食用傘菌海藻糖代謝相關(guān)基因調(diào)控及生物工程應(yīng)用

劉建輝，尚曉冬，李亞鵬，趙 妍，譚 琦，*

（1.農(nóng)業(yè)部應(yīng)用真菌資源與利用重點開放實驗室，國家食用菌工程技術(shù)研究中心，上海市農(nóng)業(yè)遺傳育種重點實驗室，上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所，上海201403；2.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海201306）

食用傘菌海藻糖代謝相關(guān)基因調(diào)控及生物工程應(yīng)用

劉建輝1，2，尚曉冬1，*，李亞鵬1，2，趙 妍1，譚 琦1，2，*

（1.農(nóng)業(yè)部應(yīng)用真菌資源與利用重點開放實驗室，國家食用菌工程技術(shù)研究中心，上海市農(nóng)業(yè)遺傳育種重點實驗室，上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所，上海201403；2.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海201306）

海藻糖是一種能夠在外界脅迫條件下發(fā)揮其特殊抗逆保護(hù)作用的二糖，廣泛分布于古細(xì)菌、細(xì)菌、真菌及動植物體內(nèi)。該文對海藻糖的理化性質(zhì)及其生物學(xué)特性作了簡要的概述，介紹了食用傘菌中海藻糖合成代謝途徑及其相關(guān)酶基因調(diào)控的研究進(jìn)展，對食用傘菌中與海藻糖代謝相關(guān)酶基因在生物工程中的應(yīng)用進(jìn)行了展望。

海藻糖，食用傘菌，代謝，調(diào)控，生物工程

海藻糖（α，α-trehalose）由兩個α，α-1，1糖苷鍵連接的葡萄糖單元組成，是一種結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的非還原性雙糖，在自然界中分布廣泛。在早期人們認(rèn)為海藻糖只是一種貯藏性糖類，直到1985年，才逐漸發(fā)現(xiàn)其具有許多異于其他雙糖的特殊作用，海藻糖能夠作為一種高效保護(hù)物質(zhì)，幫助細(xì)胞成分抵抗外界不利條件，如饑餓、高溫、冷凍、干燥、高滲透壓、重金屬和有毒試劑等。在脅迫條件下，胞內(nèi)海藻糖含量迅速上升，保護(hù)多種生物大分子，從而保護(hù)生命本身［1-2］。而無論是生物體內(nèi)的海藻糖，還是外源性海藻糖，對生物體和生物大分子都有非特異性的保護(hù)作用，存在潛在的研究及工業(yè)應(yīng)用價值，因此海藻糖已成為當(dāng)今國際研究和開發(fā)的熱點。國外研究較為深入，包括海藻糖的作用機(jī)制、代謝調(diào)控途徑和應(yīng)用研究等；國內(nèi)多集中在海藻糖的功能和提取工藝上。然而至今國內(nèi)外對海藻糖的研究多集中在植物、昆蟲、細(xì)菌及酵母菌中，而應(yīng)用于食用傘菌的研究相對較少，主要在白靈側(cè)耳（Pleurotus eryngii var.tuoliensis）［3］、草菇（Volvariella volvacea（Bull.：Fr.）Sing.）［4］、灰樹花（Grifola frondosa（Dicks.）Gray）［5］、糙皮側(cè)耳（Pleurotus ostreatusJacq.）［6］、裂褶菌（Schizophyllum commune Fr.）［7］、鳳尾菇（Pleurotus sajor-caju（Fr.）Singer）［8］等上有部分報道。食用傘菌正常生長發(fā)育過程十分復(fù)雜，需要受到外界脅迫刺激及調(diào)控，而海藻糖的代謝及相關(guān)酶基因調(diào)控的研究，對于揭示其生長發(fā)育過程中的抗逆機(jī)制及對極端環(huán)境的適應(yīng)機(jī)制具有重要作用。本文對食用傘菌中海藻糖的代謝途徑與相關(guān)酶基因調(diào)控機(jī)制進(jìn)行了綜述，旨在了解其中海藻糖的代謝調(diào)控因子及機(jī)制，從而為食用傘菌的栽培工藝提供參考，實現(xiàn)其進(jìn)一步應(yīng)用。

1 海藻糖的特性

1.1 海藻糖的理化特性

海藻糖是W iggers于1832年從黑麥麥角菌中首次發(fā)現(xiàn)的。隨后法國化學(xué)家Berthelot在小亞細(xì)亞沙漠里一種象鼻蟲分泌的糖蜜中也發(fā)現(xiàn)了該糖，并將其命名為海藻糖［9］。從那以后在大量有機(jī)體中都發(fā)現(xiàn)了海藻糖的存在，包括嗜極古細(xì)菌、細(xì)菌、藻類、酵母、絲狀真菌、植物、昆蟲和其他無脊椎動物。海藻糖由兩個吡喃環(huán)葡萄糖分子連結(jié)而成，是一種穩(wěn)定的非還原性二糖。1930年Bredereck首先利用核磁共振技術(shù)闡明了海藻糖的化學(xué)結(jié)構(gòu)，化學(xué)名為α-D-吡喃葡萄糖基-α-D吡喃葡萄糖苷（α-D-glucopyranosyl-α-D-glucopyranoside），其分子式為C12H22O11·2H2O，相對分子量為378.33。其分子結(jié)構(gòu)對稱，分子結(jié)構(gòu)式如圖1所示。

圖1 α，α-型海藻糖構(gòu)象式Fig.1 Structure ofα，α-trehalose

在α-D吡喃葡萄糖中，由一個氧原子和五個碳原子形成一個六元環(huán)，這種六元結(jié)構(gòu)是很穩(wěn)定的。而成環(huán)之后在1號位形成了半縮醛羥基，羥基的化學(xué)性質(zhì)非?；顫姡ㄟ^1，1糖苷鍵的連接，兩個吡喃葡萄糖分子結(jié)合成為α，α-海藻糖，因此其理化性質(zhì)十分穩(wěn)定，是天然雙糖中最穩(wěn)定的。并且海藻糖無毒性，無色無臭，口感稍帶甜味，低熱值，具有明顯的化學(xué)惰性和極強(qiáng)的穩(wěn)定性。

