高產(chǎn)武夷菌素wysR基因過表達(dá)菌株的篩選及菌株生物特性研究

王家旺 葛蓓孛 劉艷 劉彥彥 張克誠(chéng)

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所　農(nóng)業(yè)部作物有害生物綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京　100193）

高產(chǎn)武夷菌素wysR基因過表達(dá)菌株的篩選及菌株生物特性研究

王家旺 葛蓓孛 劉艷 劉彥彥 張克誠(chéng)

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所農(nóng)業(yè)部作物有害生物綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100193）

以武夷菌素生物合成正調(diào)控基因wysR過表達(dá)菌株為初選材料，通過瓊脂塊法對(duì)2 060個(gè)過表達(dá)菌株單菌落進(jìn)行初篩，得到35個(gè)優(yōu)選菌株，再采用搖瓶發(fā)酵復(fù)篩的方法篩選出9個(gè)高產(chǎn)菌株，并通過菌株遺傳穩(wěn)定性分析，最終確定W-273菌株為最優(yōu)菌株。研究武夷菌素wysR基因過表達(dá)菌株W-273的生理生化特征，發(fā)現(xiàn)與原始菌株CK-15相比，W-273菌株生長(zhǎng)迅速，產(chǎn)孢量增加且產(chǎn)孢時(shí)間提前，W-273菌株生長(zhǎng)3-4 d即可完成產(chǎn)孢，較菌株CK-15產(chǎn)孢時(shí)間提前了3-4 d；電子顯微鏡觀察W-273菌株和CK-15菌株孢子形態(tài)不同，W-273菌株孢子呈橢圓形或桿狀，CK-15菌株孢子呈圓形；通過搖瓶發(fā)酵表明W-273菌株較CK-15菌株代謝旺盛，抗生素產(chǎn)量提高79%-289%，且最佳發(fā)酵時(shí)間縮短4-8 h。

武夷菌素；過表達(dá)菌株；wysR基因；篩選

武夷菌素（Wuyiencin）是不吸水式鏈霉菌武夷變種（Streptomyces ahygroscopicus var. wuyiensis）產(chǎn)生的農(nóng)用抗生素，主要用于防治作物真菌病害［1］，如黃瓜白粉病，番茄葉霉、灰霉病等，具有廣譜、高效、低毒的特點(diǎn)，在現(xiàn)代化生態(tài)農(nóng)業(yè)和綠色食品生產(chǎn)中具有廣闊的應(yīng)用前景。目前，菌株效價(jià)較低已經(jīng)成為限制武夷菌素產(chǎn)業(yè)化發(fā)展的障礙之一，因此，選育高產(chǎn)菌株、降低生產(chǎn)成本是武夷菌素研究的核心內(nèi)容。

在武夷菌素育種方面，曾采用了原生質(zhì)體融合［2］以及誘變育種的方法包括NTG、紫外誘變、低能碳離子注入和亞硝基胍誘變［3］及60Coγ-射線誘變［4］。雖然采用傳統(tǒng)的育種方法已經(jīng)使原始菌株效價(jià)提高了近1倍多，但由于傳統(tǒng)的育種工作量大，具有不定向性，且菌株經(jīng)過多次傳代培養(yǎng)后易發(fā)生回復(fù)突變。因此，采用基因工程手段進(jìn)行育種，克服傳統(tǒng)育種的隨機(jī)性和盲目性，因其具有目標(biāo)明確、效率高、菌株穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)，成為近年來(lái)研究的熱點(diǎn)。

實(shí)驗(yàn)室前期從原始菌株CK-15中得到一個(gè)武夷菌素生物合成正調(diào)控基因wysR，將該基因克隆至具有強(qiáng)啟動(dòng)子psf的載體PSF14上，接合轉(zhuǎn)移至原始菌株 CK-15中，構(gòu)建了過表達(dá)菌株ooR［5］。通過比較發(fā)現(xiàn)，該菌株較原始菌株的效價(jià)有顯著提升。構(gòu)建過表達(dá)菌株使用的質(zhì)粒是一種整合型穿梭質(zhì)粒載體，其轉(zhuǎn)入鏈霉菌之后與基因組整合的位點(diǎn)是隨機(jī)的，得到的轉(zhuǎn)化子并不全都使抑菌活性得到大幅提高。因此，要想獲得高效、優(yōu)良的菌株必須有一個(gè)進(jìn)一步的篩選過程。通過平皿瓊脂塊法初篩，搖瓶發(fā)酵復(fù)篩的方法從菌株單菌落中篩選高產(chǎn)菌株的方法簡(jiǎn)單可行且比較直觀，廖曉珣等［6］從井岡霉素的吸水鏈霉菌井崗變種J1單菌落中經(jīng)過平皿初篩、搖瓶復(fù)篩獲得菌株J1-U-D，效價(jià)達(dá)25 874×10-6g/mL，比出發(fā)菌株提高29%。

