響應(yīng)面優(yōu)化超聲-微波協(xié)同提取黃秋花中總黃酮工藝的研究

盛 瑋，滕井通，薛建平，段永波，耿秋瑾（.淮北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，安徽淮北235000；2.資源植物生物學(xué)安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽淮北235000）

響應(yīng)面優(yōu)化超聲-微波協(xié)同提取黃秋花中總黃酮工藝的研究

盛 瑋1，2，滕井通1，2，薛建平1，2，段永波1，2，耿秋瑾1
（1.淮北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，安徽淮北235000；2.資源植物生物學(xué)安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽淮北235000）

為確定黃秋葵花中總黃酮提取的最佳工藝，在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，應(yīng)用響應(yīng)面法優(yōu)化黃秋葵花中總黃酮的提取條件。結(jié)果表明：微波功率、提取時(shí)間和料液比對黃酮提取率影響極顯著；最佳工藝條件為：乙醇濃度70.3%（v/v）、微波功率263W、提取時(shí)間275s、料液比1∶30.2（g/mL），在此條件下，黃秋葵花中總黃酮的得率為3.937%。

超聲-微波協(xié)同萃取，黃秋葵花，總黃酮，響應(yīng)面法

黃秋葵［Abelmoschus esculentus（L.）Moench］為錦葵科秋葵屬一年生草本植物，又名咖啡黃葵、秋葵、補(bǔ)腎草等，原產(chǎn)于非洲熱帶地區(qū)，現(xiàn)在我國南北方各地均有種植。可供食用的黃秋葵嫩果，富含蛋白質(zhì)、多糖、不飽和脂肪酸、黃酮、維生素等多種生物活性物質(zhì)［1］，具有抗疲勞、提高機(jī)體免疫力、抗癌、健胃保肝、減少肺損傷、利尿、增強(qiáng)血管擴(kuò)張力、保護(hù)心臟等多種保健功能［2-3］，是一種有巨大發(fā)展?jié)摿Φ臓I養(yǎng)保健蔬菜［4］。目前種植黃秋葵主要出售嫩果，其黃秋葵種子及花沒有被利用，但富含蛋白質(zhì)、多不飽和脂肪酸、多糖、黃酮［5-6］等活性物質(zhì)。其黃酮類物質(zhì)的含量較高［6］，而天然植物黃酮類化合物具有降脂、抗心血管疾病、消除自由其及抗氧化、抗骨質(zhì)疏松、防癌抗癌等作用［7-9］，可廣泛用于醫(yī)藥、化妝品［10］、食品等行業(yè)，具有極廣闊的開發(fā)應(yīng)用前景。

超聲-微波協(xié)同萃取具有操作簡單、有效縮短提取時(shí)間、提高提取率、降低能耗、節(jié)約生產(chǎn)成本等優(yōu)點(diǎn)，已在色素、蛋白質(zhì)、油脂、多糖、果膠等的提取中得到廣泛應(yīng)用［10-17］。本研究以黃秋葵花為原料，采用超聲-微波協(xié)同萃取法提取黃秋葵花中總黃酮，通過響應(yīng)面法優(yōu)化黃秋葵花中總黃酮提取工藝，為開發(fā)利用黃秋葵花中的黃酮，提高黃秋葵種植效益提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黃秋葵花 采摘于淮北遠(yuǎn)創(chuàng)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)綜合示范園，干燥、粉碎后過20目備用；95%乙醇、濃鹽酸、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉等 均為分析純；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（＞98%） 中國藥品生物制品檢定所。

FDV超微粉碎機(jī) 北京環(huán)亞天元機(jī)械技術(shù)有限公司；CW-2000型超聲-微波協(xié)同萃取儀 上海新拓微波溶樣測試技術(shù)有限公司；AUX120型電子天平日本島津公司；UV-4802型紫外可見分光光度計(jì) 尤尼科上海儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 黃酮類化合物含量測定

1.2.1.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制及標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定［18］準(zhǔn)確稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品10.00mg，用75%的乙醇溶解并定容至50m L容量瓶中，其濃度為0.20mg/m L的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。準(zhǔn)確吸取0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5m L標(biāo)準(zhǔn)溶液于10m L的容量瓶中，再分別加入0.3m L濃度為5%NaNO2溶液，搖勻后放置6m in，加入0.3m L 10%A l（NO3）3溶液，搖勻后放置6m in，加入4.0m L濃度4%NaOH溶液，最后用75%的乙醇定容至刻度，搖勻，靜置12m in，在400～700nm波長下掃描，結(jié)果顯示在508nm波長處有最大吸收峰。故508nm處測定各濃度標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度，以吸光度對質(zhì)量濃度做標(biāo)準(zhǔn)曲線。蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液在此質(zhì)量濃度范圍內(nèi)與吸光度成良好線性關(guān)系，線性回歸方程為A=11.201C－0.0131，R2=0.9998。