1.2 海藻糖的生物學(xué)作用

早期研究發(fā)現(xiàn)，在真菌及其孢子萌發(fā)的最初階段，海藻糖可以作為能量的來源［10］。在昆蟲中，海藻糖存在于血液內(nèi)，作為提供飛行能量的主要糖分［11］。近些年來，有很多研究者認(rèn)識到許多生物體在外界脅迫條件下（如饑餓、脫水、干旱、高溫、冷凍、高滲透性、重金屬及有毒試劑等），都能通過調(diào)節(jié)胞內(nèi)海藻糖的合成，保護(hù)生物體本身，抵御外界不良環(huán)境的傷害［12-14］。而且少量外源海藻糖就可顯著提高細(xì)胞抗脅迫的能力［15］。大量研究結(jié)果表明［16］，海藻糖對生物體的這種保護(hù)作用主要是由于它可以非特異地穩(wěn)定細(xì)胞內(nèi)生物膜、蛋白質(zhì)和核酸等生物大分子的結(jié)構(gòu)。

海藻糖是一種典型的應(yīng)激代謝產(chǎn)物。當(dāng)生物體生長環(huán)境良好時，體內(nèi)不積累海藻糖；而當(dāng)生物體處于脅迫環(huán)境時，體內(nèi)就會迅速積累海藻糖［12，17］，而且這些海藻糖會隨著不良環(huán)境的解除而被降解。海藻糖合酶基因是繼谷氨酸、脯氨酸、甜菜堿合成酶基因之后又一個與抗逆相關(guān)的基因［18］。Elena Garre和Em ilia Matallana［19］的研究表明，釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae H.）中存在三種海藻糖酶Nth1p，Nth2p和Ath1p參與細(xì)胞內(nèi)海藻糖的轉(zhuǎn)移，胞內(nèi)海藻糖有助于鹽滲透后細(xì)胞的恢復(fù)。劉秀明等［3］通過測定白靈側(cè)耳熱敏感型菌株和耐熱性菌株經(jīng)高溫脅迫后恢復(fù)培養(yǎng)期間，菌絲體內(nèi)海藻糖代謝相關(guān)酶活性和基因相對表達(dá)量的變化，研究海藻糖代謝途徑的應(yīng)激響應(yīng)；發(fā)現(xiàn)高溫脅迫后恢復(fù)培養(yǎng)期間，海藻糖含量迅速降至對照水平，合成海藻糖方向海藻糖磷酸化酶（Trehalose phosphorylase，TreP）活性急劇下降，6-磷酸海藻糖合成酶（trehalose-6-phosphate synthase，TPS）活性和6-磷酸海藻糖合成酶基因（tps1）表達(dá)量顯著增加，降解海藻糖的酶被激活，參與海藻糖的降解。Kong等［20］對白靈側(cè)耳熱激后，探究NO對海藻糖積累的調(diào)控，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在溫度刺激下，杏鮑菇菌絲中海藻糖的積累與外源NO有關(guān)，熱激可能是通過調(diào)控NO的調(diào)控途徑從而調(diào)控海藻糖積累的。

內(nèi)源性海藻糖在外界脅迫條件下保護(hù)生物體起到了關(guān)鍵的作用，而外加的海藻糖對蛋白質(zhì)、酶與細(xì)胞膜等活性物質(zhì)也均有明顯的保護(hù)作用［21］。Kong等［20］也證實了通過外源海藻糖處理，可以顯著緩解高溫脅迫對白靈側(cè)耳的氧化脅迫損傷。劉秀明等［22］通過對外源海藻糖對高溫脅迫下白靈側(cè)耳氧化損傷的緩解效應(yīng)的研究，發(fā)現(xiàn)外源海藻糖處理可以顯著降低高溫脅迫下菌絲體內(nèi)產(chǎn)生速率、H2O2含量、脂氧合酶（LOX）活性和巴比妥酸鹽反應(yīng)物質(zhì)（TBARS）含量水平，緩解高溫脅迫所引發(fā)的氧化損傷；另外，外源海藻糖對超氧化物歧化酶（SOD）活性有保護(hù)和提高的作用，對過氧化氫酶（CAT）和抗壞血酸過氧化物酶（APX）活性有抑制作用，對過氧化物酶（POD）活性影響不明顯。王永紅等［4］研究了海藻糖溶液對草菇（Volvariella volvacea（Bull.：Fr.）Sing.）菌種低溫保藏的效果，結(jié)果表明不耐受低溫的草菇菌種在海藻糖溶液的保護(hù)下，能夠在4～6℃下存活至少8個月以上，而未經(jīng)海藻糖溶液保護(hù)的草菇菌種會自溶而導(dǎo)致死亡；而且經(jīng)過了海藻糖溶液低溫保護(hù)的草菇菌種分泌的次生代謝產(chǎn)物及基因指紋圖譜都沒有發(fā)生改變；采用海藻糖溶液保護(hù)的草菇菌種，在4～6℃低溫下保藏8個月后活化，活化后的菌種采用清水低溫保藏，1個月后仍然具有生存活性，并能產(chǎn)生厚垣孢子。

2 食用傘菌海藻糖代謝途徑及其相關(guān)酶基因調(diào)控

雖然海藻糖代謝過程中只涉及到幾種代謝產(chǎn)物和相關(guān)酶反應(yīng)，但是其調(diào)節(jié)和控制機(jī)制卻是相當(dāng)?shù)膹?fù)雜。傘菌中海藻糖的合成途徑有兩種，一是TPS/TPP途徑，另一個是日本學(xué)者在擔(dān)子菌灰樹花中發(fā)現(xiàn)的TreP途徑［5］。