本研究以武夷菌素wysR過表達(dá)菌株ooR為基礎(chǔ)，通過瓊脂塊法初篩、搖瓶發(fā)酵復(fù)篩，以期得到高產(chǎn)、穩(wěn)定的武夷菌素wysR基因過表達(dá)菌株；同時(shí)觀察高產(chǎn)菌株在MS培養(yǎng)基平板不同時(shí)間菌絲孢子生長(zhǎng)情況，檢測(cè)菌株發(fā)酵過程中不同發(fā)酵時(shí)間菌絲體干重、發(fā)酵液糖含量和發(fā)酵液效價(jià)的變化情況，旨為改進(jìn)武夷菌素發(fā)酵工藝和基因工程育種提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株武夷菌素原始菌株CK-15（Streptomyces anhygroscopicus var. wuyiensis CK-15）；武夷菌素wysR基因過表達(dá)菌株ooR（St. wuyiensis ooR），該菌株是將原始菌株CK-15中得到的武夷菌素生物合成正調(diào)控基因wysR克隆至具有強(qiáng)啟動(dòng)子psf的載體PSF14上，重新接合轉(zhuǎn)移至菌株 CK-15中，構(gòu)建的過表達(dá)菌株ooR，前期研究表明菌株ooR在MS培養(yǎng)基上長(zhǎng)勢(shì)良好［7］；生物測(cè)定指示菌用紅酵母（Rhodoiorula rubra），以上菌株均由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所農(nóng)用抗生素組提供。

1.1.2 供試培養(yǎng)基 菌種培養(yǎng)采用MS培養(yǎng)基：20 g黃豆餅粉放入蒸餾水中煮30 min，用4層紗布過濾定容至1 000 mL，每100 mL分裝入盛有2 g甘露醇和1.7 g瓊脂粉的250 mL三角瓶中，121℃高溫濕熱滅菌30 min；生物測(cè)定用PDA培養(yǎng)基：配置見參考文獻(xiàn)［8］；56#發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：玉米粉30、黃豆餅粉20、葡萄糖20、硫酸銨4、碳酸鈣3；可溶性發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖 20、酵母粉20、氯化銨4、硫酸鎂 0.4 。

1.2 方法

1.2.1 發(fā)酵液制備及生物活性測(cè)定

1.2.1.1 發(fā)酵液制備 采用MS培養(yǎng)基28℃恒溫培養(yǎng)武夷菌素產(chǎn)生菌，培養(yǎng)5-7 d后用滅菌牙簽將培養(yǎng)基劃成1 cm2菌塊至裝有50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，28℃、220 r/min搖床震蕩培養(yǎng)，濾紙過濾即得發(fā)酵液。

1.2.1.2 生物活性測(cè)定 采用PDA培養(yǎng)基以紅酵母為指示菌，管碟法［9］測(cè)定武夷菌素效價(jià)，武夷菌素效價(jià)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：y=7.6932x-106.33，R2=0.977（x代表抑菌圈直徑，y代表標(biāo)準(zhǔn)液濃度）。

1.2.2 武夷菌素高產(chǎn)菌株篩選

1.2.2.1 單孢子懸浮液的制備 在武夷菌素wysR基因過表達(dá)菌株的MS培養(yǎng)基表面加入10 mL無(wú)菌水，用滅菌牙簽刮取培養(yǎng)基表面孢子，滅菌紗布過濾，將菌絲體和單個(gè)孢子分開，過濾液即為單孢子懸浮液。

