黃芩醇提物對副溶血性弧菌抑制機制的研究

謝麗玲 彭齊 蔡鏈純 周亮 朱炎坤 韓光耀

（汕頭大學(xué)理學(xué)院，汕頭　515063）

黃芩醇提物對副溶血性弧菌抑制機制的研究

謝麗玲 彭齊 蔡鏈純 周亮 朱炎坤 韓光耀

（汕頭大學(xué)理學(xué)院，汕頭515063）

從4種常見中藥中篩選出對副溶血性弧菌有較好抑制作用的中藥，并對其抑制機制進行研究。采用牛津杯法及液體倍比稀釋法研究了中藥醇提取物對副溶血性弧菌的敏感性；通過生長曲線和殺菌曲線、電鏡觀察以及SDS-PAGE等方法探討黃芩醇提物的抑菌作用及機理。結(jié)果顯示，4種中藥醇提物對副溶血性弧菌表現(xiàn)出不同的抑菌活性，其中黃芩醇提物對副溶血性弧菌的抑制作用最強，抑菌圈為22.00±1.00 mm，MIC和MBC均為3.91 mg/mL。經(jīng)MIC濃度處理后，細菌經(jīng)過較長一段時間的延遲期，也能進入正常的對數(shù)期和穩(wěn)定期；菌體表面變粗糙，出現(xiàn)裂解，菌液的蛋白含量明顯升高，但是菌體的可溶性蛋白變化較小。結(jié)果表明，黃芩醇提物對副溶血性弧菌有很強的抑制效果，其作用是破壞細胞膜的完整性導(dǎo)致菌體裂解死亡。

黃芩；副溶血性弧菌；醇提物；抑菌機理

副溶血性弧菌為革蘭氏陰性嗜鹽菌，自然環(huán)境中主要存在于河口和沿海中，與水產(chǎn)品污染密切相關(guān)，常引起大量魚類和貝類的感染，造成巨大的經(jīng)濟損失，經(jīng)常能從生的海鮮品中分離到［1，2］。食用被其污染的食物可造成急性腸胃炎，表現(xiàn)特征是腹瀉、頭痛、嘔吐、惡心、腹痛和低燒，嚴重時會引起急性敗血癥。副溶血性弧菌引起的腸胃炎主要發(fā)生在每年4-10月份，在2003-2008年中，該菌引起的腸胃炎的爆發(fā)有322起，導(dǎo)致9 041人患病，3 948人住院治療，流行病學(xué)數(shù)據(jù)顯示副溶血性弧菌在亞洲、南美、美國等地，是引起食物性感染的主要原因。在中國，該菌已經(jīng)成為引起食物中毒的首要病原菌，尤其是在一些沿海城市，其比例超過60%［3-6］。副溶血性弧菌引起的食物性感染已成為一個不容忽視的問題！為了控制和防止它在水產(chǎn)品飼養(yǎng)中的污染，主要措施是使用消毒劑和抗生素，但這存在明顯的弊端，即：細菌耐藥性的產(chǎn)生、抗生素藥物的殘留、對水生動物體內(nèi)微平衡以及免疫力的破壞，因此尋找其他綠色有效抑菌物質(zhì)越來越引起人們關(guān)注。

黃芩是常用的多年生藥用植物，根部是天然無毒產(chǎn)品，含有30多種黃酮類物質(zhì)，活性物質(zhì)主要是黃芩苷、漢黃芩素、木蝴蝶素A，其結(jié)構(gòu)如圖1所示。它們具有多種藥理作用，例如抗氧化、抗菌、抗炎、抗癌等［7-10］。雖然關(guān)于黃芩提取物的抑菌活性研究有較多報道，但是應(yīng)用于致病性副溶血性弧菌的研究未見報道。本實驗首次通過黃芩對致病性副溶血性弧菌的抑菌活性及機制進行研究，旨在為開發(fā)低毒高效、用于水產(chǎn)養(yǎng)殖的綠色抗菌藥物及尋找新的藥物靶點提供參考。

圖1 黃芩有效成分的結(jié)構(gòu)

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 供試菌株為副溶血性弧菌，由本實驗室保存。

1.1.2 中藥粗提物 稱取黃芩、黃連、大黃、金銀花各5.00 g，用50 mL 70%乙醇80℃提取兩次，每次1 h。合并提取液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至濃度為0.5 g/mL，過濾（0.2 μm）除菌后置于4℃冰箱保存。