2.1 合成代謝途徑及相關(guān)酶基因調(diào)控

2.1.1 TPS/TPP途徑 所謂TPS/TPP途徑，是指由6-磷酸海藻糖合成酶（trehalose-6-phosphate synthase，TPS）催化尿苷二磷酸（Uridine Diphosphate，UDP）葡萄糖和6-磷酸葡萄糖合成6-磷酸海藻糖（Trehalose-6-phosphate，T6P），再在6-磷酸海藻糖磷酸酯酶（Trehalose-6-phosphate phosphatase，TPP）作用下，將6-磷酸海藻糖去磷酸化生成海藻糖和無機(jī)磷酸的生物學(xué)過程［23］，反應(yīng)式如下：

在單核生物中，編碼這些酶的基因只有單一的操縱子，而且在真核生物中是多基因操縱［24］。在真菌體內(nèi)，6-磷酸海藻糖合成酶（TPS）和6-磷酸海藻糖磷酸酯酶（TPP），兩種酶形成了復(fù)合物，是由tps1，tps2，tps3和tsl1 4種基因編碼形成的復(fù)合單元。編碼6-磷酸海藻糖合成酶（TPS）和6-磷酸海藻糖磷酸酯酶（TPP）兩種酶的基因分別為tps1和tps2。tps1和tps2具有合成海藻糖的催化活性，而tps3和tsl1對于整合海藻糖合成酶復(fù)合物和在沒有明顯酶活時的調(diào)控具有重要的作用［25］，即tsl1和tps3編碼的蛋白起穩(wěn)定基因復(fù)合體的作用。通過研究6-磷酸海藻糖合成酶（TPS）和6-磷酸海藻糖磷酸酯酶（TPP）的系統(tǒng)發(fā)生學(xué)關(guān)系，發(fā)現(xiàn)它們是共同演化的，具有同源性。

6-磷酸海藻糖合成酶（TPS）是反應(yīng)的關(guān)鍵酶，不僅作為代謝酶也作為壓力調(diào)控者。除了在海藻糖的生物合成中起作用，TPS也能夠控制糖原進(jìn)入糖酵解和糖誘導(dǎo)的信息傳遞。許多基因被大量誘導(dǎo)表達(dá)是細(xì)胞處于逆境時的一個顯著特征［26］，通過研究這些基因的啟動子發(fā)現(xiàn)，至少有一個順式反應(yīng)元件存在于啟動子中，稱之為逆境應(yīng)答元件（stress responsive element，簡稱STRE）或熱激反應(yīng)元件（heat shock element，簡稱HSE），這些元件的核心序列為CCCCT或AGGGG。這些元件會受到轉(zhuǎn)錄激活蛋白Msn2p/ Msn4p的正調(diào)控［27］。在應(yīng)激反應(yīng)中，并不是所有的STRE都參與其中，一般只有一個STRE起作用，并且只有在其他的順式或反式作用因子的作用下，STRE才能受到Msn2p/Msn4p的正調(diào)控。此外，這些順式或反式作用因子還決定了參與海藻糖代謝途徑所需要基因的特異性。張芳［28］通過對南極低溫酵母Guehomyces pullulans 17-1菌株中的tps1分析發(fā)現(xiàn)，在它的啟動子中存在2個HSE和1個STRE應(yīng)激反應(yīng)元件的核心序列，所以推測當(dāng)G.pullulans 17-1菌株處于高溫、低溫逆境環(huán)境時，tps1基因也會被誘導(dǎo)表達(dá)，幫助細(xì)胞抵御不良環(huán)境的影響。

由于在食用菌中關(guān)于海藻糖合成酶相關(guān)基因的克隆、表達(dá)及其調(diào)控研究較少，但是通過借鑒酵母菌中的相關(guān)研究，也能找到食用菌中代謝調(diào)控的研究方向。Fang Zhang等［29］指出，當(dāng)G.pullulans 17-1菌株處于25℃高溫培養(yǎng)下，菌體內(nèi)海藻糖含量、TPS酶活及tps1基因的相對表達(dá)量明顯升高；而在10℃低溫培養(yǎng)下，菌體內(nèi)海藻糖含量、TPS酶活及tps1基因的相對表達(dá)量比在15℃培養(yǎng)下的菌體低。所以對G.pullulans 17-1菌株來說，海藻糖在抵御高溫脅迫時具有重要的作用。Ming-Zhe An等［30］通過構(gòu)建tps1過表達(dá)載體的酒精發(fā)酵酵母菌株，在酒精發(fā)酵條件下，TPS的活性及海藻糖的含量顯著升高，而且生長的臨界溫度由36℃升高到了42℃，說明tps1基因的過表達(dá)對于提高菌株耐熱性有顯著的影響。在酵母中發(fā)現(xiàn)，海藻糖生物合成的中間介質(zhì)6-磷酸海藻糖，能夠調(diào)控糖酵解過程中葡萄糖的代謝流［8］。

人們普遍認(rèn)為，6-磷酸海藻糖合成酶（TPS）是反應(yīng)的關(guān)鍵，對于6-磷酸海藻糖磷酸酯酶（TPP）的基因表達(dá)量、酶性質(zhì)等的研究還比較少。僅有Sang-Eun Han［31］在研究鳳尾菇中海藻糖磷酸化酶時，構(gòu)建了tps1、tps2突變體及雙突變體，結(jié)果表明tps1突變體、雙突變體在葡萄糖上不能生長；tps2缺失突變體能夠在葡萄糖上生長；而擁有空質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子也不能在葡萄糖上生長。說明只有6-磷酸海藻糖磷酸酯酶（TPP）存在的情況下，是不能利用葡萄糖的。

