超聲提取日本楤木葉片蘆丁工藝優(yōu)化

茹麗葉，李德生，翁喜嬌，王 璠，彭 玲

（天津理工大學環(huán)境科學與安全工程學院，天津300384）

超聲提取日本楤木葉片蘆丁工藝優(yōu)化

茹麗葉，李德生*，翁喜嬌，王 璠，彭 玲

（天津理工大學環(huán)境科學與安全工程學院，天津300384）

利用響應面曲線法優(yōu)化超聲提取日本楤木葉片中蘆丁的工藝條件。在單因素實驗的基礎上，采用中心組合設計響應面實驗，研究了乙醇濃度、提取時間及液料比對日本楤木葉中蘆丁提取量的影響，并建立了二次回歸方程，確定提取蘆丁的最佳工藝組合條件：乙醇濃度為76%，超聲時間為54min，液料比為57∶1mL/g；該條件下日本楤木葉片中蘆丁提取含量理論值為2.222mg/g，實測值為2.187mg/g。

日本楤木，蘆丁，響應面，提取工藝

日本楤木為五加科楤木屬落葉小喬木，是兼食用、藥用、保健為一體的天然木本蔬菜。日本楤木根、莖、葉中富含多種維生素、皂苷、黃酮、氨基酸、礦物元素等［1］；其嫩芽可食用，風味獨特，口感極佳；其根皮、莖皮皆可入藥，可用于治療心血管疾病、肝炎、糖尿病，具有抑制腫瘤生長，降低血糖血脂，抗疲勞，抗缺氧，增強免疫力的功效［2-5］。

超聲波提取法主要利用超聲波的空化作用破壞植物細胞，使提取劑易于滲入細胞，從而提高提取效率［6］。超聲提取法因其省時、耗能低、操作簡便已被廣泛應用于生物活性物質的提取中。目前對楤木屬植物的研究多為分析其化學成分及藥理活性［7-10］，在其黃酮類化合物的研究中，僅有采用硝酸鋁顯色法和紫外分光光度計法測定總黃酮及回流提取總黃酮的工藝條件優(yōu)化［11-13］，對日本楤木的超聲提取、高效液相法測定蘆丁的工藝條件優(yōu)化還未見報道。

本文以日本楤木葉片為原料采用超聲提取的方法，在單因素實驗的基礎上采用響應面法研究乙醇濃度、提取時間和液料比對蘆丁提取量的影響［14-15］，優(yōu)化日本楤木葉片中蘆丁的工藝條件，提高提取效率。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

甲醇（色譜純）、無水乙醇、石油醚（60～90） 北京普博欣試劑公司；超純水 天津市清源泉純凈水經(jīng)營部；蘆丁標準品（純度≥98%） 貴州迪大生物科技有限責任公司；日本楤木葉片 天津理工大學玻璃溫室，采收時間為8月份和11月份。

高效液相色譜儀（Com 6000型，紫外檢測器） 美國CoMetro公司；超聲波清洗器 天津奧特賽恩斯儀器有限公司；RE-52型旋轉蒸發(fā)儀 鞏義市予華儀器有限責任公司；SH2-D型循環(huán)水式真空泵 鞏義市予華儀器有限責任公司；電子分析天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；HHS-2S型恒溫式水浴鍋 上海宜昌儀器紗篩廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 蘆丁超聲提取流程 將烘干的日本楤木葉片研磨成粉末，過60目篩，精密稱取2g，置于150m L三角瓶中，加適量體積分數(shù)的乙醇溶液，25℃下超聲提取一段時間，減壓抽濾，濾液減壓蒸發(fā)除去乙醇，超純水溶解并定容至100m L，溶液用100、50、50m L石油醚分別萃取3次，取水層，沸水浴蒸干，最后用甲醇溶解并定容至25m L，過0.22μm有機膜待測［16-17］。

1.2.2 蘆丁標準曲線的制作 準確稱取烘干的蘆丁標準品20mg，用甲醇溶解并定容至25m L，搖勻，制得標準品儲備液，濃度為0.8mg/m L。精密量取蘆丁標準品儲備液0.1、0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0m L，用甲醇定容至10m L，搖勻，得系列質量濃度對照品溶液，分別取上述溶液20μL注入高效液相色譜儀，在360nm波長處測定其峰面積。

1.2.3 蘆丁的檢測 采用高效液相色譜法對日本楤木葉片中的蘆丁進行測定，色譜柱：CoMetro Kromasil C18（250mm×4.6mm，5μm），柱溫30℃，流速：1m L/m in，檢測波長：360nm，進樣量：20μL，流動相：甲醇∶水= 43∶57（磷酸調(diào)節(jié)pH=3）。