1.1.3 培養(yǎng)基 LB培養(yǎng)基：1% NaCl，1% peptone，0.5% yeast extract。

1.1.4 主要試劑和儀器 丙烯酰胺（Acrylamide），甲叉雙丙烯酰胺（Bis-acrylamide），三羥甲基氨基甲烷（Tris），十二烷基硫酸鈉（SDS），考馬斯亮藍R-250/G250（Coomassie brilliant blue R-250/G250）等試劑購于上海Sangon生物工程有限公司；無水乙醇、甲醇、冰乙酸、濃鹽酸等試劑購于汕頭西隴化工有限公司；TDL-5-A型低速大容量離心機（上海安亭科學(xué)儀器廠）；UV-2102C紫外可見分光光度計（上海優(yōu)尼柯儀器有限公司）；SPX-250B型生化培養(yǎng)箱（上海躍進醫(yī)用光學(xué)儀器廠）； JSM-6360LA掃描電鏡。

1.2 方法

1.2.1 中藥醇提取物對副溶血性弧菌敏感性實驗

1.2.1.1 牛津杯法 取100 μL稀釋至107CFU/mL的菌液，均勻涂布平板，將中藥粗提液200 μL加入到牛津杯中，以無菌水為陰性對照，20 μg/mL卡那霉素為陽性對照。先在4℃冰箱中放置4 h待藥液擴散一段時間，然后再移至37℃培養(yǎng)16 h后觀察，測定抑菌圈大小。

1.2.1.2 液體倍比稀釋法 采用二倍倍比稀釋法測定中藥粗提液的最低抑菌濃度（MIC），以不加粗提液為陰性對照，不渾濁的最低藥物濃度為MIC值。

1.2.1.3 平皿法測定最低殺菌濃度（MBC） 根據(jù)MIC的觀察結(jié)果，將培養(yǎng)液劃線于LB培養(yǎng)基上。平皿內(nèi)無細菌生長的最小藥物濃度為MBC值。

1.2.2 抑菌機制的分析

1.2.2.1 副溶血性弧菌生長曲線的繪制 將100 μL已培養(yǎng)12 h的副溶血性弧菌加入到含1/2MIC和MIC粗提液的100 mL LB培養(yǎng)基中，以不加粗提液為陰性對照。37℃搖床培養(yǎng)，每隔2 h取樣測OD，連續(xù)測量16 h，繪制出藥物組和對照組的生長曲線（λ= 600 nm）。

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1.2.2.2 殺菌曲線的繪制［11］在4 mL培養(yǎng)液中加入粗提液，使終濃度為MIC和2MIC，以不加粗提液為陰性對照。每管中加入稀釋后的副溶血性弧菌使其濃度為105-106CFU/mL。37℃搖床培養(yǎng)，每隔2 h取100 μL菌液采用平板計數(shù)（T=0、2、4、6和8 h）。然后平板在37℃下培養(yǎng)16 h，記錄菌落形成數(shù)量。最后以時間為橫坐標，每毫升菌落形成單位的對數(shù)值為縱坐標作圖繪制殺菌曲線。

1.2.2.3 掃描電鏡觀察［12］將培養(yǎng)至對數(shù)期的副溶血性弧菌按2%接種量，接種到含MIC粗提液的培養(yǎng)液中，以不加粗提液為陰性對照。37℃搖床培養(yǎng)，6 h后取樣，離心去上清，2.5%的戊二醛4℃固定過夜后用0.2 mol/L的PBS（pH7.4）洗3次，然后依次用30%、50%、70%、85%、90%和100%乙醇脫水一次，每次15 min，最后涂片、干燥、噴金，在掃描電鏡JSM-6360LA下觀察。

1.2.2.4 對細胞膜的作用［13］用Bradford法測蛋白濃度，首先分別加0、20、40、60、80和100 mL 1 mg/mL的牛血清蛋白到5 mL的Bradford中，室溫顯色5 min，于721分光光度計下，595 nm作比色測定，繪制標準曲線。將培養(yǎng)至對數(shù)期的副溶血性弧菌按2%接種到含MIC粗提液的培養(yǎng)液中，以不加藥液為陰性對照。37℃搖床培養(yǎng)，每隔2 h（T=0、2、4和8 h）取樣，離心，收集上清，測蛋白濃度，每組測定3次。

1.2.2.5 SDS-PAGE和細胞可溶性蛋白含量的測定 將培養(yǎng)至對數(shù)期的副溶血性弧菌按2%接種到含MIC粗提液的培養(yǎng)液中，以不加藥液為陰性照組。37℃搖床培養(yǎng)，收集2、4、6和8 h菌體（0.05 g濕重）超聲破碎提取蛋白。選用5%濃縮膠，10%分離膠，染色液用0.5%考馬斯亮藍 R-250，上樣40 μL進行電泳。Bradford法測定可溶性蛋白濃度，每組測定3次。

