因煙草，且差異顯著（P＜0.05）。轉(zhuǎn)基因煙草的葉片相對(duì)含水量則高于野生型煙草，隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，轉(zhuǎn)基因煙草和野生型煙草的相對(duì)含水量均表現(xiàn)出下降趨勢(shì)，野生型下降速度和幅度均大于轉(zhuǎn)基因煙草。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因煙草比野生型煙草有更強(qiáng)的耐旱性。生理指標(biāo)變化與形態(tài)特征變化保持一致，表明外源導(dǎo)入雪蓮sikPIP1基因，能夠提高煙草抗旱性，減少水分虧缺對(duì)植物的傷害。

2.5 溫度脅迫對(duì)轉(zhuǎn)基因煙草形態(tài)特征和生理指標(biāo)的影響

2.5.1 形態(tài)特征 4℃處理12 h野生型煙草與轉(zhuǎn)基因煙草表型均無(wú)明顯變化，0℃處理4 h野生型煙草葉片出現(xiàn)少量傷斑，轉(zhuǎn)基因煙草仍無(wú)明顯變化；-2℃處理4 h轉(zhuǎn)基因煙草葉片出現(xiàn)傷斑，組織出現(xiàn)輕微疲軟，野生型煙草葉片嚴(yán)重萎蔫；-4℃處理4 h轉(zhuǎn)基因煙草出現(xiàn)中度萎蔫，野生型煙草出現(xiàn)整株萎蔫（圖9）。表明轉(zhuǎn)入sikPIP1基因能提高煙草對(duì)低溫的耐受能力。

圖8 水分脅迫下野生型煙草和轉(zhuǎn)基因煙草植株的生理指標(biāo)變化

圖9 不同溫度脅迫下野生型煙草和轉(zhuǎn)sikPIP1基因煙草的形態(tài)特征

圖10 溫度脅迫下野生型煙草和轉(zhuǎn)基因煙草植株的生理指標(biāo)變化

2.5.2 生理指標(biāo) 在溫度脅迫實(shí)驗(yàn)中，對(duì)不同溫度處理的野生型煙草和轉(zhuǎn)基因煙草進(jìn)行電導(dǎo)率和丙二醛含量的測(cè)定（圖10）。全過(guò)程中野生型煙草的相對(duì)電導(dǎo)率和MDA含量都高于轉(zhuǎn)基因煙草，且隨著溫度的降低野生型煙草和轉(zhuǎn)基因煙草的相對(duì)電導(dǎo)率和MDA含量均呈上升趨勢(shì)；4℃處理下野生型煙草與轉(zhuǎn)基因煙草的相對(duì)電導(dǎo)率和MDA差異均不大；但在0℃、-2.0℃和-4.0℃處理下，野生型煙草的電導(dǎo)率和MDA上升速度與幅度均高于轉(zhuǎn)基因煙草，且差異顯著（P＜0.05）。表明轉(zhuǎn)基因煙草膜脂受傷程度較低，抗寒性相對(duì)較高，與形態(tài)特征結(jié)果保持一致，說(shuō)明轉(zhuǎn)入雪蓮sikPIP1基因能提高煙草對(duì)低溫的耐受性，降低植物在低溫中的傷害。

3 討論

AQP作為重要的生物膜功能蛋白，參與了多種重要的生理過(guò)程。其調(diào)節(jié)機(jī)制主要分為兩種：一是通過(guò)調(diào)節(jié)AQP活性進(jìn)行調(diào)節(jié)（如磷酸化、激素和Ca2+等）；二是改變膜上AQP數(shù)量進(jìn)行調(diào)節(jié)。近年來(lái)植物AQP的相關(guān)研究備受關(guān)注，越來(lái)越多的植物AQP被成功分離、并進(jìn)行功能分析和調(diào)控機(jī)理的解析。植物AQP在受到不同環(huán)境因子或存在物種差異等因素時(shí)，往往表現(xiàn)出不同的反應(yīng)，因此研究植物AQP在植物對(duì)不同環(huán)境因子（尤其是對(duì)水分和溫度）適應(yīng)中所起的作用就具有重要的意義。

AQP對(duì)于植物的最主要作用是水分運(yùn)輸，在水分虧缺情況下，AQP在植物應(yīng)對(duì)水分脅迫的應(yīng)答機(jī)制中起著重要的作用。Aharon等［31］通過(guò)對(duì)轉(zhuǎn)入擬南芥PIP1b的轉(zhuǎn)基因煙草研究發(fā)現(xiàn)，正常情況下，轉(zhuǎn)PIP1b煙草長(zhǎng)勢(shì)優(yōu)于對(duì)照，在干旱脅迫下，PIP1b超表達(dá)為負(fù)作用，植株萎蔫速度快于對(duì)照。本研究對(duì)轉(zhuǎn)新疆雪蓮sikPIP1基因煙草干旱脅迫發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因植株抗旱能力明顯優(yōu)于對(duì)照，這與李嶸等［22］和Zhang等［21］外源表達(dá)PIP基因結(jié)果一致。說(shuō)明AQP在植物響應(yīng)水分脅迫時(shí)表現(xiàn)出不同的功能。

