番茄植株總黃酮提取工藝優(yōu)化

邸娜，韓海軍，鄭喜清，王靖，李亞珍，*，張瑞萍

（1.河套學(xué)院農(nóng)學(xué)系，內(nèi)蒙古巴彥淖爾015000；2.巴彥淖爾市農(nóng)牧業(yè)技術(shù)推廣中心，內(nèi)蒙古巴彥淖爾015000）

番茄植株總黃酮提取工藝優(yōu)化

邸娜1，韓海軍2，鄭喜清1，王靖1，李亞珍1，*，張瑞萍1

（1.河套學(xué)院農(nóng)學(xué)系，內(nèi)蒙古巴彥淖爾015000；2.巴彥淖爾市農(nóng)牧業(yè)技術(shù)推廣中心，內(nèi)蒙古巴彥淖爾015000）

以番茄植株為植物材料，研究乙醇浸提法提取其總黃酮的最佳工藝條件。以番茄植株總黃酮的提取量為考察指標(biāo)，通過單因素試驗和正交試驗研究乙醇濃度、浸提時間、料液比和浸提溫度對番茄植株總黃酮提取量的影響程度及最佳提取工藝條件。結(jié)果表明，上述四因素對番茄植株總黃酮提取量影響的大小順序依次為乙醇濃度＞浸提溫度＞料液比＞浸提時間；最佳提取工藝條件為：60%乙醇，料液比30 mL/g，70℃條件下，浸提1.5 h；最高提取量為0.408 mg/g。

番茄植株；黃酮；乙醇浸提

黃酮類化合物是一類低分子量的天然物質(zhì)，是植物體內(nèi)的次級代謝產(chǎn)物，廣泛的分布于多種植物體內(nèi)［1］。研究表明黃酮類化合物具有清除生物體內(nèi)的自由基、抗腫瘤、抗衰老、抗心血管疾病等作用，且無毒無害［2-3］，在食品、藥品、保健品等方面得到廣泛應(yīng)用。因此，從植物體內(nèi)，提取天然的高純度黃酮類化合物受到了國內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注，但目前尚未見番茄植株中黃酮類化合物提取工藝的相關(guān)報道。本文以番茄植株為植物材料，采取傳統(tǒng)的乙醇浸提法，在單因素試驗的基礎(chǔ)上，采取正交試驗的方法優(yōu)化提取工藝，以其為工業(yè)化生產(chǎn)黃酮類化合物提供適宜的工藝參數(shù)，同時也為番茄植株的再利用提供參考。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

番茄植株：巴彥淖爾市臨河區(qū)氣象局試驗田；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品為生物級；無水乙醇、氫氧化鈉、亞硝酸鈉、硝酸鋁等試劑為分析純，水為超純水。

分光光度計（723型）鳳凰；分析天平（BSA323SCW）賽多利斯；水浴鍋（HH-4）常州博遠(yuǎn)。

1.2試驗方法

1.2.1番茄植株預(yù)處理方法

選擇結(jié)果期的番茄植株自來水清洗干凈后剪成5 cm左右的小段，于50℃恒溫干燥箱內(nèi)烘干，粉碎后過60目篩，所得樣品儲存于干燥避光處備用。

1.2.2番茄植株總黃酮的提取

準(zhǔn)確稱取1.000 g備用的番茄植株粉，乙醇浸提，4 000 r/min離心2 min，收集三次濾液于50 mL容量瓶中，乙醇定容，作為樣品浸提液。

1.2.3蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品20 mg，60%乙醇溶液溶解，定容至50 mL，得0.4 mg/mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。精確吸取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液0、1、2、3、4、5 mL分別置于25 mL容量瓶中，加60%乙醇溶液至12.5 mL，混勻；分別加5%的NaNO20.75mL，搖勻靜置6min；再各加10%Al（NO3）30.75 mL，搖勻靜置6 min；再分別加入4%NaOH 10 mL，搖勻；最后用60%乙醇溶液定容至25mL，靜置10min，510 nm處測其吸光度值。

1.2.4樣品浸提液總黃酮的測定

準(zhǔn)確吸取樣品浸提液10 mL于25 mL容量瓶中，用亞硝酸鈉-硝酸鋁顯色法使其顯色，于510 nm處測定其吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算總黃酮的提取量。

1.2.5單因素試驗

選取乙醇濃度、料液比、浸提溫度、浸提時間4個因素，以浸提液的總黃酮含量為判斷標(biāo)準(zhǔn)，確定各因素的適宜范圍，具體因素組合見表1。

表1　單因素試驗因素水平Table 1Factors and levels of single factor experiment

1.2.6正交試驗

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，以乙醇濃度、料液比、浸提溫度和浸提時間為主要因素，按照表2進行L9（34）正交試驗設(shè)計，對番茄植株中的總黃酮進行提取，以總黃酮的含量為判斷依據(jù)，確定以上四因素的優(yōu)化組合。

表2　正交試驗因素水平Table 2Factors and levels of orthogonal experiment

2　結(jié)果與分析

2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線及回歸方程

按照1.2.3的方法，以蘆丁濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，其回歸方程為：y=11.863x+ 0.003 3，R=0.999 8，標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。