2 結(jié)果

2.1 黃芩等醇提取物對副溶血性弧菌的抑制活性及MIC和MBC

牛津杯法測定結(jié)果（表1和圖2）顯示，不同中藥醇提物對副溶血性弧菌的抑制活性有很明顯的差異，其中黃芩的效果最好，金銀花的效果最差，抑菌圈直徑分別是22.00±1.00 mm和15.00 mm，雖然都小于卡那霉素形成的抑菌圈（24.00±2.64 mm），但是黃芩形成抑菌圈的大小與其相差較小，而陰性對照組則無抑菌圈的形成。最低抑菌濃度（MIC）是評價抗菌藥物抑菌活性的指標，指在體外用培養(yǎng)基培養(yǎng)16-24 h后，能抑制細菌生長的最低藥物濃度。最低殺菌濃度（MBC）則是指將細菌殺死的最低藥物濃度。MIC和MBC的結(jié)果（表2）也進一步顯示，不同中藥粗提液對副溶血性弧菌的抑制活性存在很大差異。其中黃芩對副溶血性弧菌有十分明顯的抑制效果，MIC和MBC均為3.91 mg/mL。而其他中藥的效果較差，MIC為15.64 mg/mL?；谏鲜鼋Y(jié)果，在隨后的機制研究中，以黃芩為研究對象。

表1 不同中藥醇提物對副溶血性弧菌抑菌圈的大小

圖2 不同中藥對副溶血性弧菌的抑菌圈

表2 不同中藥醇提物對副溶血性弧菌的M IC和MBC

2.2 黃芩醇提物對副溶血性弧菌生長曲線的影響

生長曲線結(jié)果（圖3）顯示，對照組的細菌生長具有典型的生長特征，呈S型生長曲線。當(dāng)菌液中添加1/2MIC藥物時，細菌的活性被部分抑制，細菌的延遲期長達8 h，但是之后細菌也可以進入正常的對數(shù)期和穩(wěn)定期，而且菌的終濃度與對照差距較小。當(dāng)藥物濃度是MIC時，細菌菌液的OD值處于一個平穩(wěn)狀態(tài)，基本沒有變化。這說明在MIC溶度下黃芩醇提物將細菌完全抑制或殺滅，因此細菌不能生長。

圖3 加入不同溶度黃芩后副溶血性弧菌的生長曲線

2.3 殺菌曲線的繪制

黃芩醇提物的殺菌效率通過殺菌曲線來評價。殺菌曲線結(jié)果（圖4）顯示，黃芩的抑菌活性與藥物濃度存在依賴性。隨著培養(yǎng)時間延長，對照組的菌數(shù)穩(wěn)定增加。而當(dāng)藥液為MIC和2MIC時，菌的數(shù)量逐漸減少，并且當(dāng)藥液為MIC時，需要8 h才能將菌全部殺死，當(dāng)藥液為2MIC時，第6 h菌已經(jīng)被完全殺死。

圖4 黃芩對副溶血性弧菌的殺菌曲線

2.4 掃描電鏡觀察

掃描電鏡可以用來觀察微生物細胞在面對外界壓力時的形態(tài)變化，對照組的菌體（圖5-A）為長桿狀，表面光滑，形態(tài)飽滿，沒有細胞破損情況。而用藥組中，有部分菌體（圖5-B）發(fā)生明顯變化，表面粗糙，扭曲變形，并且開始裂解。

圖5 副溶血性弧菌培養(yǎng)6 h后電鏡觀察結(jié)果

2.5 對細胞膜的作用

黃芩醇提物對副溶血性弧菌細胞膜的作用通過測定上清液蛋白含量來評價，結(jié)果（圖6）顯示，經(jīng)黃芩處理后，培養(yǎng)液中的蛋白含量隨著時間的增加而升高，在第8 h時的蛋白含量約為初始時的兩倍。而對照組培養(yǎng)液的蛋白含量雖然出現(xiàn)不規(guī)律的變化，但是一直在較低的水平內(nèi)變化。說明經(jīng)黃芩處理后，菌體的細胞膜受到破壞，蛋白質(zhì)釋放，導(dǎo)致培養(yǎng)液中蛋白含量升高。