2.1.2 TreP途徑 所謂TreP途徑，是由海藻糖磷酸化酶（Trehalose phosphorylase，TreP）催化D-葡萄糖與1-磷酸-α-D葡萄糖合成海藻糖。該反應(yīng)是可逆性反應(yīng)。其反應(yīng)過程如下：

日本學(xué)者Saito K從擔(dān)子菌灰樹花中發(fā)現(xiàn)了一種新的海藻糖合成酶（Trehalose synthase，TSase），該酶也可特異利用D-葡萄糖與1-磷酸-α-D葡萄糖合成海藻糖［5］。TSase實際上也是一種海藻糖磷酸化酶（TreP），因為它也可以催化上述反應(yīng)的逆反應(yīng)，即通過磷酸化作用分解海藻糖。隨后研究學(xué)者在多種食用真菌中發(fā)現(xiàn)此酶，之后便對這種酶的特性進(jìn)行了進(jìn)一步研究。

A lexandra Schwarz等［6］研究了糙皮側(cè)耳中海藻糖磷酸化酶的特性及α-α海藻糖合成的應(yīng)用。通過變性聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）技術(shù)，提取自糙皮側(cè)耳的海藻糖磷酸化酶的分子量大約在55ku，分解和合成海藻糖的最適pH分別為6.8和6.2。在缺乏前體物質(zhì)α-α海藻糖、甘油和聚乙二醇及溫度為30℃的情況下，海藻糖磷酸化酶的半衰期（half-life）大約為1h。

Christian EIS等［7］研究了裂褶菌中真菌海藻糖磷酸化酶的動力學(xué)機(jī)制、反應(yīng)的pH相關(guān)性和一些結(jié)構(gòu)特性。研究發(fā)現(xiàn)海藻糖磷酸化酶擁有有序的BiBi動力學(xué)機(jī)制，即磷酸鹽在生成α-α海藻糖之前形成，而α-D-葡萄糖在α-D-1-磷酸葡萄糖之前形成。在高pH及低pH下正反應(yīng)和逆反應(yīng)的最大反應(yīng)速率及催化效率都有所下降，其相對pK值（平衡常數(shù)的負(fù)對數(shù)）分別為7.2～7.8和5.5～6.0。而且每個海藻糖磷酸化酶分子中都含有Mg2+。

Sang-Eun Han［8］對鳳尾菇中編碼海藻糖磷酸化酶的基因（PsTP）進(jìn)行了克隆及其特性分析，實驗發(fā)現(xiàn)該基因能夠在子實體的菌絲體、菌蓋和菌柄中表達(dá)。海藻糖磷酸化作用的最適溫度是36℃。PsTP基因能夠和酵母菌的tps1，tps2雙突變體細(xì)胞互補，使他們在葡萄糖培養(yǎng)基中生長，轉(zhuǎn)化了PsTP基因的酵母能夠比非轉(zhuǎn)化突變體或轉(zhuǎn)化進(jìn)空白對照的細(xì)胞多產(chǎn)生2～2.5倍的海藻糖。

目前看來，大量對TreP的研究只局限于體外實驗，且多數(shù)文獻(xiàn)致力于研究海藻糖磷酸化酶的代謝途徑、酶學(xué)性質(zhì)及反應(yīng)機(jī)制，而關(guān)于相關(guān)基因的克隆表達(dá)、真菌活細(xì)胞體內(nèi)酶的變化及特定條件下相關(guān)酶及基因表達(dá)的變化情況卻鮮有研究，這也是以后的研究方向。

2.2 分解代謝途徑及相關(guān)酶基因調(diào)控

海藻糖的分解代謝途徑在真菌尤其是酵母菌中研究得比較透徹。關(guān)于海藻糖的合成及分解途徑，雖然科學(xué)家在自然界各生物體中發(fā)現(xiàn)了多種途徑，涉及到不同的酶的催化反應(yīng)；但是，國內(nèi)外研究成果發(fā)現(xiàn)，除了畢赤酵母（Pichia fermentans）是利用海藻糖磷酸化酶分解海藻糖以外，其余所有真菌都是通過海藻糖酶的水解反應(yīng)分解海藻糖的［32-34］。

海藻糖酶的催化反應(yīng)過程如下：

真菌中存在兩類海藻糖水解酶，即中性海藻糖水解酶（Neutral trehalase，NTH）和酸性水解酶（Acidic trehalase，ATH）［35］。

中性海藻糖酶存在于細(xì)胞溶質(zhì)中，在pH7.0左右具有最大活性。這種酶受到轉(zhuǎn)錄水平上葡萄糖抑制的調(diào)控，也受一般壓力響應(yīng)途徑的調(diào)控，是通過Msn2/Msn4轉(zhuǎn)錄因子和存在于nth1基因啟動子的抗壓力元件（STREs）的內(nèi)在反應(yīng)實現(xiàn)的［36-37］。自1984年Londesborough J和Varimo K［38］的研究以來，人們認(rèn)為中性海藻糖水解酶是由nth1和nth2基因編碼。然而，近來在細(xì)胞外海藻糖存在下，Jules M等［39］描述了酵母中nth2編碼的海藻糖酶的活性。也就是說nth2基因也能編碼一種功能性的海藻糖酶，而且nth2與nth1有77%的同源性，但nth2所編碼蛋白質(zhì)的功能還不是很明確。Elena Garre和Emilia Matallana［13］研究了釀酒酵母中參與細(xì)胞內(nèi)海藻糖轉(zhuǎn)移的三種海藻糖酶Nth1p，Nth2p和Ath1p，研究發(fā)現(xiàn)，所有已知的海藻糖酶都可以參與到細(xì)胞內(nèi)的調(diào)動、轉(zhuǎn)移，并影響酵母生長速率。雖然已經(jīng)檢測到了nth2編碼的海藻糖酶轉(zhuǎn)錄水平的變化，但是海藻糖水平或是中性海藻糖酶活性水平與這些變化無關(guān)，其功能性質(zhì)及基因特性有待進(jìn)一步研究。