1.2.4 單因素實驗設計

1.2.4.1 乙醇濃度對超聲提取蘆丁的影響 在液料比40∶1m L/g，超聲30min的條件下，以體積分數(shù)分別為60%、70%、80%、90%、100%的乙醇溶液為提取劑對蘆丁進行提取，比較日本楤木葉片中蘆丁的提取量。

1.2.4.2 提取時間對超聲提取蘆丁的影響 在液料比40∶1m L/g，乙醇體積分數(shù)80%的條件下，分別超聲提取20、30、40、50、60m in，比較日本楤木葉片中蘆丁的提取量。

1.2.4.3 液料比對超聲提取蘆丁的影響 在乙醇體積分數(shù)80%，超聲30min的條件下，選取液料比為20∶1、30∶1、40∶1、50∶1、60∶1m L/g分別對蘆丁進行提取，比較日本楤木葉片中蘆丁的提取量。

1.2.5 響應面實驗設計 在單因素實驗基礎上，通過BOX-Behnken中心組合設計原理，以乙醇濃度、提取時間、液料比為實驗因素，以蘆丁含量為響應值，運用Design-Expert.V8.0.6軟件設計三因素三水平的響應面實驗，對超聲提取日本楤木葉片中蘆丁的最佳工藝條件進行優(yōu)化。響應面實驗設計見表1。

表1 蘆丁超聲提取響應面實驗設計Table 1 Response surface experiment design of ultrasound assisted extraction of rutin

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有的實驗數(shù)據(jù)均為三個平行的均值，單因素實驗所得數(shù)據(jù)用Oringe分析和處理；響應面實驗數(shù)據(jù)用Design-Expert軟件分析、處理。

2 結果與分析

2.1 蘆丁標準曲線的建立

以峰面積為橫坐標（X），進樣質量濃度（mg/m L）為縱坐標（Y）進行線性回歸，得蘆丁回歸方程：Y= 0.77234+6.21898E-5X，R2=0.9999。結果表明，蘆丁在0.008～0.640mg/m L范圍內(nèi)線性關系良好。

2.2 蘆丁超聲提取的單因素實驗

2.2.1 乙醇溶度對超聲提取蘆丁的影響 乙醇濃度對蘆丁提取量的影響結果見圖1。從圖1中可以看出，在一定范圍內(nèi)，隨著乙醇濃度的增加蘆丁提取量隨之上升，到80%時達到最高，但當乙醇濃度超過80%后，蘆丁提取量出現(xiàn)降低的趨勢，故選擇乙醇濃度80%為宜。

圖1 乙醇濃度對蘆丁提取效果的影響Fig.1 Effect of ethanol concentration on rutin extraction

2.2.2 提取時間對超聲提取蘆丁的影響 不同提取時間對蘆丁提取量的影響結果如圖2所示。從圖2可知，蘆丁提取量隨著提取時間的延長而增大，超過50min后，蘆丁含量略有下降，可能由于原料中其他醇溶性物質的被溶解提出［18］，或者長時間超聲破壞某些黃酮類化合物的結構［19］，使蘆丁提取率下降，故選擇50m in為宜。

圖2 提取時間對蘆丁提取效果的影響Fig.2 Effect of ultrasonic time on rutin extraction

2.2.3 液料比對超聲提取蘆丁的影響 不同液料比對蘆丁提取量的影響結果如圖3所示。從圖3中可以看出，蘆丁的提取量隨著液料比的增加呈上升趨勢，超過50∶1后，蘆丁的提取量反而下降，可能是因為增加溶劑量有利于蘆丁從原料向浸出提液擴散，提高蘆丁浸出率，當用量增加到一定程度時，會使雜質的溶出量增加，從而降低提取液中蘆丁的濃度［20］，故液料比以50∶1m L/g為宜。

圖3 不同液料比對蘆丁提取量的影響Fig.3 Effect of solid-liquid radio on rutin extraction

2.3 響應面優(yōu)化實驗

在單因素實驗基礎上，根據(jù)Box-Bchnken實驗設計原理，選擇乙醇濃度、提取時間、液料比進行三因素三水平的響應面分析，響應面分析方案及結果見表2。所得數(shù)據(jù)經(jīng)過多元回歸擬合，得到二次回歸方程：Y=2.18-0.10A+0.036B+0.055C-0.028AB-0.033AC-0.016BC-0.16A2-0.045B2-0.046C2。

表2 蘆丁提取響應面分析方案及結果Table 2 Design and experiment result of response surface methodology of rutin extraction

