磁性納米材料載體固定纖維素酶技術(shù)研究進(jìn)展

邢朝暉蘇躍龍張琦阮馨怡林燕王欣澤孔海南

（1.上海交通大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，上海　200240；2.云龍縣環(huán)境監(jiān)測(cè)站，大理　672700）

磁性納米材料載體固定纖維素酶技術(shù)研究進(jìn)展

邢朝暉1蘇躍龍2張琦1阮馨怡1林燕1王欣澤1孔海南1

（1.上海交通大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，上海200240；2.云龍縣環(huán)境監(jiān)測(cè)站，大理672700）

生物質(zhì)原料轉(zhuǎn)化為還原性糖，從而為生物質(zhì)燃料乙醇的生產(chǎn)提供基礎(chǔ)原料。針對(duì)現(xiàn)在游離酶生產(chǎn)工藝中的不足，研究者提出了纖維素酶固定化技術(shù)，其中以磁性納米材料作為纖維素酶的固定化載體，不僅可提高纖維素酶的催化性能，增強(qiáng)酶的穩(wěn)定性，而且以外加磁場(chǎng)代替?zhèn)鹘y(tǒng)的機(jī)械攪拌方式可充分發(fā)揮載體材料的磁響應(yīng)性，從而使制備的固定化酶從反應(yīng)體系中易于分離，高效且具有重復(fù)性。研究者們提出了很多優(yōu)秀的纖維素酶固定化方案，綜述了近年來(lái)磁性納米材料固定纖維素酶的不同方法，并對(duì)其做了較為詳細(xì)的闡述，在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步對(duì)其優(yōu)缺點(diǎn)和發(fā)展前景進(jìn)行了討論。

生物乙醇；纖維素酶；酶固定化；磁性納米載體

木質(zhì)纖維素是地球上已知的最為豐富的可再生有機(jī)物質(zhì)，利用纖維素酶的生物催化能力可將大量未被利用的廢棄木質(zhì)纖維素轉(zhuǎn)化為生物乙醇［1］，具有可觀的經(jīng)濟(jì)效益和環(huán)境效益。酶的水解過(guò)程是木質(zhì)纖維素轉(zhuǎn)化為生物乙醇的關(guān)鍵步驟，但游離纖維素酶在工業(yè)上的應(yīng)用并不理想：游離的纖維素酶在高溫、強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、高離子濃度及存在部分有機(jī)溶劑等條件下不夠穩(wěn)定，容易失活而降低其催化能力，難以實(shí)現(xiàn)回收和重復(fù)利用，造成了在工業(yè)應(yīng)用上的很大限制。采用固定化技術(shù)對(duì)纖維素酶進(jìn)行固定，可提高其穩(wěn)定性和抗抑制性，使其能重復(fù)使用，在一定程度上提高其催化活性和選擇性［2-4］。但是酶的固定化技術(shù)中酶使用后的分離限制了酶固定化技術(shù)的進(jìn)一步應(yīng)用，其中載體材料的選擇影響著酶的活性以及后續(xù)工藝的開(kāi)展，是現(xiàn)今研究的關(guān)鍵之一［5］。在多種載體材料中，磁性納米載體除可有效固定化纖維素酶外，還可利用外加磁場(chǎng)替代工業(yè)生產(chǎn)中的傳統(tǒng)攪拌方式；與其他載體材料相比，磁性納米載體無(wú)毒、比表面積大、機(jī)械強(qiáng)度優(yōu)良。復(fù)合型的納米磁性材料是將納米磁性材料與特定的載體材料相結(jié)合設(shè)計(jì)的新型載體材料，目前這方面的技術(shù)具有很大的發(fā)展?jié)摿Α?/p>

本文介紹了纖維素酶的固定化技術(shù)發(fā)展進(jìn)程，就近年來(lái)的研究熱點(diǎn)——磁性納米材料載體，總結(jié)歸納了建立在磁性納米材料載體上的纖維素酶固定化方法研究，著重分析了以殼聚糖—磁性納米材料為代表的復(fù)合載體的優(yōu)缺點(diǎn)以及進(jìn)一步開(kāi)發(fā)的方向，旨在為后續(xù)的纖維素酶固定化研究提供一定的參考。