圖6 副溶血性弧菌經(jīng)黃芩處理后蛋白釋放情況

2.6 對細菌蛋白表達的影響

通過SDS-PAGE來確定黃芩對副溶血性弧菌的可溶性蛋白的影響，結(jié)果（圖7）顯示，經(jīng)黃芩作用后，與對照組相比，加藥組的副溶血性弧菌蛋白表達在2、4、6和8 h中基本不受影響，沒有條帶的明顯缺失或顏色變淺。經(jīng)Bradford法測其蛋白濃度，結(jié)果（圖8）顯示，在2、4、6和8 h時，加藥組的總蛋白含量也無明顯變化（P＞0.05），說明黃芩對副溶血性弧菌的蛋白表達沒有影響。

圖7 副溶血性弧菌經(jīng)黃芩處理后蛋白變化情況

圖8 副溶血性弧菌經(jīng)黃芩處理后可溶性蛋白含量變化情況

3 討論

近年來抗生素在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的濫用，使得藥物殘留以及細菌耐藥性的問題越來越嚴重，尋找綠色藥物來代替抗生素引起人們的關(guān)注。具有抗菌消炎作用的中草藥在我國已經(jīng)有幾千年的歷史，由于它們的低毒、低殘留等優(yōu)點受到人們的青睞。本研究希望從已證實的有較好抑菌活性的黃芩、大黃、黃連、金銀花中篩選出對副溶血性弧菌有較強抑制作用的中藥［14-17］。抑菌圈結(jié)果顯示，4種中藥對副溶血性弧菌的抑制活性有很大的差異，并且MIC和MBC也與抑菌圈的關(guān)系一致，即抑菌圈直徑越大MIC和MBC越小。黃芩對副溶血性弧菌的抑菌效果最為顯著，這與Rashed等［18］和Duan等［11］的研究一致，他們發(fā)現(xiàn)黃芩對G-和G+都具有很好的抑菌效果。其他3種中藥對副溶血性弧菌的抑制效果較差，可能是它們有效成分對副溶血性弧菌沒有明顯的抑制活性或者由于提取方法不當(dāng)，導(dǎo)致抑菌活性不高。如在張銳利［19］和時維靜［20］的研究中，也發(fā)現(xiàn)通過不同提取方法所得到提取物的抑菌效果相差很大。

菌液的OD600值能夠衡量細菌的數(shù)量，因此OD600的變化可以反映黃芩醇提物對副溶血性弧菌的抑制和殺滅作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)黃芩抑制副溶血性弧菌主要是延長細菌的延遲期，而在一段時間之后細菌依然能夠進入正常的穩(wěn)定期，而且數(shù)量也與對照組一致。楊艾青［21］在研究黃芩對沙門氏菌的生長曲線時也發(fā)現(xiàn)延遲期被延長的結(jié)果，但最后達到的菌濃度比對照組低很多。殺菌曲線的結(jié)果也顯示，在前6 h時，隨著時間的延長，黃芩的殺菌效果變?nèi)酰@與Duan等［11］在研究黃芩提取物對鏈球菌的抑制活性時得到的結(jié)果一致?；诖私Y(jié)果，在后面實驗的取樣測量中選擇前8個小時的生化作為參考指標。

細菌的許多代謝過程都與細胞膜功能相關(guān)，而細胞膜結(jié)構(gòu)的完整是行使正常功能的重要保證。完整的細胞膜具有選擇透過性，帶電離子和大分子物質(zhì)無法自由通過細胞膜屏障，而當(dāng)細胞膜完整性遭到破壞時，首先會導(dǎo)致小分子物質(zhì)如鈉鉀離子的釋放，然后是大分子的蛋白核酸等物質(zhì)釋放到培養(yǎng)液中［22］。如Ikigai等［23］通過脂質(zhì)體模型，發(fā)現(xiàn)黃酮類物質(zhì)對細胞膜造成破壞，導(dǎo)致小分子物質(zhì)從胞內(nèi)滲透出來。Sato等［24］在研究黃酮類物質(zhì)對口腔微生物的抑制活性時，發(fā)現(xiàn)上清液260 nm處的吸光值增加，反應(yīng)細胞內(nèi)的核酸等物質(zhì)的滲漏，說明破壞了細胞膜的完整性。本研究通過測定上清液蛋白濃度來判斷細菌細胞膜是否受到損傷。結(jié)果顯示，經(jīng)過黃芩處理后，上清液的蛋白濃度不斷上升，而對照組的變化很小。而且He等［25］通過同樣的方法，也發(fā)現(xiàn)大腸桿菌經(jīng)黃酮類物質(zhì)處理后上清液蛋白含量顯著性提高。本實驗中，掃描電鏡觀察到細菌形態(tài)的變化，表面變得粗糙，不光滑，表明黃芩對副溶血性弧菌的細胞膜產(chǎn)生破壞作用。Sikkema等［26］報道大部分膜活性抑菌物質(zhì)是強疏水性的，因為疏水性有助于它們在細胞膜上積累，干擾其結(jié)構(gòu)，并且可以通過與細胞壁細胞膜的相互作用對細胞膜造成破壞，導(dǎo)致通透性增加，而黃芩的主要活性成分正是具有較強疏水性的黃酮類物質(zhì)。而且在Tsuchiya等［27］的研究報道中，也發(fā)現(xiàn)由于黃酮類物質(zhì)的疏水性以及C3位的電荷與細胞膜的相互作用，改變了細胞膜的流動性。因此副溶血性弧菌的細胞膜是黃芩的一個作用靶點。在Lee等［28］的研究中也報道了黃酮類物質(zhì)直接對細胞膜的破壞作用。黃芩對副溶血性弧菌的具體抑制機制以及是否存在除了細胞膜之外的其他靶點，需要進一步的研究。

