鯽魚卵唾液酸糖蛋白對(duì)免疫功能低下小鼠的免疫調(diào)節(jié)作用

周曉春，于 哲，毛 磊，趙延蕾，王一名，王靜鳳

（中國海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東青島266003）

鯽魚卵唾液酸糖蛋白對(duì)免疫功能低下小鼠的免疫調(diào)節(jié)作用

周曉春，于 哲，毛 磊，趙延蕾，王一名，王靜鳳*

（中國海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東青島266003）

從鯽魚卵中提取唾液酸糖蛋白，并探討其對(duì)免疫功能低下小鼠免疫功能的作用。Balb/c小鼠連續(xù)皮下注射氫化可的松造成免疫功能低下模型，以不同劑量的鯽魚卵唾液酸蛋白灌胃28d后，分別測(cè)定小鼠的抗體產(chǎn)生水平、T細(xì)胞免疫功能、非特異性免疫功能和血清IFN-γ/IL-4。結(jié)果顯示，高劑量的鯽魚卵唾液酸糖蛋白能顯著升高免疫低下小鼠的血清溶血素水平（p＜0.01）和抗體細(xì)胞生成數(shù)（p＜0.01），增強(qiáng)脾淋巴細(xì)胞增殖能力（p＜0.01）和遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)（p＜0.05），顯著提高腹腔巨噬細(xì)胞對(duì)雞紅細(xì)胞的吞噬率和吞噬指數(shù)（p＜0.01），改善碳廓清能力（p＜0.05）并升高血清中IFN-γ/IL-4水平（p＜0.01）。說明鯽魚卵唾液酸糖蛋白對(duì)免疫功能低下小鼠具有顯著的免疫調(diào)節(jié)作用。

鯽魚卵唾液酸糖蛋白，血清溶血素，脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化，遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)，IFN-γ/IL-4

魚卵是魚類加工過程中產(chǎn)生的重要副產(chǎn)物，目前除少量優(yōu)質(zhì)魚卵被用來加工為腌漬魚卵、魚子醬等初級(jí)食品形式外，大部分未被充分利用，造成了資源浪費(fèi)。而魚卵含有生命體發(fā)育所需的全部營養(yǎng)成分，其營養(yǎng)價(jià)值很高。研究表明魚卵主要成分為蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和礦物質(zhì)，其中卵黃蛋白是主要成分，包括卵黃高磷蛋白、卵黃脂磷蛋白和β′組分［1-2］，富含糖蛋白組分。但目前對(duì)魚卵功效成分的研究主要集中在功能性脂質(zhì)部分，而對(duì)魚卵中糖蛋白組分的研究尚未見報(bào)道。

本課題組前期經(jīng)篩選研究發(fā)現(xiàn)，鯽魚卵中唾液酸含量豐富，從鯽魚卵中提取的唾液酸糖蛋白具有促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖的活性。另有研究報(bào)道，富含唾液酸糖蛋白的燕窩勻漿可以有效改善免疫低下小鼠的免疫功能，其免疫功能與唾液酸糖蛋白組分有關(guān)［3-4］。因此本研究以高唾液酸含量的鯽魚卵糖蛋白為研究對(duì)象，觀察了其對(duì)免疫功能低下小鼠的免疫調(diào)節(jié)作用，為魚卵資源的深度開發(fā)和綜合利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮鯽魚 體重約0.5kg，處于魚卵成熟期，購于青島市大連路水產(chǎn)品市場(chǎng)；BALB/c小鼠 雄性，4～6周齡，體重17～19g，SPF級(jí)，北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，動(dòng)物合格證號(hào)SCXK（京）-20120001；成年豚鼠 雌性，體重400～500g，山東魯抗制藥有限公司提供，動(dòng)物證號(hào)SCXK（魯）-20030006，抽取其心血，常規(guī)分離血清，以壓積的綿羊紅細(xì)胞吸收后，作為本實(shí)驗(yàn)的補(bǔ)體；健康公雞 購于青島市南山市場(chǎng)，抽取雞翼靜脈血，按常規(guī)方法制備雞紅細(xì)胞（Chicken red blood cell，CRBC）；N-乙酰神經(jīng)氨酸（N-acetylneuram inicacid，NAG）、刀豆蛋白（ConA）、噻唑藍(lán)［（4，5-dimethylthiazol-2-yl）-2，5-diphenyltetrazolium bromide，MTT］美國Sigma公司；綿羊紅細(xì)胞 濟(jì)南萬德廣聯(lián)醫(yī)療器械有限責(zé)任公司提供；氫化可的松注射液 西安利君制藥有限責(zé)任公司；鹽酸左旋咪唑 山東省莒南制藥廠；印度墨汁 北京篤信精細(xì)制劑廠產(chǎn)品；IFN-γ、IL-4 ELISA試劑盒 武漢博士德生物技術(shù)有限公司。