酸性海藻糖酶，由ath1基因編碼，在pH 4.5顯示出最大活力，而酸性海藻糖酶的位置定位依賴于它的活動情況，早期關(guān)于其位置存在爭議。典型說法認(rèn)為是存在于液泡（Vacuole）中，而其他資料表明它定位于周質(zhì)空間（perip lasm ic space）中［40］。但2007年Huang J［41］通過基因融合到綠色熒光蛋白GFP中的亞細(xì)胞定位實驗，確定了酸性海藻糖酶位于液泡中。它與中性海藻糖酶不具同源性，但不排除它參與內(nèi)源性海藻糖的降解。酸性海藻糖酶的活性一般來說不受壓力的調(diào)控，因為在ath1基因的啟動子中缺少STRE序列。

酸性海藻糖和中性海藻糖具有獨特和獨立的作用，但卻都能夠參與細(xì)胞內(nèi)海藻糖的調(diào)動、轉(zhuǎn)移，所以這兩種類型的海藻糖酶共存可能是一個普遍現(xiàn)象，在真菌中積累和分解海藻糖，同時又利用細(xì)胞外海藻糖為碳源。

3 相關(guān)酶基因的生物工程應(yīng)用

近年來對于這一具有獨特性質(zhì)的海藻糖，人們的研究逐步深入，對海藻糖的代謝調(diào)控機(jī)理、生產(chǎn)技術(shù)及其應(yīng)用研究頗為活躍，而且海藻糖相關(guān)酶的生物工程（基因的克隆和表達(dá)）研究也成為熱點。

海藻糖最重要的生物學(xué)功能是其抗逆保護(hù)作用及能量儲備等，為了充分利用這些十分獨特的特性，各研究學(xué)者從兩個方面干擾海藻糖的合成與代謝調(diào)控途徑，從而實現(xiàn)海藻糖在生物體內(nèi)的富集，不僅促進(jìn)海藻糖的生產(chǎn)，還能夠利用海藻糖的抗逆功能構(gòu)建轉(zhuǎn)基因植物。

一方面，是通過對合成海藻糖相關(guān)基因的克隆研究，構(gòu)建其基因表達(dá)載體，并將該載體轉(zhuǎn)入生物體內(nèi)，最終實現(xiàn)海藻糖的富集。而食用傘菌中的海藻糖合成相關(guān)酶的基因工程應(yīng)用近幾年不是很多，僅有少數(shù)，多數(shù)注重于酵母的研究。如徐志祥等［42］通過RT-PCR方法從灰樹花菌絲體總RNA中克隆海藻糖合成酶基因，并將其在大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)，酶活性測定發(fā)現(xiàn)其表達(dá)產(chǎn)物以包涵體形式存在，為低成本合成海藻糖提供了新的思路。因此，利用工程微生物和酶工程方法，能夠改進(jìn)海藻糖的生產(chǎn)，提高質(zhì)量，降低成本；另外，將合成海藻糖的相關(guān)酶基因?qū)氲街参?，?gòu)建重組抗逆植物，使植物體中積累海藻糖，從而使海藻糖發(fā)揮保護(hù)功能，能夠改良植物的某種不良性狀，達(dá)到優(yōu)化育種的效果。Ibolya S等［43］在可干旱誘導(dǎo)的啟動子StDS2的驅(qū)動下將酵母的tps1基因轉(zhuǎn)入馬鈴薯得到了兩棵轉(zhuǎn)基因植株，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該表達(dá)載體在轉(zhuǎn)化植株中僅有很低的tps1基因表達(dá)（可能由于染色體位置的作用），但對轉(zhuǎn)化植株觀察結(jié)果顯示這樣的表達(dá)量足以提高轉(zhuǎn)化植株的抗旱性。轉(zhuǎn)化植株與對照植株相比，萎蔫的時間延長，在CO2的飽和的最大水平上CO2的同化率也顯著提高，氣孔也有所減少，這足以使轉(zhuǎn)化植株具有較低的CO2固定率和提高抗旱性。張樹珍等［44］從擔(dān)子菌灰樹花中克隆海藻糖合成酶基因（TSase）并構(gòu)建單子葉植物表達(dá)載體把它導(dǎo)入甘蔗，為獲得含海藻糖的具抗旱力的新品種提供一定的理論基礎(chǔ)。王自章等［45］把擔(dān)子菌灰樹花的海藻糖合酶基因（TSase）在由雙拷貝CaMV35S啟動子驅(qū)動下導(dǎo)入甘蔗，發(fā)現(xiàn)部分轉(zhuǎn)化植株根葉畸形、株型異常、生長緩慢；移栽到含PEG8000 17.4%（w/v）的MS培養(yǎng)基后，觀察到轉(zhuǎn)基因植株抗?jié)B透脅迫能力增強(qiáng)。未來著重研究海藻糖積累與植物生長發(fā)育之間的關(guān)系，以更好地研究糖與基因表達(dá)調(diào)控之間的關(guān)系，相信通過轉(zhuǎn)化海藻糖合成酶有關(guān)基因增加體內(nèi)海藻糖含量會成為作物抗逆品種選育的新方法。

另一方面就是通過抑制海藻糖酶的生物活性，阻斷海藻糖的分解途徑，以實現(xiàn)海藻糖在生物體內(nèi)的富集［46］。山東大學(xué)微生物實驗室應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)，將釀酒酵母細(xì)胞內(nèi)中性海藻糖酶基因剔除后，中性海藻糖酶活性隨即喪失，細(xì)胞內(nèi)海藻糖含量提高至正常水平的3倍，因而改進(jìn)了海藻糖的發(fā)酵生產(chǎn)工藝，提高了海藻糖的產(chǎn)量，促進(jìn)了海藻糖的生產(chǎn)［47］。

