同時檢測蜂蜜及蜜丸中土霉素與四環(huán)素殘留的方法*

張成，楊海燕，楊帥

（1.陜西省醫(yī)療器械檢測中心，陜西西安710075；2.陜西省食品藥品檢驗所，陜西西安710065）

同時檢測蜂蜜及蜜丸中土霉素與四環(huán)素殘留的方法*

張成1，楊海燕2，楊帥2

（1.陜西省醫(yī)療器械檢測中心，陜西西安710075；2.陜西省食品藥品檢驗所，陜西西安710065）

目的建立測定蜂蜜及蜜丸中相關(guān)禁用抗生素殘留的高效液相色譜法，保證蜂蜜及蜜丸的安全性。方法色譜柱為Welch Ultimate C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm），流動相為乙腈-醋酸銨溶液（16∶84），檢測波長為280 nm。結(jié)果土霉素的質(zhì)量濃度在0.579～11.587μg/mL范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好，回歸方程為Y=12 581X+785.52，r=0.999 8（n=6）；四環(huán)素的質(zhì)量濃度在0.634 6～12.692 0μg/mL范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好，回歸方程為Y=11 824X+880.35，r=0.999 7（n=6）；土霉素的平均回收率為100.39%（n=9），四環(huán)素的平均回收率為98.12%（n=9）。結(jié)論該方法簡便、快速，可同時測定土霉素、四環(huán)素的殘留，為蜂蜜及蜜丸中相關(guān)獸藥的殘留控制提供依據(jù)。

高效液相色譜法；蜂蜜；蜜丸；土霉素；四環(huán)素

有關(guān)部門在蜂蜜中檢出了已在食物中禁用的相關(guān)抗生素殘留，這些抗生素主要來源于對蜜蜂疾病的治療與預(yù)防的相關(guān)獸藥殘留［1］，為保障蜂蜜和大蜜丸的安全和質(zhì)量，引導(dǎo)蜂農(nóng)正確使用獸藥，本研究參考文獻(xiàn)［2-9］建立了同時測定峰密產(chǎn)品中土霉素、四環(huán)素殘留的高效液相色譜（HPLC）法，現(xiàn)報道如下。

1　儀器與試藥

LC-2010CHT型、LC-20AD型高效液相色譜儀（日本島津公司，帶PDA檢測器）；Welch Ultimate C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；Sartorius AGME 235S型、Sartorius BS224S型電子分析天平；H66025型超聲波清洗儀。土霉素對照品（批號為0487-200001）、四環(huán)素對照品（批號為130488-200202）均由中國食品藥品檢定研究院提供。樣品為北京同仁堂股份有限公司同仁堂制藥廠提供的原蜜、煉蜜和牛黃上清丸（批號為8015466）。乙腈、三乙胺為色譜純；醋酸銨、乙二胺四醋酸二鈉、醋酸為分析純；水為超純水。

2　方法與結(jié)果

2.1色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗

色譜柱：Welch Ultimate C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；柱溫：30℃；流動相：乙腈-醋酸銨溶液［0.25mol/L醋酸銨溶液-0.05mol/L乙二胺四乙酸二鈉溶液-三乙胺（100∶10∶1），醋酸調(diào)pH至7.5］（16∶84）為流動相；流速：1.0 mL/min；檢測波長：280 nm；進(jìn)樣量：10μL。在此色譜條件下，色譜圖見圖1。

圖1　高效液相色譜圖

2.2溶液制備

取土霉素、四環(huán)素對照品適量，加甲醇制成每1mL分別含土霉素144.75μg、四環(huán)素158.65μg的混合溶液，作為對照品貯備液，4℃冷藏，備用。取蜜丸適量，剪碎，取0.5 g，精密稱定，置25mL棕色容量瓶中，加水20mL，超聲處理15min，用水稀釋至刻度，搖勻，濾過，濾液作為供試品溶液。取蜂蜜0.25 g，精密稱定，置25mL棕色容量瓶中，加水20mL，超聲處理15min，用水稀釋至刻度，搖勻，濾過，濾液作為供試品溶液。以作回收率的溶液為陽性樣品溶液，以水為陰性樣品溶液。

2.3方法學(xué)考察

線性關(guān)系考察：精密吸取對照品貯備液適量，用水稀釋至每1mL含土霉素5.79μg、四環(huán)素6.346μg的混合溶液，精密吸取1，2，5，10，15，20μL，依法進(jìn)樣。以峰面積積分值（Y）為縱坐標(biāo)、進(jìn)樣質(zhì)量濃度（X）為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸。結(jié)果表明，土霉素的質(zhì)量濃度在0.579～11.587μg/mL范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好，回歸方程Y=12 581X+785.52，r=0.999 8（n=6）；四環(huán)素的質(zhì)量濃度在0.634 6～12.692 0μg/mL范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好，回歸方程Y=11 824X+880.35，r=0.999 7（n=6）。

檢出限確定：采用信噪比法測定，土霉素的最低檢出質(zhì)量濃度為0.0917μg/mL，四環(huán)素的最低檢出質(zhì)量濃度為0.2011μg/mL。折算后，在蜂蜜中的最低檢出量土霉素為9.17μg/g，四環(huán)素為20.11μg/g；在蜜丸中的最低檢出量土霉素為4.58μg/g，四環(huán)素為10.05μg/g。

精密度試驗：精密吸取對照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次。結(jié)果峰面積的RSD土霉素為0.68%（n=6），四環(huán)素為0.67%（n=6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗：取陽性樣品溶液，分別于0，6，12，18，24，30 h時進(jìn)樣測定。結(jié)果峰面積的RSD土霉素為1.38%（n=6），四環(huán)素為1.30%（n=6），表明陽性樣品溶液在30 h內(nèi)穩(wěn)定。