1.2.2.2 瓊脂塊法初篩 單孢子懸浮液稀釋后均勻涂布于MS培養(yǎng)基平板上，28℃恒溫培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)3 d。用滅菌打孔器打出直徑為5 mm的單菌落瓊脂塊，接種針挑取單菌落瓊脂塊置于含3%紅酵母菌的PDA培養(yǎng)基表面，間隔一定距離擺放，帶菌面朝上，28℃培養(yǎng)24 h，挑選抑菌圈直徑較大的菌株轉(zhuǎn)接到MS培養(yǎng)基，28℃恒溫培養(yǎng)7 d。

1.2.2.3 搖瓶發(fā)酵復(fù)篩 待初篩獲得的菌株在MS表面產(chǎn)生大量孢子，接種到發(fā)酵培養(yǎng)基，搖瓶發(fā)酵60 h，管碟法測(cè)效價(jià)。每個(gè)菌株重復(fù)3瓶，取平均值，以原始菌株為對(duì)照，篩選出幾株較優(yōu)菌株。

1.2.2.4 遺傳穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 將經(jīng)復(fù)篩選出的菌株，接種于MS平板培養(yǎng)基上進(jìn)行傳代培養(yǎng)5代，觀察各代菌株生長(zhǎng)狀況，并對(duì)各代菌株進(jìn)行搖瓶發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，管碟法測(cè)效價(jià)，分析比較傳代前后菌株產(chǎn)素能力的變化。

1.2.3 高產(chǎn)菌株生物特性研究

1.2.3.1 高產(chǎn)菌株形態(tài)特征和培養(yǎng)特征的觀察 在MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)過表達(dá)菌株W-273和原始菌株CK-15，每天觀察記錄菌株在MS培養(yǎng)基平板上的生長(zhǎng)情況。并采用插片培養(yǎng)法［10］分別在光學(xué)顯微鏡和電子顯微鏡下觀察菌絲和孢子生長(zhǎng)情況及形態(tài)特征，光學(xué)顯微鏡鏡檢時(shí)用鑷子小心拔出蓋玻片，有菌的一面朝下放在載玻片上直接觀察即可；電子顯微鏡鏡檢時(shí)先將蓋玻片放入2%-4%戊二醛固定液中固定1-2 d，0.1 mol/L pH7.2 PBS緩沖液洗，用1% OsO4后固定1-2 h用重蒸水沖洗30 min，隨后用30%、50%、70%、80%、90%、95%和100%乙醇梯度脫水，每級(jí)15-20 min，樣品脫水后用醋酸異戊酯處理，CO2臨界點(diǎn)干燥，干燥好的樣品粘貼在樣品臺(tái)上，用離子濺射儀表面噴金，噴金后樣品在掃描電鏡下掃描，拍照并記錄。每天取蓋玻片在光學(xué)顯微鏡下觀察菌絲和孢子生長(zhǎng)情況，待產(chǎn)生大量孢子后在電子顯微鏡下觀察孢子形態(tài)。

1.2.3.2 菌絲體干重測(cè)量 將過表達(dá)菌株W-273和原始菌株CK-15接種到純液體發(fā)酵培養(yǎng)基，發(fā)酵培養(yǎng)8、16、24、32、40、48、56、64、72和80 h后，發(fā)酵液用事先稱好重量的濾紙過濾，過濾完在80℃烘箱烘4 h后稱重，稱重重量減去濾紙重量即為菌絲體干重。

1.2.3.3 發(fā)酵液總糖含量 在56#發(fā)酵培養(yǎng)基中接種過表達(dá)菌株W-273和原始菌株CK-15，發(fā)酵培養(yǎng) 8、16、24、32、40、48、56、64、72和 80 h后采用DNS法［11］測(cè)定發(fā)酵液中總糖含量，以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品制定的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.642x+ 0.0406，R2=0.9966（x代表520 nm吸光值，y代表葡萄糖含量）。

1.2.3.4 武夷菌素效價(jià) 在56#發(fā)酵培養(yǎng)基中接種過表達(dá)菌株W-273和原始菌株CK-15，發(fā)酵培養(yǎng)24、32、40、48、56、64、72和80 h后管碟法檢測(cè)武夷菌素效價(jià)。