1.2.1.2 黃秋葵花中總黃酮含量的測定 取黃秋葵花提取液1.0m L置于10m L的容量瓶中，分別加入5% NaNO2溶液0.3m L，搖勻后放置6m in，加入10%A l（NO3）3溶液0.3m L，搖勻后放置6m in，再加入4%NaOH溶液4.0m L，最后用75%的乙醇定容至刻度，搖勻后靜置12m in，在508nm處測定吸光度，根據(jù)線性回歸方程換算成樣品中的總黃酮含量。

1.2.2 黃秋葵花中總黃酮提取單因素研究

1.2.2.1 乙醇濃度的選擇 稱取5.0g黃秋葵花，按料液比1∶30（g/m L）加入不同體積濃度的乙醇溶液，微波功率240W，超聲功率50W，萃取240s后，提取液過濾定容，按1.2.1方法測定黃秋葵花提取液吸光度，并計(jì)算黃秋葵花中總黃酮得率。

1.2.2.2 浸提時(shí)間的選擇 稱取5.0g黃秋葵花，按料液比1∶30（g/m L）加入70%的乙醇溶液，在微波功率240W及超聲功率50W下，萃取不同的時(shí)間后，提取液過濾定容，按1.2.1方法測定黃秋葵花提取液吸光度，并計(jì)算黃秋葵花中總黃酮得率。

1.2.2.3 微波功率的選擇 稱取5.0g黃秋葵花，按料液比1∶30（g/m L）加入70%的乙醇溶液，超聲功率50W，分別在不同的微波功率下，萃取240s后，提取液過濾定容，按1.2.1方法測定黃秋葵花提取液吸光度，并計(jì)算黃秋葵花中總黃酮得率。

1.2.2.4 料液比的選擇 稱取5.0g黃秋葵花，按不同的料液比分別加入70%的乙醇溶液，在微波功率240W及超聲功率50W下，萃取240s后，提取液過濾定容，按1.2.1方法測定黃秋葵花提取液吸光度，并計(jì)算黃秋葵花中總黃酮得率。

1.2.3 黃秋葵花中總黃酮提取工藝的優(yōu)化 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以超聲波功率為50W，選取乙醇濃度（X1）、微波功率（X2）、提取時(shí)間（X3）和液料比（X4）四個(gè)因素為自變量，以黃秋葵花中總黃酮得率（Y）為評價(jià)指標(biāo)，采用4因素3水平的Box-Behnken實(shí)驗(yàn)方法對提取條件進(jìn)行優(yōu)化，實(shí)驗(yàn)因素及水平設(shè)計(jì)見表1。

表1 Box-Benhnken響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels in the Box-Benhnken experimental design

式中，c為提取液黃酮的含量（mg/m L）；V為提取液的體積（m L），m為黃秋葵花干重（mg）。

1.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 所有的實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，利用Excel和M initab 15統(tǒng)計(jì)軟件對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同乙醇濃度的浸提劑對黃秋葵花中總黃酮提取效果的影響

由圖1可知，乙醇濃度在40%～70%范圍內(nèi)，隨著乙醇濃度增加，黃秋葵花中總黃酮得率增加，但乙醇濃度超過70%時(shí)，黃秋葵花中總黃酮得率反而下降，故提取劑乙醇濃度以70%左右為宜。

圖1 乙醇濃度對黃秋葵花中總黃酮提取效果的影響Fig.1 Effect of ethanol concentration on extraction

2.2 浸提時(shí)間對黃秋葵花中總黃酮提取效果的影響

由圖2可知，在240s時(shí)間內(nèi)，隨時(shí)間的延長，黃秋葵花總黃酮提取率迅速增加。超過240s后，黃秋葵花總黃酮不再增加，反而出現(xiàn)下降，這可能是由于某些黃酮降解及提取劑揮發(fā)所致。從生產(chǎn)成本考慮，提取時(shí)間越長，能耗越大，故提取時(shí)間以240s左右為宜。