1 纖維素酶固定化發(fā)展過(guò)程

酶的固定化技術(shù)最早由Nelson和Griffin［6］在1916年提出，他們發(fā)現(xiàn)將蔗糖酶與氧化鋁和焦炭結(jié)合以后，蔗糖酶仍具有催化活性。至20世紀(jì)80年代這一意外的發(fā)現(xiàn)才被接受為近代酶固定化技術(shù)的基石，隨后固定化酶的技術(shù)得到了長(zhǎng)足的發(fā)展［7］?，F(xiàn)階段，酶的固定化（Immobilization of enzymes）主要是指利用物理或化學(xué)的方法將酶束縛在一定區(qū)域內(nèi)，使得酶分子仍能進(jìn)行其特有的催化反應(yīng)并能有效回收重復(fù)使用的技術(shù)［8，9］。傳統(tǒng)意義上用來(lái)固定化酶的載體也可以特異性地用來(lái)固定纖維素酶［10］，其中最為常見(jiàn)的種類包括：無(wú)機(jī)載體、合成高分子載體、天然高分子載體以及復(fù)合載體等［11］，各類載體都有廣泛的應(yīng)用。

無(wú)機(jī)載體是最早應(yīng)用于固定化酶的載體材料，之后載體除了充當(dāng)酶的固定化支持物以外，在實(shí)際應(yīng)用中還可以用于改造酶的性質(zhì)、提高酶的催化活性、穩(wěn)定性與選擇性［12，13］。高分子載體（天然及合成載體）相對(duì)于無(wú)機(jī)載體，可供修飾的官能團(tuán)增多，其表面性質(zhì)、電荷分布和尺寸大小都可以預(yù)先設(shè)計(jì)以滿足實(shí)際要求［14］。復(fù)合載體兼具了組合材料的優(yōu)良性質(zhì)，不再單一選擇載體材料，具有更加自由的開(kāi)發(fā)空間。各類固定化載體在實(shí)際研究中并沒(méi)有嚴(yán)格的時(shí)間先后順序和絕對(duì)的優(yōu)劣性，這是由于纖維素酶分子結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性和多樣性，不可能有一種固定化方法和固定化載體是適用于每一種工業(yè)應(yīng)用的。因此，針對(duì)需要研究的酶的使用狀況開(kāi)發(fā)及選擇新的固定化方法和固定化載體顯得尤為重要。

近年來(lái)，納米材料的優(yōu)良性能逐漸顯現(xiàn)［15］，研究者們逐漸把目光投向開(kāi)發(fā)納米材料作為酶的固定化載體研究［16］。從實(shí)際應(yīng)用的層面出發(fā)，納米材料也是一類特殊的無(wú)機(jī)載體，因此兼具了無(wú)機(jī)載體的優(yōu)良性質(zhì)，納米材料是指廣義上三維空間中至少有一維處于納米尺度范圍或者由該尺度范圍的物質(zhì)為基本結(jié)構(gòu)單元所構(gòu)成的材料，同時(shí)納米尺寸的物質(zhì)因具有與宏觀物質(zhì)所迥異的表面效應(yīng)、小尺寸效應(yīng)、宏觀量子隧道效應(yīng)等，可以構(gòu)建不同的形狀［17，18］，應(yīng)用于制備固定化纖維素酶［19］。在實(shí)驗(yàn)室階段，納米粒子作為纖維素酶固定化載體時(shí)表現(xiàn)出了優(yōu)良的性質(zhì)［20］，但是實(shí)際工業(yè)生產(chǎn)中仍然存在不易分離、酶固載率偏低和酶活力回收率較低等問(wèn)題。為了有效的解決上述問(wèn)題，研究者們通過(guò)固定化策略的改進(jìn)［21］，包括結(jié)合不同的固定化技術(shù)、設(shè)計(jì)開(kāi)發(fā)新的固定化載體以及固定化條件，來(lái)提高固定化酶的催化活性、選擇性和穩(wěn)定性，磁性納米材料的應(yīng)用是其中一個(gè)有效方法［22］。當(dāng)固定化酶載體具有磁性時(shí)，制備得到的固定化酶易于從反應(yīng)體系中分離回收，操作簡(jiǎn)單；同時(shí)可以利用外加磁場(chǎng)代替?zhèn)鹘y(tǒng)的攪拌方式。