2 結(jié)果

2.1 武夷菌素高產(chǎn)菌株篩選

2.1.1 高產(chǎn)菌株篩選 將單孢子懸浮液涂布于MS培養(yǎng)基28℃培養(yǎng)3 d后，產(chǎn)生的單菌落經(jīng)瓊脂塊法初篩，從2 060株菌株中選育出35株抑菌圈直徑相對(duì)較大菌株，搖瓶發(fā)酵復(fù)篩后管碟法測(cè)效價(jià)，結(jié)果見表1，其中菌株W-20、W-141、W-273、W-306、W-381、W-443、W-602、W-802、W-995的效價(jià)最高，較菌株CK-15效價(jià)提高195%-258%，選定這9株菌株作為第一代菌株進(jìn)行遺傳穩(wěn)定性測(cè)定。

2.1.2 高產(chǎn)菌株的遺傳穩(wěn)定性 將篩選到的高產(chǎn)菌株再傳代4次，共5代菌株，觀察各代菌株生長(zhǎng)狀況，菌株W-381和W-1001分別傳至第4代和第5代時(shí)菌株生長(zhǎng)減慢、產(chǎn)孢時(shí)間推遲、產(chǎn)孢量減少，需培養(yǎng)7-8 d完成整個(gè)生長(zhǎng)過程，其他菌株生長(zhǎng)穩(wěn)定。并分別對(duì)各代菌株進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，測(cè)定效價(jià)，結(jié)果見表2。篩選到的菌株第一代效價(jià)均值可達(dá)到8 309 μg/mL，從第一代傳到第二代后菌株效價(jià)下降明顯，再傳代后除菌株W-273和W-443外其他菌株效價(jià)均有不同程度的下降，菌株W-273和W-443傳代穩(wěn)定性較好，且W-273菌株效價(jià)較W-443菌株高，最終確定W-273菌株為篩選到的最優(yōu)菌株，已將該菌株保存至中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心（保藏號(hào)為9604）。

2.2 高產(chǎn)菌株W-273生物特性

2.2.1 菌株生理形態(tài)特征 將高產(chǎn)菌株W-273和原始菌株CK-15接種到MS培養(yǎng)基平板，觀察生長(zhǎng)狀況及用插片法觀察菌絲及孢子生長(zhǎng)狀況，由圖1可知，高產(chǎn)菌株W-273較原始菌株CK-15菌絲生長(zhǎng)較快產(chǎn)孢量增加且產(chǎn)孢時(shí)間提前，高產(chǎn)菌株W-273生長(zhǎng)3-4 d即可完成產(chǎn)孢，較原始菌株CK-15提前3-4 d。菌株W-273孢子比菌株CK-15孢子稍大，且W-273菌株孢子呈橢圓形或桿狀，CK-15菌株孢子呈圓形（圖2）。

2.2.2 菌株的生理生化特征 將高產(chǎn)菌株W-273和原始菌株CK-15接種到可溶性發(fā)酵培養(yǎng)基56#發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵不同時(shí)間后，分別測(cè)量菌絲體干重、發(fā)酵液總糖含量以及武夷菌素效價(jià)。圖3顯示，菌株W-273在8-24 h時(shí)菌絲體生長(zhǎng)量最多，而菌株CK-15在16-24 h時(shí)菌絲體生長(zhǎng)量最多，菌株W-273較CK-15菌絲大量生長(zhǎng)時(shí)間提前約4-8 h。對(duì)應(yīng)不同發(fā)酵時(shí)間發(fā)酵液總糖含量，發(fā)酵過程中菌株W-273消耗糖含量最多的兩個(gè)時(shí)間段為發(fā)酵前期的8-16 h和24-32 h，菌株CK-15要推遲到16-24 h和32-40 h，這兩個(gè)時(shí)間段可能分別為菌絲體生長(zhǎng)最迅速的時(shí)段以及菌株開始產(chǎn)生抗生素的時(shí)段，兩個(gè)時(shí)段W-273菌株較CK-15菌株約提前8 h。

表1 武夷菌素產(chǎn)生菌搖瓶復(fù)篩結(jié)果

表2 武夷菌素高產(chǎn)菌株的遺傳穩(wěn)定性

如圖4所示，W-273發(fā)酵24 h后發(fā)酵液已經(jīng)有較低的抑菌活性，對(duì)應(yīng)的CK-15菌株發(fā)酵液要推遲至32 h，并且W-273菌株發(fā)酵最優(yōu)時(shí)間為56 h，較CK-15菌株的64 h提前約8 h。過表達(dá)菌株W-273效價(jià)穩(wěn)定在5 000-7 000 μg/mL，較野生菌株CK-15效價(jià)1 800-2 800 μg/mL提高79%-289%，W-273菌株發(fā)酵液抑菌活性明顯增強(qiáng)（圖5）。