Aglient1100型高效液相色譜儀 美國Aglient公司；ALPHA1-4LD型冷凍干燥機(jī) 德國CHRIST公司；MR-23i型高速冷凍離心機(jī) 法國Jouan公司；LABOROTA4000型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 德國Heidolph公司；680型酶標(biāo)儀 美國Bio-Rad公司；2711型CO2培養(yǎng)箱 德國Heraeus公司；120型正置生物顯微鏡 日本Olympus公司；TGL-16G型臺(tái)式離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；鍍鉻游標(biāo)卡尺（精度0.02mm） 江西工具廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 鯽魚卵唾液酸糖蛋白的制備 新鮮鯽魚，分離魚卵，低溫下剔除卵巢膜后高速攪拌破碎，冷凍干燥處理后，以15倍體積的95%乙醇脫脂12h，冷風(fēng)干燥后得脫脂魚卵。脫脂魚卵以蒸餾水（脫脂魚卵/水= 1/30，V/V）攪拌提取兩次，8000r/m in低溫離心20m in，上清液合并后于45℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后冷凍干燥，得鯽魚卵唾液酸糖蛋白。參照文獻(xiàn)方法［5］，以NAG為標(biāo)準(zhǔn)品、DAD串聯(lián)HPLC法測(cè)得其唾液酸含量為5.89%± 1.11%，F(xiàn)olin-酚法測(cè)得其蛋白含量為34.51%±2.00%，苯酚-硫酸法測(cè)得其粗多糖含量為6.06%±0.07%。

1.2.2 動(dòng)物分組與模型建立 BALB/c小鼠，適應(yīng)性喂養(yǎng)7d后，按體重隨機(jī)分為正常對(duì)照組（N），模型對(duì)照組（M），陽性對(duì)照組（P）和鯽魚卵唾液酸糖蛋白低、高劑量組（JL，JH），每組10只。劑量組小鼠灌胃不同濃度的鯽魚卵唾液酸糖蛋白溶液（10、50mg/kg·bw）。陽性對(duì)照組灌胃左旋咪唑（20mg/kg·bw），正常和模型對(duì)照組灌胃生理鹽水，灌胃體積10m L/kg·bw，1次/d，連續(xù)28d。于首次給藥后的第21d，正常對(duì)照組除外，其余各組小鼠均于頸部皮下注射氫化可的松（23mg/kg·bw），每天1次，連續(xù)7d，建立免疫功能低下小鼠模型，正常對(duì)照組注射等量生理鹽水。

1.2.3 血清溶血素的測(cè)定 首次給藥第23d時(shí)，各組小鼠腹腔注射0.2m L 5%（體積分?jǐn)?shù)，以下SRBC的百分濃度均指體積分?jǐn)?shù)）SRBC致敏。末次灌胃給藥后，摘眼球取血，分離血清。按血清∶生理鹽水=1∶100稀釋后，參考文獻(xiàn)方法［6］測(cè)定血清溶血素含量，計(jì)算半數(shù)溶血值（HC50）。