圖1　蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1Standard curve of rutin

實驗表明在0.00 mg/mL～0.08 mg/mL范圍內(nèi)，蘆丁濃度與吸光度值呈良好線性關(guān)系。

2.2番茄植株浸提液與蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品吸收光譜比較

番茄植株浸提液和蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品用亞硝酸鈉-硝酸鋁顯色法顯色后，在400 nm～650 nm下掃描二者的吸收光譜，掃描結(jié)果見圖2。

圖2　蘆丁與樣品NaNO2-Al（NO3）3顯色后的吸收光譜Fig.2Absorption spectrum of rutin and sample with NaNO2-Al（NO3）3

結(jié)果表明蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品和番茄植株浸提液分別在508 nm和510 nm處有最大吸收峰，且二者的吸收光譜特征相似，說明番茄植株總黃酮的提取和定量方案合理可行。

2.3單因素試驗

2.3.1乙醇濃度對總黃酮提取率的影響

乙醇濃度對總黃酮提取率的影響見圖3。

圖3　乙醇濃度對黃酮提取率的影響Fig.3The effect of alcohol concentration on extraction rate of flavonoids

結(jié)果表明乙醇濃度對番茄植株總黃酮的提取率有較大影響。當(dāng)乙醇濃度由40%增大到60%時，總黃酮提取率急劇增加，由60%增大到70%時，提取率增加幅度減緩，當(dāng)乙醇濃度為70%時總黃酮提取率達(dá)到最大，再增大乙醇濃度，總黃酮提取率迅速降低。這可能是由于番茄植株中黃酮類化合物種類較多，不同種類的黃酮類化合物物理性質(zhì)不同，即有些為醇溶性的，有些為水溶性的［4］，隨著乙醇濃度的增加，水溶性的黃酮類化合物浸出率逐漸下降，醇溶性黃酮類化合物的浸出率逐漸升高，與此同時醇溶性的其他物質(zhì)也大量溶出，當(dāng)乙醇濃度過高時，可明顯觀察到浸提液的顏色由棕黃色變?yōu)榫G色，而總黃酮的提取率也迅速下降，說明葉綠素的大量溶出阻礙了黃酮類化合物的溶出。因此只有適宜的乙醇濃度才能同時溶出醇溶性和水溶性的黃酮類化合物，又能使其他醇溶性化合物，如葉綠色的影響降到較小的程度。

2.3.2料液比對總黃酮提取率的影響

料液比對總黃酮提取率影響的結(jié)果如圖4所示。

圖4　料液比對黃酮提取率的影響Fig.4The effect of solid liquid ratio on extraction rate of flavonoids

在10 mL/g～40 mL/g的范圍內(nèi)，總黃酮的提取率隨料液比的增加逐漸增大，達(dá)到40 mL/g時總黃酮的提取率達(dá)到最大，以后趨于穩(wěn)定。原因在于料液比越大，溶劑與細(xì)胞間的總黃酮的濃度差越大，越有利于黃酮類化合物的溶出。但當(dāng)溶劑用量增大到一定程度時，溶劑中與細(xì)胞間黃酮類物質(zhì)的溶出達(dá)到動態(tài)平衡，即使再增大溶劑用量，總黃酮的溶出量也不會增加。2.3.3浸提溫度對總黃酮提取率的影響

浸提溫度對總黃酮提取率的影響見圖5。

圖5　浸提溫度對黃酮提取率的影響Fig.5The effect of extraction temperature on extraction rate of flavonoids

50℃～70℃范圍內(nèi)，隨著溫度的升高總黃酮的提取率明顯提高，但是當(dāng)溫度超過70℃時，隨著溫度的升高，總黃酮的提取率迅速下降。這是由于隨著溫度的升高，溶劑的滲透能力逐漸增強，黃酮的浸提率有所升高，但當(dāng)溫度超過70℃時，乙醇揮發(fā)導(dǎo)致溶劑的濃度下降，浸提率相應(yīng)降低，而且部分黃酮可能隨著溫度的升高發(fā)生分解或轉(zhuǎn)化，因此70℃為黃酮浸提的適宜溫度。

2.3.4浸提時間對總黃酮提取率的影響

浸提時間不同對總黃酮的提取率也有一定的影響，影響結(jié)果如圖6所示。

圖6　浸提時間對黃酮提取率的影響Fig.6The effect of extraction time on extraction rate of flavonoids

當(dāng)浸提時間為1 h～2 h時，黃酮類化合物的提取率明顯增加，2 h時達(dá)到最大，超過2 h后提取率下降較快，這可能是由于長時間在高溫下浸提使黃酮類化合物發(fā)生轉(zhuǎn)化或分解造成的。