通過對海藻糖代謝途徑的研究，可利用超表達(dá)或RNA干擾技術(shù)等基因工程技術(shù)改造菌株，上調(diào)或下調(diào)海藻糖酶表達(dá)，從而下調(diào)或上調(diào)生物內(nèi)海藻糖含量，對于提高生物的抗逆性至關(guān)重要，是廣大微生物工作者的極大期望，并且具有一定的可行性，值得去探索。

4 討論

由于海藻糖獨特的生物學(xué)性質(zhì)以及由此而帶來的變革性應(yīng)用，吸引了人們的廣泛研究，包括其性質(zhì)、作用機(jī)制、生產(chǎn)應(yīng)用等。然而，關(guān)于海藻糖在食用傘菌中具體發(fā)揮作用的結(jié)構(gòu)特征、代謝途徑及其相關(guān)酶基因調(diào)控的研究、內(nèi)源性及外源性海藻糖對于食用傘菌生長發(fā)育過程中所發(fā)揮的作用仍然了解較少，真正應(yīng)用于生產(chǎn)實踐尚處于起步階段。因此，對海藻糖代謝途徑的相關(guān)基因及生物工程的研究，在理論及實踐上都具有重大意義。

在理論研究方面，海藻糖代謝網(wǎng)絡(luò)及其相關(guān)酶基因調(diào)控的研究對于揭示生物抗逆機(jī)制及對極端環(huán)境的適應(yīng)機(jī)制具有重要價值。食用菌中，大多數(shù)菇類子實體的產(chǎn)生都要依靠相應(yīng)的環(huán)境變化刺激，如草菇適合于生長在高溫潮濕的環(huán)境，要在相對高溫、高濕的刺激下才會形成原基、產(chǎn)生子實體，溫度變化影響海藻糖含量、相關(guān)酶活及相關(guān)酶基因的表達(dá)量，進(jìn)而會影響草菇的生物學(xué)性狀；而且草菇不耐低溫，細(xì)胞在低溫下缺乏對合成不飽和脂肪酸的調(diào)節(jié)，從而導(dǎo)致低溫對其的損害、液化甚至自溶死亡［48］，外源性海藻糖能夠延長草菇的保鮮期，是草菇保藏的新方法。本實驗室在草菇全基因組測序工作的基礎(chǔ)上，對低溫處理下草菇菌絲體中海藻糖代謝途徑酶的基因表達(dá)量進(jìn)行測定和變化分析，推測海藻糖與草菇抗低溫具有一定的相關(guān)性，海藻糖在細(xì)胞內(nèi)的積累有利于增強(qiáng)草菇對低溫的耐受性。且發(fā)現(xiàn)未經(jīng)外源性海藻糖處理的草菇子實體在4℃貯藏過程中沒有顯著性伸長，但菇體趨向萎縮塌陷，而外源性海藻糖處理組的子實體各項感官品質(zhì)降低程度要顯著小于對照組，推測海藻糖、甘露醇處理能夠在一定程度上延長草菇子實體4℃的貯藏保鮮期［49］。金針菇菌絲生長溫度為21～24℃，而原基的形成需要搔菌處理及相應(yīng)的低溫刺激，探究其生長發(fā)育期間海藻糖的代謝調(diào)控情況，有助于理解金針菇生長發(fā)育過程中的能量利用、代謝情況及現(xiàn)原基、子實體生長的作用機(jī)制；本實驗室根據(jù)金針菇的全基因組序列信息，得到海藻糖合成代謝調(diào)控途徑中涉及的6-磷酸海藻糖酶、6-磷酸海藻糖磷酸酯酶、海藻糖磷酸化酶、中性海藻糖酶和酸性海藻糖基因，目前其表達(dá)方面的研究正在進(jìn)行中。因此，筆者希望通過對金針菇中海藻糖代謝調(diào)控的研究，以期揭示其正常生長發(fā)育過程中的變化規(guī)律，從而進(jìn)一步指導(dǎo)其栽培工藝。

在應(yīng)用方面，相關(guān)基因的克隆及生物工程應(yīng)用已顯示出明顯的經(jīng)濟(jì)效益。將海藻糖合成及分解的相關(guān)酶基因?qū)氲较嚓P(guān)生物體中，不僅能夠改進(jìn)海藻糖生產(chǎn)工藝，還能夠獲得具有抗逆性的轉(zhuǎn)基因植物。雖然目前尚缺乏對食用傘菌海藻糖代謝網(wǎng)絡(luò)與其他糖代謝網(wǎng)絡(luò)的關(guān)系、海藻糖基因組水平的系統(tǒng)研究，但可以通過某些傘菌的全基因組及轉(zhuǎn)錄組測序工作，在基因水平上對海藻糖合成代謝途徑進(jìn)行研究，通過調(diào)控外界脅迫條件，探究其變化機(jī)理的綜合研究，必然能獲得食用傘菌的生長發(fā)育調(diào)控機(jī)制，那么改善栽培工藝、縮短生長周期、提高生產(chǎn)質(zhì)量也將成為可能。

［1］Hounsa CG，Brandt EV，Thevelein J，et al.Role of trehalose in survival of Saccharomyces cerevisiae under osmotic stress［J］. Microbiology，1998，144：671-680.

［2］Purvis JE Yomano LP，Ingram LO.Enhanced trehalose production improves growth of Escherichia coli under osmotic stress［J］.Applied and Environmental Microbiology，2005，71（7）：3761-3769.

［3］劉秀明，黃晨陽，陳強(qiáng)，等.肺形側(cè)耳高溫后恢復(fù)期間海藻糖代謝途徑研究［J］.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，46（24）：5188-5195.

［4］王永紅，郭俊，陳美標(biāo)，等.海藻糖對草菇菌種的低溫保護(hù)效應(yīng)研究［J］.微生物學(xué)通報，2008，35（1）：137-141.