1.2.4 抗體生成細(xì)胞數(shù)的測(cè)定 小鼠致敏方法同1.2.3，末次給藥后，脫頸椎處死。無菌取脾，以RPM I-1640培養(yǎng)基制備脾細(xì)胞懸液（濃度為107個(gè)/m L）。于冰浴中，各試管依次加入脾細(xì)胞懸液、0.4%SRBC、1∶15豚鼠血清各0.5m L（對(duì)照管以生理鹽水代替脾細(xì)胞懸液），37℃水浴60m in，冰浴終止反應(yīng)，3000r/m in離心5m in，上清液于450nm處測(cè)吸光值A(chǔ)。

1.2.5 遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)（足跖增厚法）的測(cè)定 參照文獻(xiàn)方法［7］測(cè)定，以足跖增厚法來檢測(cè)小鼠的遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)。小鼠致敏方法同1.2.3，致敏4d后，分別測(cè)量各組小鼠左后足跖厚度。測(cè)量部位足跖再次注射20μL 20%SRBC進(jìn)行第二次致敏，24h后測(cè)量其厚度，并計(jì)算2次致敏前后足跖的厚度差值。

1.2.6 脾T淋巴細(xì)胞增殖能力的測(cè)定 于末次給藥后，小鼠脫頸椎處死。無菌取脾，制備小脾細(xì)胞懸液，脾T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化的測(cè)定方法參考文獻(xiàn)［7］。其中，脾淋巴細(xì)胞的接種濃度為5×106個(gè)/m L，ConA的終濃度為5μg/m L。于570nm處測(cè)定吸光值，脾淋巴細(xì)胞的增殖能力以加和不加ConA的吸光值的差值表示。

1.2.7 小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬能力的測(cè)定 于末次給藥后禁食不禁水12h，每只小鼠腹腔注射1m L 2%（體積分?jǐn)?shù)）雞紅細(xì)胞懸液，30min后脫頸椎處死。小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的收集、染色和計(jì)數(shù)參見文獻(xiàn)方法［6］，計(jì)算吞噬百分率和吞噬指數(shù)。

1.2.8 小鼠碳廓清能力的測(cè)定 末次給藥12h后，稱重。尾靜脈注射印度墨汁（以生理鹽水按1∶4稀釋），注射體積0.1m L/10g·bw。碳廓清能力測(cè)定方法參照文獻(xiàn)［6］。并計(jì)算小鼠巨噬細(xì)胞對(duì)血液內(nèi)碳粒的吞噬指數(shù)。

1.2.9 血清IL-4和IFN-γ含量的測(cè)定 于末次給藥后，禁食不禁水12h，摘眼球收集血液，常規(guī)分離血清，參照ELISA試劑盒方法分別檢測(cè)血清IFN-γ和IL-4含量。

1.著重學(xué)習(xí)過程當(dāng)中的評(píng)價(jià)。在學(xué)習(xí)過程中，學(xué)生的各方面能力都會(huì)得到不同程度的鍛煉，學(xué)生的創(chuàng)新意識(shí)也會(huì)展現(xiàn)，所以對(duì)過程的評(píng)價(jià)很重要。

1.2.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS11.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，同時(shí)進(jìn)行LSD兩兩比較，以p＜0.05為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的差異。所有實(shí)驗(yàn)結(jié)果均用（±s）表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 對(duì)抗體水平和抗體細(xì)胞生成數(shù)的影響

血清溶血素水平和抗體細(xì)胞生成數(shù)代表了小鼠體內(nèi)抗體生成細(xì)胞的抗體產(chǎn)生水平，反映了體液免疫功能［8］。血清溶血素以半數(shù)溶血值HC50表示。由表1可以看出，模型對(duì)照組小鼠的HC50和抗體細(xì)胞生成數(shù)比正常組分別下降了27.84%和58.24%（p＜0.01），表明模型建立成功。相比模型對(duì)照組，高劑量的鯽魚卵唾液酸糖蛋白可顯著提高免疫功能低下小鼠的血清溶血素水平和抗體細(xì)胞生成數(shù)。其中高劑量組的HC50提高了36.21%（p＜0.01），抗體細(xì)胞生成數(shù)提高了37.16%（p＜0.01）。說明高劑量的鯽魚卵唾液酸糖蛋白對(duì)模型小鼠的體液免疫功能有顯著的改善作用。