2.3 微波功率對黃秋葵花中總黃酮提取效果的影響

由圖3可知，當(dāng)微波功率在60～240W時(shí)，隨著微波功率的增大，微波的作用逐漸加強(qiáng)，黃秋葵花總黃酮得率逐漸增加。當(dāng)微波功率達(dá)到240W時(shí)，黃秋葵花中總黃酮得率達(dá)到最大，之后呈逐漸下降趨勢，可能是由于較大微波功率使黃秋葵花中的某些黃酮類成分遭到破壞，從而導(dǎo)致黃酮得率有所下降，因此微波功率以240W左右為宜。

圖2 浸提時(shí)間對黃秋葵花中總黃酮提取效果的影響Fig.2 Effect of extraction time on extraction

圖3 微波功率對黃秋葵花中總黃酮提取效果的影響Fig.3 Effect of microwave output power on extraction

2.4 料液比對黃秋葵花中總黃酮提取效果的影響

由圖4可知，料液比在1∶15～1∶30范圍內(nèi)，黃秋葵花中總黃酮得率隨料液比的增加顯著提高，其原因可能是隨著料液比的增加黃酮的傳質(zhì)動(dòng)力也增加，使得原料中更多的黃酮融入提取劑中。當(dāng)料液比超過1∶30時(shí)，黃酮的提取率沒有顯著變化，因此，黃秋葵花中總黃酮提取料液比為1∶30左右為宜。

圖4 料液比對黃秋葵花中總黃酮的浸提效果Fig.4 Effect of different ratio of material to solvent on extraction

2.5 超聲-微波協(xié)同提取黃秋葵花中總黃酮的工藝優(yōu)化

2.5.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果 以單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果為基礎(chǔ)，選取對黃秋葵花中總黃酮得率影響較大的乙醇濃度（X1）、微波功率（X2）、提取時(shí)間（X3）和液料比（X4）四個(gè)因素為自變量，以黃秋葵花中總黃酮得率（Y）為響應(yīng)值，根據(jù)相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)表進(jìn)行實(shí)驗(yàn)后，對數(shù)據(jù)進(jìn)行二次回歸擬合，得到包括一次項(xiàng)、二次項(xiàng)、交互項(xiàng)的二次方程，分析各因素的主效應(yīng)和交互效應(yīng)，最后在一定水平范圍內(nèi)求取最佳值，實(shí)驗(yàn)方案及結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面分析方案及實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Experimental design and corresponding results for response surface analysis

2.5.2 模型方程的建立與顯著性檢驗(yàn) 利用M initab 15統(tǒng)計(jì)軟件，對表2中實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，獲得黃秋葵花中總黃酮得率對編碼自變量乙醇濃度、提取時(shí)間、微波功率和液料比的二次多項(xiàng)回歸。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果建立的數(shù)學(xué)模型為：

表3的方差分析表明，回歸方程具有高度的顯著性（p≤0.01），R2=0.9929，表明響應(yīng)值黃秋葵花中總黃酮得率實(shí)際值與預(yù)測值之間具有較好的擬合度。為檢驗(yàn)方程的有效性，對黃秋葵花中總黃酮提取的數(shù)學(xué)模型進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，結(jié)果見表4。由表4可知，一次項(xiàng)X2、X3和X4極顯著（p≤0.01），說明提取時(shí)間、微波功率和液料比對黃秋葵花中總黃酮得率有極顯著影響，乙醇濃度對黃秋葵花中總黃酮得率有顯著影響（p≤0.05）。交互項(xiàng)X1X3、X1X4、X2X4極顯著（p≤0.01），說明乙醇濃度和微波功率、乙醇濃度和料液比、提取時(shí)間和料液比交互項(xiàng)對黃秋葵花中總黃酮得率有極顯著的影響。二次項(xiàng)X12、X22、X32和X42對黃秋葵花中總黃酮得率也有極顯著的影響（p≤0.01）。

表3 方差分析表Table 3 Analysis of variance table

表4 回歸方程偏回歸系數(shù)的估計(jì)值Table 4 Estimated values of the partial regression coefficients of the regressionmodel

2.5.3 響應(yīng)面分析 響應(yīng)面圖形是響應(yīng)值Y對應(yīng)于實(shí)驗(yàn)因素X1、X2、X3和X4所構(gòu)成的三維空間的曲面圖及其在二維平面上的等高線圖，可以直觀地反映各因素及他們之間的交互作用對響應(yīng)值的影響。由圖5（A）可知，提取時(shí)間對總黃酮得率的影響較顯著，曲面較陡，在提取時(shí)間與乙醇濃度交互作用等高線中，等高線沿提取時(shí)間軸方向變化相對密集；由圖5（B）可知，微波功率對總黃酮得率的影響較顯著，曲面較陡，在微波功率與乙醇濃度交互作用等高線中，等高線沿微波功率軸方向變化相對密集略高于乙醇濃度軸方向；