［5］Saito K，YamazakiH，Ohnishi Y，etal.Production of trehalose synthase from a basidiomycete，Grifola frondosa in Escherichia coli［J］.Applied Microbiology and Biotechnology，1998，50（2）：193-198.

［6］Schwarz A，Goedl C，Minani A，etal.Trehalose phosphorylase from Pleurotus ostreatus：Characterization and stabilization by covalent modification，and application for the synthesis of，α，αtrehalose［J］.Journal of Biotechnology，2007，129：140-150.

［7］Eis，C，WatkinsM，Prohaska T.Fungal Trehalose phosphorylase kinetic mechanism，pH-dependence of the reaction and some structural properties of the enzyme from Schizophyllum commune［J］.Biochemical Journal，2001，356：757-767.

［8］Gancedo C，F(xiàn)lores CL.The importance ofa functional trehalose biosynthetic pathway for the life of yeast and fungi［J］.Fems Yeast Research，2004，4：351-359.

［9］劉占磊，黃叢林，張秀海，等.海藻糖的應(yīng)用及其合酶基因TPS在植物轉(zhuǎn)基因中的研究進(jìn)展［J］.中國農(nóng)學(xué)通報，2009，25（6）：54-58.

［10］Elbein AD.The metabolism ofα，α-trehalose.In：Tipson R. S.，Horton D.（Eds.），Advances in carbohydrate chemistry andbiochemistry［J］.New York：Academic Press，1974，30：227-256.

［11］Wyatt GR，Kalf GF.The chemistry of insect hemolymph.II. Trehalose and other carbohydrates［J］.Journal of General Physiology，1957，40（6）：833-847.

［12］AndréVan Laere.Trehalose，reserveand/or stressmetabolite？［J］.Fems Microbiology Letters，1989，63（3）：201-210.

［13］Wiemken A.Trehalose in yeast，stress protectant rather than reserve carbohydrate［J］.Antonie van Leeuwenhoek，1990，58（3）：209-217.

［14］Panek AD.Trehalose metabolism-new horizonsin technological applications［J］.Brazilian Journal of Medical and Biological Research，1995，28：169-181.

［15］Eroglu A，Mehmet T，Thomas LT.Beneficial effect of microinjected trehalose on the cryosurvival of human oocytes［J］. Fertility and Sterility，2002，77：152-158.

［16］Penna MS，F(xiàn)ernandes JRM.Stabilization against thermal inactivation promoted by sugars on enzyme structure and function：Why is trehalose more effective than other sugars？［J］. Archives of Biochemistry and Biophysics，1998，360（1）：10-14.

［17］Wiemken A.Trehalose in yeast，stress protectant rather than reserve carbohydrote［J］.Antonie Van Leeuwenhoek，1992，58（3）：209-217.

［18］Liang Z，MA D Q，Tang L，et al.Expression of t e spinach betaine aldehyde dehydrogenase（BADH）gene in transgenic tobacco plants［J］.Chinese Journal of Biotechnology，1997，13：153-159.

［19］Elena G，Emilia M.The three trehalases Nth1p，Nth2p and Ath1p participate in the mobilization of intracellular trehalose required for recovery from saline stress in Saccharomyces cerevisiae［J］.Microbiology，2009，155：3092-3099.

［20］KongWW，Huang CY，Chen Q，etal.Nitric oxide is involved in the regulation of Trehalose accumulation under heat stress in Pleurotus eryngiivar var.tuoliensis［J］.Biotechnology Letters，2012，34：1915-1919.

［21］Reshkin SJ，Cassano G，Womersley C，et al.Preservation of glucose transport and enzyme activity in fish intestinal brush border and basolateral membrane vesicles［J］.Journal of Experimental Biology，1988，140：123-135.

［22］劉秀明，黃晨陽，陳強(qiáng)，等.外源海藻糖對高溫脅迫下肺形側(cè)耳氧化損傷的緩解效應(yīng)［J］.園藝學(xué)報，2013，40（8）：1501-1508.

［23］De Smet KA，Weston A，Brown IN，et al.Three pathways for trehalose biosynthesis in mycobacteria［J］.Microbiology，2000，146：199-208.

［24］Nelson A，Alfredo MV，Enrique M，et al.Insights on the evolution of trehalose biosynthesis［J］.BMC Evolutionary Biology，2006，6（1）：109-115.

［25］Eberhard O V.Biochemical and genomic regulation of the trehalose cycle in yeast：review of observations and canonical model analysis［J］.Journal of Theoretical Biology，2003，223：55-78.

［26］Aranda JS，Salgado E，Taillandier P.Trehalose accumulation in Saccharomyces cerevisiae cells：experimental data and structural modeling［J］.Biochemical Engineering Journal，2004，17：129-140.

［27］Schmitt AP，McEntee K.Msn2p，a zinc finger DNA-binding protein，is the transcriptional activator of the multistress response in Saccharomyces cerevisiae［J］.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，1996，93：5777-5782.

［28］張芳.南極低溫酵母Guehomyces pullulans 17-1菌株中海藻糖的合成與調(diào)控［D］.青島：中國海洋大學(xué)，2013.

［29］Zhang F，Wang ZP，Chi Z，et al.The changes in Tps1 activity，trehalose content and expression of TPS1 gene in the psychrotolerant yeast Guehomyces pullulans 17-1 grown at different temperatures［J］.Extremophiles：Life under Extreme Conditions，2013，17（2）：241-249.

［30］An MZ，Tang YQ，Mitsumasu K，et al.Enhanced thermotolerance for ethanol fermentation of Saccharomyces cerevisiae strain by overexpression of the gene coding for trehalose-6-phosphate synthase［J］.Biotechnology Letters，2011，33（7）：1367-1374.