表1 鯽魚唾液酸糖蛋白對(duì)小鼠抗體細(xì)胞生成數(shù)、足跖增厚值和脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化的影響（n=10，±s）Table 1 Effects of sialoglycoprotein in eggs of Carassius auratus on HC50，Number of antibody-forming cells，DTH and T-cell transformation in immunocompromized mice（n=10，±s）

表1 鯽魚唾液酸糖蛋白對(duì)小鼠抗體細(xì)胞生成數(shù)、足跖增厚值和脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化的影響（n=10，±s）Table 1 Effects of sialoglycoprotein in eggs of Carassius auratus on HC50，Number of antibody-forming cells，DTH and T-cell transformation in immunocompromized mice（n=10，±s）

注：#p＜0.05，##p＜0.01，與正常組比；*p＜0.05，**p＜0.01，與模型組比；表2、表3同。

組別 半數(shù)溶血值 抗體細(xì)胞生成數(shù) 足跖增厚值（mm） 脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化正常組 76.12±5.93 0.261±0.004 0.42±0.03 0.124±0.014模型組 54.93±7.15## 0.109±0.007## 0.32±0.08# 0.069±0.008##陽性組 69.41±4.21** 0.100±0.007** 0.41±0.08* 0.112±0.010**低劑量組 63.84±6.06 0.101±0.003 0.31±0.07 0.076±0.004高劑量組 74.82±5.46** 0.150±0.009** 0.40±0.08* 0.105±0.020**

2.2 對(duì)脾T淋巴細(xì)胞增殖能力和遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)的影響

脾T淋巴細(xì)胞的增殖能力和遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)可以反映小鼠的T細(xì)胞免疫功能［9］。與正常對(duì)照組相比，模型對(duì)照組的脾T淋巴增殖能力降低了43.83%（p＜0.01），足趾增厚值降低了23.79%（p＜0.05）。經(jīng)鯽魚卵唾液酸糖蛋白干預(yù)后，模型小鼠的T細(xì)胞增殖能力和足跖增厚值均有所提高。由表1可知，高劑量組的T細(xì)胞增殖能力和足跖增厚值分別提高了51.02%（p＜0.01）和24.86%（p＜0.05）。表明高劑量的鯽魚卵唾液酸糖蛋白可以顯著改善免疫功能低下小鼠的細(xì)胞免疫功能。

腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬能力可以衡量小鼠體內(nèi)單核-巨噬細(xì)胞的免疫功能，體現(xiàn)了非特異性免疫功能［10］。由表2可知，模型對(duì)照組小鼠的吞噬百分率和吞噬指數(shù)分別下降了25.50%和23.30%（p＜0.01）。灌胃鯽魚卵唾液酸糖蛋白后，小鼠腹腔巨噬細(xì)胞對(duì)雞紅細(xì)胞的吞噬百分率和吞噬指數(shù)均顯著提高（p＜0.01）。數(shù)據(jù)顯示，高劑量組的吞噬百分率和吞噬指數(shù)分別提高了25.05%和22.22%（p＜0.01）。說明鯽魚卵唾液酸糖蛋白對(duì)免疫低下小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬功能有顯著改善作用。

2.4 對(duì)小鼠碳廓清能力的影響

小鼠血清內(nèi)碳粒的廓清速率可以反映小鼠體內(nèi)整個(gè)單核-巨噬細(xì)胞系統(tǒng)的吞噬功能［8］。由表2可以看出，與正常對(duì)照組相比，模型對(duì)照組小鼠的碳粒吞噬指數(shù)降低了20.00%。以鯽魚卵唾液酸糖蛋白灌胃后，高劑量組小鼠比模型組小鼠的碳粒吞噬指數(shù)升高了15.19%（p＜0.05），吞噬率提高了25.05%（p＜0.01）。