2 磁性納米材料固定纖維素酶研究進(jìn)展

傳統(tǒng)使用的磁性材料是四氧化三鐵，一般而言，鐵的氧化物及羥基氧化物，按價(jià)態(tài)、晶型和結(jié)構(gòu)的不同可分為（α-，β-，γ-）Fe2O3、Fe3O4、FeO和（α-、β-、γ-和δ-）FeOOH，其中研究較多和具有實(shí)用價(jià)值的鐵的氧化物主要有Fe3O4、γ-Fe2O3及α-Fe2O3等［23］?，F(xiàn)階段由于纖維素酶結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性，研究者一直在尋找合適的固定化方法，基于磁性納米粒子與固定的纖維素酶的結(jié)合方式，本文將固定化方案大致分為3類，即直接固定、修飾固定及復(fù)合載體進(jìn)行固定。

2.1 直接固定

將纖維素酶直接固定在磁性納米顆粒表面可以克服有孔載體普遍存在的擴(kuò)散阻力，單一的磁性納米粒子具有更高的磁響應(yīng)性和更大的比表面積。有關(guān)酶直接固定在磁性納米粒子表面的固定化機(jī)理一般認(rèn)為：通過(guò)化學(xué)共沉淀法制備的磁性納米粒子屬于“巨型離子”，其表面會(huì)在特定的溶液體系中吸附氫氧根離子從而帶有正（負(fù)）電荷（粒子表面在吸附氫氧根后還會(huì)因?yàn)闅溲醺碾姾尚?yīng)結(jié)合其他陽(yáng)離子，因此其所處的離子環(huán)境決定了粒子吸附后的電荷表現(xiàn)）從而導(dǎo)致粒子在堿性環(huán)境中表面帶有負(fù)電荷，而在酸性環(huán)境中表面帶有正電荷。有研究指出在pH7.5時(shí)OH-在粒子表面的電荷效應(yīng)為零，這時(shí)粒子表面電荷密度很小并且極易團(tuán)聚［24］。Bacri等指出-OH在pH6-10的范圍內(nèi)都會(huì)被吸附保留在粒子表面。因此直接固定化主要是使粒子表面自由的羥基和酶的氨基結(jié)合使得其固定在粒子表面［25］。由于使用磁性納米材料進(jìn)行纖維素酶固定化的簡(jiǎn)易性引起了人們廣泛的興趣，表1從載體制備到固定化效果梳理了常見(jiàn)的纖維素酶固定化方案。

表1 纖維素酶直接固定在磁性納米載體

在直接固定化中，更加常見(jiàn)和成熟的方案是共價(jià)吸附法［30］。表1中列舉的前幾項(xiàng)研究都建立在此方法之上。一般在載體結(jié)合酶的時(shí)候要經(jīng)過(guò)兩個(gè)階段：吸附與共價(jià)結(jié)合。當(dāng)酶分子在溶液中因?yàn)槲锢碜饔每拷鼛в谢瘜W(xué)功能基團(tuán)位點(diǎn)的載體附近后，足夠接近的酶分子上的非活性部位基團(tuán)與載體上數(shù)量足夠的活性化學(xué)功能團(tuán)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，使得酶分子結(jié)合到載體上。雖然直接固定不需要對(duì)磁性納米粒子進(jìn)行修飾，流程較為簡(jiǎn)單，在這種條件下，酶的活力取決于吸附與共價(jià)結(jié)合兩個(gè)操作過(guò)程［31］，擴(kuò)散限制、載體活性位點(diǎn)官能團(tuán)和固定化條件、體系的pH及溫度等都會(huì)影響酶的活性。表1顯示，直接固定條件的選擇存在多樣性，而共價(jià)結(jié)合的取向難以控制［32］，從而導(dǎo)致了酶活力的差異。20世紀(jì)70年代就有研究者提出，固定化載體和酶之間的靜電復(fù)合物對(duì)于固定化酶的活性與穩(wěn)定性具有重要意義，不同的活化劑選擇、固定化條件的控制都會(huì)導(dǎo)致纖維素酶的固載率和酶活力的差異，從而導(dǎo)致應(yīng)用上的局限。除了磁性納米粒子的物理特性（粒徑、比表面積以及粒子形貌等）的差異，選擇合適的活化劑，調(diào)控合適的固定化條件仍是現(xiàn)在研究的重點(diǎn)。表1中列舉的方案多采用水溶性碳二亞胺活化纖維素酶再將其與磁性納米粒子交聯(lián)固化，無(wú)論是EDC還是CDI，價(jià)格都偏高，若需要大規(guī)模生產(chǎn)經(jīng)濟(jì)成本較高，有待進(jìn)一步尋找合適的交聯(lián)活化劑。