［31］Han SE，Kwon HB，Lee SB，etal.Cloningand characterization of a gene encoding trehalose phosphorylase（TP）from Pleurotus sajor-caju［J］.Protein Expression and Purification，2003，30：194-202.

［32］Thevelein JM.Regulation of Trehalosemobilization in fungi［J］.Microbiological Review，1984，48（1）：42-59.

［33］Singer MA，Lindquist S.Thermotolerance in Saccharomyces cerevisiae：the yin and yang of trehalose［J］.Canadian Metallurgical Quarterly，1998，16（11）：460-468.

［34］Elbein AD，Pan YT，Pastuszak I，et al.New insights on trehalose：a multifunctional molecule［J］.Glycobiology，2003，13（4）：17-27.

［35］Arguelles JC.Physiological roles of trehalose in bacteria and yeasts：a comparative analysis［J］.Archives of Microbiol，2000，174（4）：217-222.

［36］Zahringer H，Burgert M，Holzer H，et al.Neutral trehalase Nth1p of Saccharomyces cerevisiae encoded by the NTH1 gene is a multiple stress responsive protein［J］.FEBS Letters，1997，412（3）：615-620.

［37］Zahringer H，Thevelein JM，Nwaka S.Induction of neutral trehalase Nth1 by heat and osmotic stress is controlled by STRE elements and Msn2/Msn4 transcription factors：variations of PKA effect during stress and growth［J］.Molecular Microbiology，2000，135（2）：397-406.

［38］Londesborough J，Varimo K.Characterization of two trehalases in baker's yeast［J］.Biochemical Journal，1984，219：511-518.

［39］Jules M，Beltran G，F(xiàn)rancois J，et al.New insights in yeast trehalose metabolism：NTH2 encodes a functional cytosolic trehalase，and deletion of TPS1 reveals a Ath1p-dependent trehalose mobilization［J］.Applied and Environmental Microbiology，2008，l74：605-614.

［40］Jules M，Guillou V，F(xiàn)rancois J，et al.Two distinct pathways for trehalose assimilation in the yeast Saccharomyces cerevisiae［J］.Applied and Environmental Microbiology，2004，70（5）：2771-2778.

［41］Huang J，ReggioriF，Klionsky DJ.The transmembrane domain of acid trehalase mediates ubiquitin-independent multivesicular body pathway sorting［J］.Molecular Biology of the Cell，2007，18（7）：2511-2524.

［42］徐志祥，李剛，王震宇，等.灰樹花海藻糖合成酶基因的克隆及其在大腸桿菌中的表達(dá)［J］.微生物學(xué)報，2004，44（4）：540-542.

［43］Ibolya S，Sandor D，Mihaly K，et al.Effects of drought on water content and photosynthetic parameters in potato plants expressing the trehalose-6-phosphate synthase gene of Saccharomyces cerevisiae［J］.Planta，2008，227（2）：299-308.

［44］張樹珍，鄭學(xué)勤，林俊芳，等.海藻糖合酶基因的克隆及轉(zhuǎn)化甘蔗的研究［J］.農(nóng)業(yè)技術(shù)學(xué)報，2000（8）：385-388.

［45］王自章，張樹珍，楊本鵬，等.甘蔗根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化海藻糖合酶基因獲得抗?jié)B透脅迫能力增強(qiáng)植株［J］.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2003，36（2）：140-146.

［46］李亞鵬，陳明杰，鮑大鵬，等.真菌中的海藻糖及其在低溫逆境下的作用［J］.食用菌學(xué)報，2013，20（4）：71-77.

［47］邵引剛，李峰，孫輝，等.海藻糖的應(yīng)用及基因工程研究［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，36（3）：857-859.

［48］Li PH，Sakai A.Plant cold and freezing stresses［M］.New York：Academic Press，1982：2.

［49］李亞鵬，陳明杰，趙妍，等.低溫脅迫下草菇海藻糖磷酸化酶基因表達(dá)變化研究［J］.生物學(xué)雜志，2014，31（5）：14-18.

Regulation of genes involved in metabolism of trehalose in edible Agaricomycetes and their applications in bioengineering

LIU Jian-hui1，2，SHANG Xiao-dong1，*，LIYa-peng1，2，ZHAO Yan1，TAN Qi1，2，*
（1.Key Laboratory of Applied Mycological Resources and Utilization，Ministry of Agriculture，National Engineering Research Center of Edible Fungi，Shanghai Key Laboratory of Agricultural Genetics and Breeding，Institute of Edible Fungi，SAAS，Shanghai201403，China；2.College of Food Science，Shanghai Ocean University，Shanghai201306，China）

Trehalose，as a unique disaccharide，plays special protective role against external stress conditionsand was widely distributed in archaea，bacteria，fungi，plants and animals. In this review，the physicochemicalproperties and biological characteristics of trehalose were introduced briefly and the metabolic pathways oftrehalose biosynthesis and catabolism in edible Agaricomycetes were summarized. In addition，the researchprogress of the regulation of trehalose metabolism-related enzyme genes was described in details. Thebioengineering applications of trehalose metabolism-related genes in edible Agaricomycetes were alsodiscussed.

trehelose；edible Agaricomycetes；metabolism；regulation；bioengineering

TS201.1

A

1002-0306（2015）08-0374-07

10.13386/j.issn1002-0306.2015.08.070

2014－07－18

劉建輝（1991-），女，碩士研究生，研究方向：食藥用菌遺傳與育種。

*通訊作者：譚琦（1963-），女，博士，研究員，研究方向：食用菌遺傳育種。尚曉冬（1973-），男，博士，研究員，研究方向：食用真菌栽培育種，食用菌菌種、產(chǎn)品質(zhì)量檢測方法探索研究。

國家科技支撐項目“食用菌新品種培育及制種關(guān)鍵技術(shù)研究”（2013BAD16B02）；上海市科技人才計劃項目（13XD1424700）資助。