另一方面，由于蛋白質(zhì)在生命活動中扮演著重要的角色，生物合成都離不開蛋白質(zhì)的參與，所以通過對細胞蛋白提取來進一步探索黃芩是否會通過抑制蛋白質(zhì)的表達而達到抑菌效果。雖然Yong等［29］研究抗菌植物對大腸桿菌的抑菌機制時，發(fā)現(xiàn)了7種與蛋白轉(zhuǎn)運和外膜有關(guān)的蛋白合成受到抑制；陳禹先等［30］也發(fā)現(xiàn)黃芩素能強烈抑制耐甲氧西林金黃色葡萄球菌蛋白的表達，但是副溶血性弧菌經(jīng)黃芩處理后，SDS-PAGE的結(jié)果顯示，在不同的處理時間下，蛋白的條帶并沒有發(fā)生明顯變化。進一步對細菌可溶性蛋白含量測定說明，黃芩處理組與對照組的蛋白含量沒有顯著性差異（P＞0.05），說明黃芩對副溶血性弧菌不是通過抑制蛋白合成而起作用。

4 結(jié)論

本研究從常見的4種抑菌中藥黃芩、黃連、大黃、金銀花中篩選對副溶血性弧菌有較好抑制效果的中藥，并對其抑菌機制進行初步研究。結(jié)果表明，黃芩對副溶血性弧菌具有很好的抑制效果，并且其抑菌機制主要是黃酮類物質(zhì)對細胞膜造成破壞，最終導(dǎo)細胞的裂解死亡。

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（責(zé)任編輯 馬鑫）

A Study on Antibacterial M echanism s of Ethanol-extracts from Scutellaria baicalensis Against Vibrio parahaemolyticus

Xie Liling Peng Qi Cai Lianchun Zhou Liang Zhu Yankun Han Guangyao
（College of Science，Shantou University，Shantou515063）

The goal of this work is to screen one with strong antibacterial activities against Vibrio parahaemolyticus from 4 traditional Chinese medicines（TCMs）， and study the underlying mechanisms. The sensitivity of ethanol-extracts from TCMs to Vibrio parahaemolyticus was determined by Oxford cup assay and liquid double dilution method. The antibacterial mechanism was investigated by measuring growth curve and bactericidal curve， electron microscope examination， and SDS-PAGE analysis. The results showed that different ethanol-extracts from 4 TCMs had different antibacterial activities upon V. parahaemolyticus， among them the ethanol-extract from S. baicalensis had the best antibacterial activity with an inhibition zone diameter of 22.00 ± 1.00 mm. Both the minimum inhibitory concentration（MIC）and minimum bactericidal concentration（MBC）of the extract against V. parahaemolyticus were 3.91 mg/mL. V. parahaemolyticus treated with Scutellaria extract in MIC still entered a normal log and stationary phase after a longer lag phase. Bacterial surface became rough， showing a sign of cell lysis. Protein concentration in the supernatant increased significantly. However， the concentration of soluble proteins changed lightly after the treatment of Scutellaria extract. Conclusively， Scutellaria extract has a significant inhibition effect against V. parahaemolyticus by destroying the integrity of cell membrane and causing cell lysis.

Scutellaria baicalensis；Vibrio parahaemolyticus；ethanol-extract；antibacterial mechanism.

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.08.023

2014-12-25

廣東省自然科學(xué)基金項目（S2013010015919），汕頭大學(xué)校內(nèi)國家基金培育項目（NFC14003），廣東省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項目（201410560066）

謝麗玲，女，碩士，副教授，研究方向：生物活性物質(zhì)，E-mail：llxie@stu.edu.cn；彭齊同為本文第一作者