2.2 修飾固定

相比較直接將酶固定于磁性納米粒子，對(duì)載體表面化學(xué)修飾后使其帶上各種反應(yīng)性功能基團(tuán)（如環(huán)氧基、羰基或氨基等），可在一定程度上增加其結(jié)合酶的強(qiáng)度［33］，使得固定化酶不易脫落［34］，同時(shí)因?yàn)椴糠中揎椃椒ㄐ枰M(jìn)行較為劇烈的化學(xué)反應(yīng)，因此可能會(huì)對(duì)酶的活性中心造成相對(duì)的損傷，從而導(dǎo)致固定化酶活性的下降，所以在修飾固定化纖維素酶時(shí)需要格外注意修飾的功能團(tuán)化學(xué)生物性質(zhì)以及修飾方法的溫和性，盡量不要對(duì)固定化的酶催化性能造成損失，表2列舉了近年來(lái)常見(jiàn)的幾種較為成熟的修飾固定纖維素酶的方法。

表2 纖維素酶固定在表面修飾的磁性納米載體

修飾固定法的設(shè)計(jì)理念是：先經(jīng)過(guò)與化學(xué)試劑反應(yīng)使得制備的磁性納米顆粒表面帶上特定的官能團(tuán)，再通過(guò)物理或化學(xué)作用讓酶分子接近反應(yīng)位點(diǎn)并與活化的官能團(tuán)結(jié)合，從而使得酶分子牢固結(jié)合到載體上［39］。在表2列舉的固定化方法中，經(jīng)過(guò)多批次的水解之后，固定纖維素酶仍保有相當(dāng)高的酶活性，這說(shuō)明了經(jīng)過(guò)修飾的載體與酶分子間的結(jié)合更為牢固，并且可以重復(fù)水解纖維素。修飾載體上共價(jià)結(jié)合的酶可以看作是經(jīng)過(guò)化學(xué)或物理作用修飾過(guò)的酶，它們的理化性質(zhì)被所使用的載體修飾了。在進(jìn)行固定化的時(shí)候，酶和載體上修飾的化學(xué)官能團(tuán)發(fā)生反應(yīng)，這改變了酶的構(gòu)象，同時(shí)酶分子的空間取向也因?yàn)榻Y(jié)合到反應(yīng)位點(diǎn)而發(fā)生了相應(yīng)的改變，因此酶的化學(xué)性質(zhì)也相應(yīng)改變，這都使得成功固定化的纖維素酶在催化性能、選擇性和穩(wěn)定性上都比傳統(tǒng)吸附法固定的酶或天然酶有了顯著提升。