2.4正交試驗

正交試驗結(jié)果如表3所示。

測定的4個因素對番茄植株黃酮類化合物提取率的影響由大到小順序依次為乙醇濃度＞浸提溫度＞料液比＞浸提時間。從表4的方差分析結(jié)果來看，乙醇濃度、浸提溫度、料液比對番茄植株黃酮類化合物的提取率具有極顯著的影響，浸提時間對番茄植株黃酮類化合物的提取率具有顯著影響。但對單因素檢驗的結(jié)果顯示，當(dāng)乙醇濃度為60%和70%以及料液比為30 mL/g和50 mL/g時，對番茄植株黃酮類化合物提取率的影響差異不大，為節(jié)省提取成本，綜合考慮分析結(jié)果可確定番茄植株黃酮類化合物的最佳提取工藝為A2B1C1D2，即乙醇濃度為60%，料液比為30 mL/g，浸提溫度為70℃，浸提時間為1.5 h。

表3　正交試驗結(jié)果Table 3The results of orthogonal experiment

表4　正交試驗方差分析結(jié)果Table 4The analysis of variance

2.5提取工藝驗證結(jié)果

為了確認(rèn)上述優(yōu)化組合條件A2B1C1D2的穩(wěn)定性和可靠性，進行了優(yōu)化組合的驗證試驗，即稱取番茄植株粉末1.0 g，用料液比為30 mL/g的60%乙醇溶液，在70℃條件下，浸提1.5 h，重復(fù)3次，測定黃酮類化合物的含量分別為0.409、0.403、0.412 mg/g，均值為0.408 mg/g，RSD為1.12%。結(jié)果表明此工藝條件下提取的番茄植株黃酮類化合物的含量均高于正交試驗中任一組合的提取量，說明提取工藝穩(wěn)定可靠。

3　討論與結(jié)論

黃酮類化合物由于具有廣泛的生理和藥理作用，近年來被廣泛的用于食品、藥品和保健品的生產(chǎn)。本試驗之所以采用番茄植株作為植物材料，最主要的原因在于巴彥淖爾市近年來加工型番茄的種植面積逐年擴大，已經(jīng)成為我國繼新疆之后的第二大加工型番茄生產(chǎn)基地。每年番茄采收后，大量的番茄植株被廢棄，既浪費資源又污染環(huán)境。番茄植株中含有豐富的維生素C和黃酮類化合物［5］，通過試驗確定黃酮類化合物的最佳提取工藝，既可以得到大量天然的黃酮類化合物，又可以解決番茄植株的再利用問題。

通過單因素試驗和正交試驗的結(jié)果分析來看，采用傳統(tǒng)的乙醇浸提法提取番茄植株中的黃酮類化合物，乙醇的濃度對提取量影響最大，其他3個因素的影響力順序依次為浸提溫度、料液比和浸提時間。通過試驗可確定其最佳提取工藝為60%乙醇，料液比30 mL/g，70℃條件下，浸提1.5 h。在此條件下提取結(jié)果期番茄莖中的總黃酮，提取量為0.408 mg/g（40.8 mg/ 100 g），這一結(jié)果與趙海清等［5］測定的成熟期番茄莖的總黃酮含量（35.4 mg/100 g）很接近，說明提取方法有效、可靠，這為番茄植株的再利用，變廢為寶，增加農(nóng)民收入提供了一個思路。

［1］錢俊臻.黃酮類化合物提取方法的研究進展［J］.化工文摘，2008（6）：35-38

［2］王慧.黃酮類化合物生物活性的研究進展［J］.食品與藥品，2012，12（9）：347-350

［3］張德權(quán)，臺建祥，付勤.生物類黃酮的研究及應(yīng)用概況［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，1999，25（6）：52-57

［4］劉成梅，游海.天然產(chǎn)物有效成分的分離與應(yīng)用［M］.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2003：170-236

［5］趙海清，竇君，阿吉艾克拜爾·艾薩.番茄有效成分含量測定及其綜合利用產(chǎn)業(yè)化構(gòu)想［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，38（29）：16186-16187

Optimizing Extraction Technology of Total Flavones from Tomato Plants

DI Na1，HAN Hai-jun2，ZHENG Xi-qing1，WANG Jing1，LI Ya-zhen1，*，ZHANG Rui-ping1
（1.Agriculture Department，Hetao College，Bayannaoer 015000，Inner Mongolia，China；2.Agrotechnical Promotion Center of Bayannaoer，Bayannaoer 015000，Inner Mongolia，China）

To explore the optimal condition of alcohol leaching process for total flavonoids from tomato plants. With total flavones yield as selection standard，to research the optimal extraction condition and the impact of ethanol concentration，extraction time，extraction temperature and solid/liquid on total flavonoids yield of tomato plants by single factor and orthogonal experiments.The results showed the order of the impact of above four factors on total flavones yield was ethanol concentration＞extraction temperature＞solid/liquid＞extraction time；the optimal extraction condition：ethanol concentration was 60%，solid/liquid was 30 mL/g，extraction temperature was 70℃，extraction time was 1.5 h；the highest total flavonoids yield was 0.408 mg/g.

tomato plants；flavonoid；alcohol leaching process

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.13.017

2014-11-18

內(nèi)蒙古自治區(qū)高等學(xué)校科學(xué)研究項目（NJZC13388）

邸娜（1983—），女（漢），講師，碩士，從事植物栽培生理及天然產(chǎn)物的提取和分離方面的教學(xué)和課研工作。

李亞珍（1962—），教授，學(xué)士。