表2 鯽魚卵唾液酸糖蛋白對(duì)小鼠吞噬百分率、吞噬指數(shù)和碳廓清能力的影響（n=10±s）Table 2 Effects of sialoglycoprotein in eggs of Carassius auratus on phagocytic rate，phagocytic index and ablity ofcarbon clearance in immunocompromized mice（n=10，±s）

表2 鯽魚卵唾液酸糖蛋白對(duì)小鼠吞噬百分率、吞噬指數(shù)和碳廓清能力的影響（n=10±s）Table 2 Effects of sialoglycoprotein in eggs of Carassius auratus on phagocytic rate，phagocytic index and ablity ofcarbon clearance in immunocompromized mice（n=10，±s）

組別 吞噬百分率（%） 吞噬指數(shù) 碳廓清能力正常組 53.26±0.46 1.76±0.01 5.17±0.44模型組 39.28±0.66## 1.35±0.05## 4.14±0.78##陽性組 44.32±2.15** 1.59±0.07** 5.00±0.70*低劑量組 39.73±0.84 1.44±0.08 4.56±0.43高劑量組 49.12±1.58** 1.65±0.08** 4.76±0.14*

2.5 對(duì)血清IL-4和IFN-γ水平的影響

血清IFN-γ和IL-4分別是Th1和Th2細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子，Th1細(xì)胞介導(dǎo)細(xì)胞免疫，Th2細(xì)胞介導(dǎo)體液免疫。IFN-γ/IL-4比值，可間接反映Th1/Th2的平衡狀態(tài)，是評(píng)價(jià)機(jī)體免疫狀態(tài)的綜合指標(biāo)［11-12］。由表3可以看出，相比于正常對(duì)照組，模型對(duì)照組小鼠血清IL-4水平顯著上升（p＜0.01），IFN-γ/IL-4顯著降低（p＜0.01），表明模型組小鼠體內(nèi)Th1/Th2動(dòng)態(tài)平衡向Th2漂移，處于免疫抑制狀態(tài)。灌胃鯽魚卵唾液酸糖蛋白后，高劑量組IL-4比模型組小鼠降低了27.72%（p＜0.01），而IFN-γ/IL-4值比模型組小鼠升高了34.16%（p＜0.01）。表明鯽魚卵唾液酸糖蛋白可以活化Th1細(xì)胞，促進(jìn)Th1/Th2回復(fù)到平衡狀態(tài)。

表3 鯽魚卵唾液酸糖蛋白對(duì)小鼠INF-γ，IL-4和IFN-γ/IL-4的影響（n=10，±s）Table 3 Effects of sialoglycoprotein in eggs of Carassius auratus on IFN-γ，IL-4 and IFN-γ/IL-4 in immunocompromized mice（n=10±s）

表3 鯽魚卵唾液酸糖蛋白對(duì)小鼠INF-γ，IL-4和IFN-γ/IL-4的影響（n=10，±s）Table 3 Effects of sialoglycoprotein in eggs of Carassius auratus on IFN-γ，IL-4 and IFN-γ/IL-4 in immunocompromized mice（n=10±s）

組別Group IFN-γ（pg/mL） IL-4（pg/mL） IFN-γ/IL-4正常組 425.07±11.84 77.25±12.07 5.34±0.63模型組 434.21±14.85 103.49±7.31## 4.21±0.32##陽性組 429.39±20.00 85.46±11.91** 5.10±0.69*低劑量組 431.05±31.49 93.02±7.31** 4.66±0.51高劑量組 420.61±34.95 74.80±4.76** 5.65±0.69**