2.3 復(fù)合載體固定

以磁性納米粒子作為載體直接通過(guò)吸附、偶聯(lián)的方式固定纖維素酶，操作要求較低、工藝較為簡(jiǎn)便，易于實(shí)現(xiàn)工業(yè)化，但是直接固定往往導(dǎo)致纖維素酶的固載量偏低，這是由于簡(jiǎn)單吸附的附著力較弱，酶分子易脫落，即使是使用脫水劑活化之后共價(jià)結(jié)合，也較容易受到溶液環(huán)境的影響，在表1實(shí)驗(yàn)方案中的高固載率往往要在比較低的纖維素酶投加量下得到，且高固載率下的重復(fù)性能仍待實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證；以表面功能化的磁性納米粒子作為載體固定纖維素酶，雖然可以通過(guò)增加粒子表面的可用官能團(tuán)數(shù)量，或者利用復(fù)雜化的空間結(jié)構(gòu)提高酶分子與結(jié)合位點(diǎn)的反應(yīng)機(jī)會(huì)，從而增加酶分子的固載量，但是表2固定化方法中，化學(xué)修飾相對(duì)繁瑣，操作要求較高，而且經(jīng)過(guò)復(fù)雜的表面修飾，高刺激性的化學(xué)試劑殘留也可能會(huì)對(duì)酶的生物特性產(chǎn)生影響。另外，由于共價(jià)結(jié)合改變了酶分子的空間構(gòu)象，有時(shí)反而會(huì)使固定的纖維素酶酶活降低。因此，研究者們開(kāi)始研究以磁性高分子微球?yàn)檩d體的復(fù)合固定化酶技術(shù)。對(duì)于無(wú)孔的磁性載體顆粒，如以包覆法制備的微球，在可分離的非均相反應(yīng)體系中，顆粒越小，其固定化的表面積越大，越有利于增加載體的固載量；對(duì)于制備的多孔載體，因?yàn)闀?huì)有濃度梯度的存在，滲透到載體內(nèi)部的酶分子會(huì)因?yàn)閿U(kuò)散限制出現(xiàn)功能性失活，通常在制備載體微球時(shí)可以通過(guò)改變載體制備條件，如致孔劑，交聯(lián)劑的選擇和濃度，控制載體的孔隙率，對(duì)于較大的顆粒，酶活可以通過(guò)酶的固載率進(jìn)行控制。另外復(fù)合載體兼有強(qiáng)磁響應(yīng)性、高比表面積、機(jī)械強(qiáng)度高、單分散性好的優(yōu)勢(shì)。其中四氧化三鐵-殼聚糖復(fù)合載體因?yàn)槠淞己玫臋C(jī)械性能、化學(xué)穩(wěn)定性以及抗金屬離子干擾等優(yōu)點(diǎn)而備受關(guān)注。

殼聚糖本身也可以單獨(dú)成為纖維素酶的固定化載體［40］，結(jié)合磁性材料的殼聚糖復(fù)合載體繼承了其生物大分子的特性［41］，目前，磁性殼聚糖微球的結(jié)構(gòu)可分為3類［42］：核-殼結(jié)構(gòu)，磁性材料為核，高分子材料為殼；混合結(jié)構(gòu)，磁性材料分散在磁性微球內(nèi)部；多層夾心結(jié)構(gòu)，外層和內(nèi)層為高分子材料，中間為磁性材料。

制備的四氧化三鐵-殼聚糖復(fù)合載體兼具磁性納米材料的磁響應(yīng)性以及殼聚糖生物大分子的生物相容性、易于修飾的特點(diǎn)，提高了載體的機(jī)械性能以及穩(wěn)定性，在酶固定化領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景，表3以修飾方法為出發(fā)點(diǎn)，介紹了以殼聚糖磁性納米材料為固定化載體制備的纖維素酶（蛋白質(zhì)）固化方法及效果。

表3 纖維素酶固定在四氧化三鐵-殼聚糖復(fù)合載體

現(xiàn)階段應(yīng)用于固定纖維素酶的復(fù)合載體，特別是與磁性納米粒子復(fù)合的載體數(shù)量還有待進(jìn)一步開(kāi)發(fā)，研究者們就如何得到更高效的四氧化三鐵-殼聚糖磁性納米復(fù)合載體，在修飾基團(tuán)［46］、固定化方法［47］、固定化條件［48］控制等方面并未達(dá)成一致，還有待深入研究。由于結(jié)合了兩種或多種載體材料，復(fù)合載體顯示出了優(yōu)于單一載體的理化性能，同時(shí)也發(fā)揮了磁性納米材料的優(yōu)勢(shì)，但是開(kāi)發(fā)新的載體并不表明要與已有的載體材料分割開(kāi)來(lái)，研究者們開(kāi)發(fā)了眾多的酶固定化載體，這些載體材料都可能經(jīng)過(guò)新的設(shè)計(jì)特異性地應(yīng)用到纖維素酶的固定化中。可以說(shuō)，利用磁性納米材料為基礎(chǔ)的復(fù)合固定化載體會(huì)為大規(guī)模的工業(yè)應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。但是不容忽視的一點(diǎn)是，雖然復(fù)合載體優(yōu)勢(shì)突出，但是制作工藝相對(duì)較復(fù)雜，操作條件要求相對(duì)較高，所以尋找更優(yōu)化的復(fù)合材料，以及如何簡(jiǎn)化復(fù)合材料的制備和固定化流程將是進(jìn)一步研究開(kāi)發(fā)的重點(diǎn)。