3 討論

近年來(lái)，基因工程技術(shù)在抗生素的改造及菌種選育工作中的應(yīng)用越來(lái)越多［12］，其中常用的方法包括改造代謝途徑、改造抗生素生物合成基因簇、改造核糖體和原生質(zhì)體融化技術(shù)。

生物合成基因簇?cái)y帶編碼調(diào)控因子的調(diào)控基因，調(diào)控因子是一類在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)基因表達(dá)的蛋白質(zhì)，它們能特異性地結(jié)合到該基因簇中的核酸調(diào)控元件，激活或阻礙抗生素結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄成mRNA。過量表達(dá)編碼激動(dòng)子基因和失活編碼阻遏子的基因，是增加抗生素的最為快速有效的方法［13］。Anton等［14］通過增加納他鏈霉菌中編碼PAS/LuxR激動(dòng)子pimM基因的拷貝數(shù)使匹馬霉素產(chǎn)量提高了2.4倍。Martinz-Costa等［15］通過將變鉛青鏈霉菌內(nèi)編碼LysR-type 轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子的基因actVB-orf10失活，使放線菌紫素產(chǎn)量提高3.5-5倍。

圖1 高產(chǎn)菌株W-273菌絲孢子觀察結(jié)果

圖2 高產(chǎn)菌株W-273孢子電鏡掃描圖

圖3 不同發(fā)酵時(shí)間菌株W-273菌絲體生長(zhǎng)情況及發(fā)酵液總糖含量變化

武夷菌素生物合成基因簇中的wysR基因包含功能保守的PAS-LuxR結(jié)構(gòu)域，研究表明PAS-LuxR調(diào)控子在不同的多烯類鏈霉菌中有著相同的調(diào)控方式，這些基因負(fù)責(zé)聚酮化合物鏈的構(gòu)建，糖基的脫水與鏈接，ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白以及作為調(diào)控的靶基因［16］。Anton等［14］研究中報(bào)道了含有PAS-LuxR 結(jié)構(gòu)域的調(diào)控因子PimM是匹馬霉素生物合成途徑中的正調(diào)控因子。魏杰等［17］將納他霉素生物合成基因簇中的基因PimM置于強(qiáng)啟動(dòng)子PermE 之下進(jìn)行整合性表達(dá)，構(gòu)建過表達(dá)載體PBJPM，并接合轉(zhuǎn)移至金褐鏈霉菌SYAU0709中，通過搖瓶發(fā)酵和HPLC檢測(cè)分析發(fā)現(xiàn)，有些轉(zhuǎn)化子的金褐霉素產(chǎn)量比野生型菌株提高3-4倍，說明PimM基因在金褐鏈霉菌中有促進(jìn)金褐霉素合成的作用，并且遺傳性能穩(wěn)定。

圖4 發(fā)酵過程中菌株W-273發(fā)酵不同時(shí)間效價(jià)變化

圖5 培養(yǎng)3 d后W-273菌株發(fā)酵液對(duì)紅酵母的抑菌效果

前期劉彥彥等［5］將wysR基因克隆至具有強(qiáng)啟動(dòng)子psf的載體PSF14上，并接合轉(zhuǎn)移至原始菌株 CK-15中，構(gòu)建了過表達(dá)菌株ooR，效價(jià)穩(wěn)定在3 000-4 000 μg/mL。傳統(tǒng)的誘變方法具有盲目性和隨機(jī)性，突變率僅有1/103-1/106，并且突變株中多數(shù)為負(fù)向變異，正突變率低［18］，導(dǎo)致育種工作量大，隨機(jī)性強(qiáng)，效率低下。本實(shí)驗(yàn)通過瓊脂塊法及搖瓶發(fā)酵的方法篩選高產(chǎn)過表達(dá)菌株，最終從2 060株過表達(dá)菌株中篩選得到高產(chǎn)菌株W-273，較出發(fā)菌株ooR效價(jià)提高1倍?；蚬こ逃N目標(biāo)明確，正突變率顯著提高，此次篩選的2 060株過表達(dá)菌株的抑菌效果較原始菌株均有顯著的提高，工作量減小，育種效率顯著提高。