目前對(duì)植物低溫耐受性研究主要集中在冷害（0℃以上低溫）的研究中，本研究選擇耐寒植物新疆雪蓮為材料克隆水孔蛋白sikPIP1基因并轉(zhuǎn)化煙草，結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因煙草抗寒（冰點(diǎn)以下低溫）能力明顯增強(qiáng)，這一結(jié)果與焦天奇等［26］克隆的雪蓮水孔蛋白sikPIP3基因在煙草中表達(dá)結(jié)果一致，Lin等［32］在擬南芥中表達(dá)另一種耐寒植物人參的液泡膜水孔蛋白基因PgTIP1結(jié)果發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)PgTIP1基因提高擬南芥的抗鹽和抗旱能力，并展示出了更低的耐受溫度。干旱和低溫主要影響植物對(duì)水分的運(yùn)輸，在前人外源表達(dá)PIP1與PIP2基因的研究中發(fā)現(xiàn)PIP2基因比PIP1基因有更強(qiáng)的水通道特性，而PIP1與PIP2形成的異源四聚體比PIP2形成的同源四聚體也有更高的水透性，這一結(jié)果在水稻和玉米中都得以證實(shí)，說(shuō)明PIP1與PIP2基因間存在協(xié)同作用［23，33］，而雪蓮的PIP1基因與PIP2基因間是否也存在這種協(xié)同作用，同時(shí)外源表達(dá)這兩個(gè)基因能否進(jìn)一步提高植株的抗逆能力，選擇抗逆性強(qiáng)的基因材料來(lái)源是否可以表現(xiàn)出內(nèi)源表達(dá)相似的結(jié)果，并且sikPIP1基因是否與其他抗逆基因間也存在這種協(xié)同作用值得我們進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

本研究克隆了新疆雪蓮水孔蛋白基因sikPIP1，并成功轉(zhuǎn)化煙草。對(duì)獲得的轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行逆境脅迫實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，與野生型相比較，轉(zhuǎn)sikPIP1基因煙草顯著增強(qiáng)了對(duì)干旱和低溫逆境條件的適應(yīng)性。

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（責(zé)任編輯 馬鑫）

Cloning and Function Analysis of Aquaporin Protein Gene sikPIP1from Saussurea involucrata Kar. et K ir

Li Yushun Liu Yiling Liu Bucang Mu Jianqiang Zhu Jianbo
（Key Laboratory of Agricultural Biotechnology，College of Life Science，Shihezi University，Shihezi8320003）

Saussurea involucrata aquaporin protein gene sikPIP1was cloned from established cDNA library by PCR technique. Then a plant expression vector of pBI121-sikPIP1was constructed and transgenic tobacco plants were obtained by Agrobacterium-mediated method. The analysis by PCR and RT-PCR indicated that the aquaporin protein gene sikPIP1had been integrated and transcribed into the tobacco genome. The drought and cold resistance by water stress and low-temperature stress for the positive plants from above PCR and RT-PCR examination were analyzed. The results showed that：（1）The plasma membrane aquaporin gene sikPIP1was cloned with the length of 880 bp and complete ORF of 840 bp. （2）Under the water stress， the growth phenotype of transgenic tobacco was evidently better than wild-type after 7 days’ waterbreak， the results of physiological index showed that relative conductivity and MDA content of transgenic tobacco were lower than those of wild-type. However， the relative water content of transgenic tobacco was higher than that of wild-type. （3）The growth phenotype of transgenic tobacco was significantly better than that of wild-type under the different temperature stress. Especially below the 0 degree， the wild-type ones were wilting seriously， however， the transgenic tobacco had less damages. The results of physiological index showed that relative conductivity and MDA content of transgenic tobacco were lower than that of wild-type. The testing results showed that sikPIP1gene improved tobacco’s tolerance of drought and cold.

Sasussured involucrate；aquaporin protein；sikPIP1gene；tobacco；drought tolerance；cold tolerance

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.09.013

2015-01-27

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（C020406，C020407）

黎玉順，男，碩士研究生，研究方向：植物適應(yīng)逆境的分子機(jī)理；E-mail：liyushunshz@163.com

祝建波，男，研究員，研究方向：植物基因工程；E-mail：zjbshz@163.com