對該回歸模型進行方差分析，結果見表3。從表3可看出，響應回歸模型p＜0.0001，達到了極顯著水平；因變量和全部自變量之間的p值均小于0.05，說明乙醇濃度、提取時間和液料比之間的交互作用明顯，線性關系顯著；失擬項p=0.1177＞0.05，不顯著，模型的校正系數(shù)R2=0.9978，說明模型對實驗擬合程度較好，模型修正相關系數(shù)R2Adj=0.9949，說明該模型很好地反應了乙醇濃度、提取時間、液料與蘆丁提取含量的關系，因此可以用此模型對日本楤木葉片中蘆丁成分進行預測、分析，確定超聲提取蘆丁的最佳工藝條件。

表3 回歸模型方差分析Table 3 Analysis of variance for the regressionmodel

由回歸方程所做的響應曲面和等高線如圖4～圖6所示。響應曲面圖反映的是一個因素取零水平時，另外兩個因素的交互作用對蘆丁提取量的影響情況［21］。該因素對蘆丁提取量的影響越顯著，表現(xiàn)為響應曲面越陡峭，反之，響應曲面越平緩［22］。等高線的形狀反映的是各因素之間的交互作用的強弱，圓形表明交互作用弱，影響不顯著，橢圓形則相反［23-24］。

由圖4～圖6可以看出，隨著各因素的增加或減小，蘆丁提取量都呈現(xiàn)出先增大后減小的趨勢，說明各因素在所選范圍內(nèi)可以產(chǎn)生最大響應值；乙醇濃度變化的響應曲面較超聲提取時間和液料比的響應曲面陡，說明乙醇濃度對蘆丁提取量的影響最顯著，液料比次之。乙醇濃度與超聲提取時間和液料比的等高線都呈橢圓形，說明兩兩交互作用強，而提取時間與液料比的等高線趨于圓形，交互作用相對較弱，與回歸方程分析結果一致。

圖4 提取時間和乙醇濃度的響應面Fig.4 Response surface graph of extracting time and ethanol concentration

通過Design Expert軟件分析出蘆丁提取的最佳工藝條件：乙醇濃度為75.91%，提取時間54.10m in，液料比56.68∶1，提取蘆丁含量的預測值為2.222mg/g?？紤]實際操作難以達到，將最優(yōu)條件修正為：乙醇濃度76%，提取時間54m in，液料比57∶1m L/g。同時進行三次驗證實驗，得蘆丁平均含量為2.187mg/g，與理論預測值接近，證實了此模型的可靠性。

圖5 液料比和乙醇濃度的響應面Fig.5 Response surface graph of solid-liquid radio and ethanol concentration

圖6 液料比和提取時間的響應面Fig.6 Response surface graph of solid-liquid radio and extracting time

3 結論

通過單因素及響應面實驗得到乙醇-超聲提取日本楤木葉片中蘆丁的最佳工藝條件，并結合實際操作確定其最佳工藝條件為：乙醇濃度76%，提取時間54m in，液料比57∶1m L/g，該條件下蘆丁提取含量理論值為2.222mg/g，實測值為2.187mg/g。超聲提取日本楤木葉片中的蘆丁，省時、便捷，提取效率較高，可為黃酮類化合物的有效利用提供理論依據(jù)。

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Optimizing ultrasonic-assisted extraction of rutin extraction from leaves of Aralia elata var.inerm is

RU Li-ye，LIDe-sheng*，WENG Xi-jiao，WANG Fan，PENG Ling
（School of Environment Science and Safety Engineering，Tianjin University of Technology，Tianjin 300384，China）

The response surface methodology was used to optimize ultrasonic-assisted extraction technology ofrutin from Aralia elata var.inermis. Based on single factor tests，a central composite design experiment wasconducted and the response surface analysis was employed to investigate the influence of three factorsincluding concentration of ethanol，the extraction of time，and solid liquid ratio on the yield of rutin and then aquadratic regression model was established. The best concentration of ethanol，the extraction of time，and solidliquid ratio were 76％，54min，57∶1mL/g，under which the predicted yield of rutin extraction from leaves of Araliaelata var.inermis with the optimized procedure was 2.222mg/g，and the practical yield of rutin was 2.187mg/g.

Aralia elata var.inerm is；rutin；response surface methodology；extraction conditions

TS201.1

B

1002-0306（2015）08-0282-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.08.050

2014－08－04

茹麗葉（1989-），女，碩士研究生，研究方向：林學、生態(tài)學。

*通訊作者：李德生（1964-），男，博士，教授，研究方向：環(huán)境科學與生態(tài)學的教學和研究。

天津市科技支撐計劃重點項目（12ZCZDNC00400）；天津市教學改革重點項目（C03-0825）；天津市農(nóng)業(yè)科技成果轉化與推廣項目（0801160）；國家大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃項目（201310060007）。