通過MS培養(yǎng)基平板和插片法顯微鏡觀察wysR基因過表達(dá)菌株W-273菌絲孢子生長(zhǎng)情況，結(jié)合發(fā)酵過程中的生理生化指標(biāo)包括菌絲體干重、發(fā)酵液糖含量和發(fā)酵液抑菌活性，比較其生物學(xué)特性。結(jié)果表明與原始菌株CK-15相比，W-273菌株生長(zhǎng)迅速，產(chǎn)孢量增加且產(chǎn)孢時(shí)間提前；W-273菌株較CK-15菌株代謝旺盛，發(fā)酵前期菌絲體增長(zhǎng)快，糖消耗量大，產(chǎn)素時(shí)間提前4-8 h，并且抗生素產(chǎn)量提高79%-289%，說明wysR基因可以正調(diào)控菌株的生長(zhǎng)速率、產(chǎn)孢量及武夷菌素的生物合成，這一結(jié)論與劉彥彥［5］的結(jié)論是一致的。觀察菌株孢子形態(tài)，W-273菌株孢子呈橢圓形或桿狀，CK-15菌株孢子呈圓形；W-273菌株菌體形態(tài)的變化說明wysR不僅與武夷菌素的生物合成有關(guān)，而且可以影響菌體形態(tài)分化，這與天藍(lán)色鏈霉菌的情況相類似，天藍(lán)色鏈霉菌中bld、afs、abs等基因不僅可以調(diào)控抗生素的生物合成，而且可以影響菌體的生長(zhǎng)［19］，而基因影響菌體形態(tài)變化的分子機(jī)制有待進(jìn)一步的研究。

4 結(jié)論

通過瓊脂塊法初篩以及搖瓶發(fā)酵復(fù)篩的方法從武夷菌素wysR基因過表達(dá)菌株單菌落中篩選出高產(chǎn)武夷菌素wysR基因過表達(dá)菌株W-273。研究W-273菌株的生物學(xué)特征，發(fā)現(xiàn)W-273菌株生長(zhǎng)迅速，產(chǎn)孢量增加且產(chǎn)孢時(shí)間提前，W-273菌株產(chǎn)孢時(shí)間較菌株CK-15提前了3-4 d；電子顯微鏡觀察W-273孢子呈橢圓形或桿狀，CK-15菌株孢子呈圓形；通過搖瓶發(fā)酵表明W-273菌株較CK-15菌株代謝旺盛，抗生素產(chǎn)量提高79%-289%，且最佳發(fā)酵時(shí)間縮短4-8 h，W-273菌株可以滿足工業(yè)生產(chǎn)需要。

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（責(zé)任編輯 李楠）

Screening of High-yield Strain of W uyiencin Gene wysR Overexpression and Its Biological Characteristics

Wang Jiawang Ge Beibei Liu Yan Liu Yanyan Zhang Kecheng
（State Key Laboratory for Biology of Plant Diseases and Insect Pests，Institute of Plant Protection，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing100193）

In this research the over-expression strains with positive-regulating gene wysR synthesized from Wuyiencin were utilized as primary materials， 35 relatively optimal strains were selected from 2060 individual colonies of over-expression strains by agar blocks， then 9 high-yield strains were screened out adopting the method of shake flask fermentation. Ultimately， the strain W-273 was determined as the optimal strain by genetic stability analysis. Comparing the physiological and morphological characteristics between the strain of W-273 and original CK-15， W-273 strain grew faster， the production of spore was higher， and the time of spore production was in advance. The time to complete spore production for W-273 strain was 3-4 d， and this was in advance for 3-4 d than the original strain CK-15. Through electron microscope observation， the spores of W-273 were oval or rod， and the CK-15 strains were circular. Shake flask fermentation showed that strain W-273 had a higher metabolism compared to strain CK-15， antibiotic production increased 79%-289%， and the best fermentation time shortened 4-8 h.

Wuyiencin；over-expression strain；wysR gene；screen

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.08.019

2014-11-17

公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項(xiàng)（201103002，201303025），國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31371985， 31401796）

王家旺，男，碩士研究生，研究方向：農(nóng)用抗生素；E-mail：wjiawang1014@163.com

張克誠(chéng)，男，博士，研究員，研究方向：農(nóng)用抗生素；E-mail：zhangkecheng@sina.com