3 結(jié)論與討論

機(jī)體的免疫系統(tǒng)包括具有免疫功能的器官、組織和分子等，分為特異性免疫和非特異性免疫。本研究主要從特異性免疫及非特異性免疫功能等方面評(píng)價(jià)鯽魚卵唾液酸糖蛋白對(duì)機(jī)體免疫功能的調(diào)節(jié)作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，鯽魚卵唾液酸糖蛋使血清溶血素含量顯著提高了36.21%（p＜0.01），使抗體細(xì)胞生成數(shù)提高了37.21%（p＜0.01），并可顯著改善T細(xì)胞介導(dǎo)的遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)、促進(jìn)脾T細(xì)胞增殖，說明其能增強(qiáng)免疫低下小鼠的特異性免疫。同時(shí)，鯽魚卵唾液酸糖蛋白使巨噬細(xì)胞的吞噬指數(shù)和吞噬率分別顯著提高了25.05%和22.22%（p＜0.01），說明免疫功能低下小鼠的非特異性免疫功能被顯著改善。血清IFN-γ/ IL-4的升高表明其可以顯著逆轉(zhuǎn)免疫機(jī)能低下小鼠體內(nèi)Th1/Th2的漂移，增強(qiáng)細(xì)胞免疫功能。

Matsuda等研究發(fā)現(xiàn)，雞蛋中的糖蛋白可以增強(qiáng)機(jī)體免疫力［13］。糖蛋白增強(qiáng)免疫調(diào)節(jié)能力的機(jī)理被認(rèn)為是糖蛋白中特定的寡糖具有作為專一信息載體的能力而影響淋巴細(xì)胞的許多功能，包括有機(jī)體中細(xì)胞有絲分裂原的激活作用、細(xì)胞對(duì)毒素的反應(yīng)和淋巴細(xì)胞對(duì)靶器官的作用等［14］。本研究的結(jié)果表明鯽魚卵中含有唾液酸的糖蛋白在50mg/kg·bw的劑量下，對(duì)免疫功能低下小鼠具有全面的免疫促進(jìn)作用，所以鯽魚卵唾液酸糖蛋白可以作為免疫增強(qiáng)劑。但是唾液酸糖蛋白的結(jié)構(gòu)和具體的免疫增強(qiáng)機(jī)制及其關(guān)系還需進(jìn)一步著重研究和深入探討。

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Immunomodulatory effects of sialoglycoprotein in eggs ofCarassius auratus on immunocompromized mice

ZHOU Xiao-chun，YU Zhe，MAO Lei，ZHAO Yan-lei，WANG Yi-m ing，WANG Jing-feng*
（College of Food Science and Engineering，Ocean University of China，Qingdao 266003，China）

Sialoglycoprotein was extracted from eggs of Carassius auratus，and its immunomodulatory effects onimmunocompromized mice were studied. Different dosage of sialoglycoprotein from eggs of Carassius auratuswas given to immunodepressive model mice induced by Hydrocortisone for 28d. The antibody level ，immunological function of T cell and level of serum interferon-γ （IFN-γ） and interleukin-4 （IL-4） wasmeasured. Results showed that high -dose of sialoglycoprotein could increased the hemolysin content andnumbers of antibody-forming cells（p＜0.01） and strengthened lymphocyte proliferation（p＜0.01） significantly. Itcould aslo increase toe incrassation（p＜0.01） and promote phagocytosis ability of celiac macrophage（p＜0.05）and serum IFN-γ/IL-4（p＜0.01） markedly. Data suggested that the sialoglycoprotein from Carassius auratushad significant immunomodulatory effects on immunocompromized mice.

sialoglycoprotein from eggs of Carassius auratus ；hemolysin ；spleen lymphocyte transformation ；delayed-type hypersensitivity；IFN-γ/IL-4

TS201.4

A

1002-0306（2015）08-0340-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.08.062

2014－07－17

周曉春（1989-），女，碩士研究生，研究方向：海洋生物活性物質(zhì)。

*通訊作者：王靜鳳（1964-），女，博士，教授，研究方向：海洋生物活性物質(zhì)。

國家自然科學(xué)基金（31371876）；山東省自主創(chuàng)新專項(xiàng)項(xiàng)目（2012CX80201）。