3 展望

纖維素酶以其高效、專一的催化作用已經(jīng)成為國(guó)內(nèi)外研究者開(kāi)發(fā)的關(guān)注點(diǎn)。殼聚糖是自然界含量第二豐富的天然高分子，具有多種優(yōu)良的生物、物理化學(xué)性能，是一種出色的纖維素酶固定化載體，兩者結(jié)合必然能為生物質(zhì)轉(zhuǎn)化領(lǐng)域帶來(lái)新的突破。從現(xiàn)在國(guó)內(nèi)外研究者們的成果來(lái)看，利用磁性納米粒子固定纖維素酶已展現(xiàn)出卓有成效的科研和實(shí)業(yè)價(jià)值。但是現(xiàn)階段關(guān)于磁性納米作為固定纖維素酶的研究中仍然存在一些亟待進(jìn)一步研究的方面：（1）研究開(kāi)發(fā)優(yōu)質(zhì)的交聯(lián)劑，制備出具有更高活力和穩(wěn)定性的固定化纖維素酶；（2）采用結(jié)構(gòu)、化學(xué)鍵檢測(cè)手段深入研究酶的集聚狀態(tài)、超分子結(jié)構(gòu)等微觀結(jié)構(gòu)的變化，更好的闡明磁性固定化交聯(lián)酶聚集形態(tài)形成機(jī)理；（3）針對(duì)不同的纖維素結(jié)構(gòu)和纖維素酶種類，研究開(kāi)發(fā)更適宜的改性結(jié)構(gòu)以及更加深入闡釋固定化纖維素酶水解發(fā)酵工藝中的微觀動(dòng)力學(xué)。

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（責(zé)任編輯 狄艷紅）

Research Progress on Cellulase Immobilized by M agnetic Nanoparticles as Carriers

Xing Zhaohui1Su Yuelong2Zhang Qi1Ruan Xinyi1Lin Yan1Wang Xinze1Kong Hainan1
（1. School of Environmental Science and Engineering，Shanghai Jiao Tong University，Shanghai200240；2. Environmental Monitoring Bureau of Yunlong Country，Dali672700）

Conversion of biomass to reducing sugar by cellulase is the foundation of the biomass fuel production. Nowadays researchers have invented the enzyme immobilization technology to avoid the disadvantages of free enzymatic hydrolization. Utilization of magnetic nanoparticles as carriers for the cellulase immobilization can increase the catalytic activities of enzyme and enhance stability of the enzyme. Moreover， replacing conventional mechanical stirring by external magnetic field can give full play to the role of carriers’ magnetic response；with the immobilization on magnetic nanoparticles， the produced cellulase can be separated easily from the mixture in the reaction systems. Researchers have proposed many excellent immobilization methods. Here the different methods of cellulase immobilization by magnetic nanoparticles are reviewed， their applications are explained in detail， and consequently the advantages and disadvantages as well as the development prospect are discussed.

bioethanol； cellulase； cellulase immobilization； magnetic nanoparticles as carrier

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.08.009

2014-12-15

國(guó)家科技重大專項(xiàng)（2012ZX07105-003），上海市自然科學(xué)基金項(xiàng)目（11ZR1417200）

邢朝暉，男，碩士研究生，研究方向：固定化技術(shù)應(yīng)用；E-mail：doulejuice2013@sjtu.edu.cn

林燕，女，博士，副教授，研究方向：生物質(zhì)能源利用；E-mail：linyan2002@sjtu.edu.cn