加樣回收試驗：取未測出上述2種成分的蜂蜜樣品9份，取約0.25 g，精密稱定，精密加入一定量的土霉素、四環(huán)素對照品溶液，進(jìn)樣測定，計算回收率。結(jié)果見表1。

表1　土霉素及四環(huán)素加樣回收試驗結(jié)果（n=9）

2.4樣品含量測定

準(zhǔn)確稱取蜜丸樣品各0.5 g，蜂蜜樣品各0.25 g，按2.2項下方法制備供試品溶液，依法進(jìn)樣測定。結(jié)果陜西的5家企業(yè)，河北、北京、山西的各1家企業(yè)的蜂蜜和蜜丸均未檢出上述抗生素。見表2。

3　討論

在加樣回收試驗中，由于土霉素、四環(huán)素回收率測定時濃度在2～10μg/mL范圍內(nèi)，相對較小，由于積分帶入的誤差較大，故回收率的RSD相對較大。

試驗中檢測到部分樣品在與土霉素峰相同保留時間處出現(xiàn)了色譜峰，但采用二極管陣列檢測器（PDA）對其進(jìn)行驗證，經(jīng)光譜比較，其光譜的最大吸收值及其在200～400 nm波長處光譜的形狀均與土霉素不一致，證明其并非土霉素峰。

表2　不同廠家原蜜、煉蜜、蜜丸測定結(jié)果

本試驗中從藥廠收集的蜂蜜均未檢出上述2種抗生素，一種原因可能是由于藥品生產(chǎn)企業(yè)的蜂蜜來源比較固定，質(zhì)量相對有保障；另一種原因可能是蜂農(nóng)已不再使用土霉素、四環(huán)素等禁用藥品，而改用其他抗生素或其他化學(xué)藥品，有待進(jìn)一步研究。

從總體來看，蜂蜜產(chǎn)品的主要問題并非獸藥殘留問題，而是用果葡糖漿摻假或制假問題［10］；蜜丸中的主要問題是煉蜜過程的不規(guī)范和不科學(xué)，過度依賴于操作人員的人為經(jīng)驗，使煉蜜過程中不可控因素增大，潛在的安全風(fēng)險增大［11］。這是目前迫切需要解決的2個問題。

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［2］翟云忠，吳建敏，徐俊.雞蛋紅抗生素殘留衛(wèi)生法快速檢測的研究［J］.現(xiàn)代食品科技，2008，24（8）：839-841.

［3］楊元，王煉，高玲，等.高效液相色譜法測定動物源性食品中七種抗生素殘留量［J］.中國衛(wèi)生檢驗雜志，2003，13（6）：723-724.

［4］陳毓芳.肌肉組織中四環(huán)素類抗生素的固相萃取-液相色譜法測定［J］.分析測試學(xué)報，2003，22（3）：97-100.

［5］吉彩霓，岳振峰，謝麗琪，等.高效液相色譜法同時檢測水產(chǎn)品中7種四環(huán)素類抗生素殘留的研究［J］.中國獸醫(yī)科技，2005，35（10）：820-826.

［6］劉蓉蓉，吳黎明，周金慧，等.液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定蜂蜜中4種四環(huán)素族抗生素及其3種差向異構(gòu)體［J］.食品科學(xué)，2011，32（10）：232-236.

［7］趙冬梅，龍清平，趙文華.高效液相色譜-紫外檢測法分析蜂蜜中四環(huán)素藥物的殘留［J］.江西化工，2009（2）：69-72.

［8］左志輝，高立勤.固相萃取-液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法同時定量檢測蜂蜜中28種抗生素類藥物殘留的研究［J］.藥物分析雜志，2009，29（7）：1 196-1 201.

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Sim ultaneous Determ ination of Oxytetracycline and Tetracycline in Honey and Honey Pills

Zhang Cheng1，Yang Haiyan2，Yang Shuai2
（1.Shaanxi Medical Devices Testing Center，Xi′an，Shaanxi，China 710075；2 Shaanxi Institute for Food and Drug Control，Xi′an，Shaanxi，China 710065）

Objective To establish an HPLC method for determining the oxytetracycline and tetracycline in honey and honey pills，in order to ensure the safety of honey and honey pills.M ethods The chromatographic column was welch Kromasil C18column（250 mm× 4.6 mm，5μm），the mobile phase was acetonitrile-ammonium acetate solution（16∶84），the detecting wavelength was 280 nm. Results The linear range of oxytetracycline was 0.579～11.587μg/mL，and the regression equation was Y=12 581X+785.52，r=0.999 8（n=6）；the linear range of tetracycline was 0.634 6～12.692 0μg/mL，and the regression equation was Y=11 824X+ 880.35，r=0.999 7（n=6）；the average recovery rate of oxytetracycline was 100.39%（n=9）and the tetracyline was 98.12%（n=9）.Conclusion The method is simple，rapid，and can be used for simultaneous determinations of oxytetracycline and tetracycline，and can provide the basis for the control of veterinary drug residues in honey and honey pills.

HPLC；honey；honey pills；oxytetracycline；tetracycline

R927.2；R282.74

A

1006-4931（2015）18-0070-02

張成，男，副主任藥師，研究方向為藥品及醫(yī)療器械檢測及標(biāo)準(zhǔn)，（電子信箱）zhangchengshanxi@163.com。

2015-01-09；

2015-03-25）

*陜西省科學(xué)技術(shù)研究發(fā)展計劃項目，項目編號：2011K16-06-01。