圖5 各因素交互作用對黃秋葵花中總黃酮得率影響的響應(yīng)面圖Fig.5 Response surface plots showing the interaction effects of four reaction conditions on the yield of total flavonoids

由圖5（C）可知，料液比對總黃酮得率的影響較顯著，曲面較陡，在料液比與乙醇濃度交互作用等高線中，等高線沿料液比軸方向變化相對密集；由圖5（D）可知，提取時(shí)間對總黃酮得率的影響較顯著，曲面較陡，在提取時(shí)間與微波功率交互作用等高線中，等高線沿提取時(shí)間軸方向變化相對密集。圖5（A、B、C、D）等高線呈橢圓形，說明乙醇濃度與提取時(shí)間、乙醇濃度與微波功率、乙醇濃度與料液比及微波功率與提取時(shí)間的交互作用較強(qiáng)，對黃秋葵花中總黃酮得率影響顯著。

2.5.4 黃秋葵花中總黃酮最佳提取條件的確定和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證 在選取的各因素范圍內(nèi)，根據(jù)回歸模型通過Minitab 15軟件分析得出，黃秋葵花中總黃酮最佳提取工藝參數(shù)為：乙醇濃度70.288%、超聲-微波協(xié)同萃取時(shí)間274.824s、微波功率263.274W、料液比1∶30.202（g/m L），黃秋葵花中總黃酮提取得率預(yù)測值為3.95%。考慮到實(shí)際操作的便利，確定黃秋葵花中總黃酮的超聲-微波協(xié)同波提取工藝條件為：超聲-微波協(xié)同提取時(shí)間275s、微波功率263W、乙醇濃度70.3%、料液比1∶30.2（g/m L）。為了證實(shí)預(yù)測的結(jié)果，以最佳工藝參數(shù)做3次平行實(shí)驗(yàn)，黃秋葵花中總黃酮得率平均為3.937%±0.052%，與預(yù)測值為3.95%基本一致（相對誤差0.481%），說明該方程與實(shí)際情況擬合很好，充分驗(yàn)證了所建模型的正確性，說明響應(yīng)曲面法適用于對黃秋葵花中總黃酮的超聲-微波協(xié)同提取工藝進(jìn)行回歸分析和參數(shù)優(yōu)化。

3 結(jié)論

在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，利用實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)軟件Minitab 15，采用響應(yīng)面法建立了黃秋葵花中總黃酮提取工藝條件的二次多項(xiàng)式數(shù)學(xué)模型，對各因子對響應(yīng)值的影響進(jìn)行了分析。結(jié)果表明模型擬合程度高，實(shí)驗(yàn)誤差較小。優(yōu)化得到的黃秋葵花中總黃酮提取工藝條件為超聲-微波協(xié)同萃取時(shí)間為275s、微波功率為263W、乙醇濃度為70.3%、料液比為1∶30.2（g/m L）。在此工藝條件下，黃秋葵花中總黃酮得率率為3.937%。

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Optimization of ultrasonic-microwave synergistic extraction of total flavonoids from Abelmoschus Esculentus（L.）Moench by response surface methodology

SHENG Wei1，2，TENG Jing-tong1，2，XUE Jian-ping1，2，DUAN Yong-bo1，2，GENG Qiu-jin1
（1.College of Life Sciences，HuaibeiNormal University，Huaibei235000，China；2.Anhui Key Laboratory of Plant Resources and Biology，Huaibei235000，China）

To optimize the extraction technology of total flavonoids from flowers of Abelmoschus esculentus（L.）Moench，response surface methodology was applied on the basis of single factor tests. The results showed thatmicrowave power，extraction time and liquid-to-material ratio had extremely significant effect on the extractionyield of flavonoids. Results showed that the optimum conditions were as follows:ethanol concentration 70.3％（v/v），microwave power 263W，extraction time 275s and solid/liquid ratio 1∶30.2（g/mL）. Under the optimized conditions，the exaction yield of total flavonoids from flowers of Abelmoschus esculentus（L.） Moench was 3.937％.

ultrasonic-microwave synergistic extraction；flowers of Abelmoschus esculentus（L.）Moench；total flavonoids；response surface methodology

TS201.1

B

1002-0306（2015）08-0290-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.08.052

2014－06－03

盛瑋（1963-），男，碩士，教授，研究方向：食品生物技術(shù)。

安徽省教育廳自然基金項(xiàng)目（KJ2012A255）；資源植物生物學(xué)安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放基金項(xiàng)目（ZYZWSW2014003）。