荷葉多酚提取優(yōu)化及其在黃酒中的應(yīng)用

許惠玲，蔡為榮，*，曹天亮，王偉霜

（1．安徽工程大學(xué)生物與化學(xué)工程學(xué)院，安徽蕪湖241000；2．安徽金沃農(nóng)業(yè)有限公司，安徽南陵242400）

荷葉多酚提取優(yōu)化及其在黃酒中的應(yīng)用

許惠玲1，蔡為榮1，*，曹天亮2，*，王偉霜1

（1．安徽工程大學(xué)生物與化學(xué)工程學(xué)院，安徽蕪湖241000；2．安徽金沃農(nóng)業(yè)有限公司，安徽南陵242400）

優(yōu)化了荷葉多酚提取工藝提高荷葉資源利用及其在黃酒中的應(yīng)用分析。在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，正交實(shí)驗(yàn)法對提取時(shí)間、液料比、乙醇濃度及提取溫度等提取條件進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果表明，優(yōu)化工藝為：乙醇濃度50%，提取時(shí)間50min，液料比60∶1mL/g、提取溫度50℃，荷葉多酚得率為9.01mg/g。利用荷葉多酚濃縮液配制荷葉黃酒，測得的理化指標(biāo)與口感評分通過SPSS軟件進(jìn)行主成分和逐步回歸分析，建立的回歸方程經(jīng)方差分析達(dá)到極顯著水平，故對荷葉黃酒的品質(zhì)預(yù)測是可行的。最終得出荷葉黃酒最佳配方為基酒與多酚比例為25∶5。

荷葉，多酚類化合物，提取，荷葉黃酒，主成分分析

醫(yī)學(xué)研究表明，植物多酚具有抗氧化、抑制高血壓［1］、抗腫瘤［2］、防齲齒、抑口臭［3］等作用。Ruf報(bào)道多酚物質(zhì)能抑制血小板的聚集和粘連，從而可以預(yù)防中風(fēng)、動(dòng)脈粥樣化作用［4］。荷蘭、日本等7國免疫學(xué)調(diào)查表明，多酚的平均攝入量低于19mg/d比攝入23mg/d，患心臟病的幾率高1/3［5］。源于自然、無毒、具有多種生物活性的植物多酚及制品越來越受到醫(yī)學(xué)、食品、日用化工等行業(yè)的青睞。

荷葉（Lotus leaf）系睡蓮科蓮屬（Nelumbo nucifea Gaertn）植物的葉片，1991年已被列入衛(wèi)生部“既是食品又是藥品”的名單之中。中國蓮起源于我國，分布于祖國大江南北，盛產(chǎn)于長江、黃河、珠江等三大流域，栽培或野生于池塘、水田中。資源豐富的荷葉大多自然腐爛掉，沒有得到有效地利用。文獻(xiàn)表明［4，6］，荷葉中含有鄰羥基苯甲酸、槲皮素、沒食子酸等，而對荷葉中植物多酚的提取報(bào)道極少。且目前對于黃酒品質(zhì)的研究主要集中在其風(fēng)味揮發(fā)性或半揮發(fā)性成分［7］及用現(xiàn)代檢測技術(shù)測定其理化指標(biāo)，很少有用主成分回歸分析來建立模型實(shí)現(xiàn)對黃酒品質(zhì)的評價(jià)。故本研究采用正交實(shí)驗(yàn)法優(yōu)化荷葉多酚的提取工藝，以期為荷葉資源的充分利用、減少能源和降低溶劑消耗等提供有益參考。并將提取出的荷葉多酚與基酒按比例混合調(diào)制成荷葉黃酒，對其口感進(jìn)行評價(jià)，對測定出的荷葉黃酒中的主要理化指標(biāo)與口感評分進(jìn)行主成分回歸分析，以實(shí)現(xiàn)在一定程度上可以基于口感評分的結(jié)果對荷葉黃酒的理化指標(biāo)進(jìn)行預(yù)測，從而為荷葉黃酒的配方和口感評估提供參考，以期用于以后的工廠化生產(chǎn)。主成分分析［8］就是利用數(shù)學(xué)上降維處理問題的思維方法，將所研究對象的若干指標(biāo)變量重新組合成一組新的、線性無關(guān)的幾個(gè)綜合指標(biāo)來代替原來的指標(biāo)變量；從而實(shí)現(xiàn)對所研究對象的簡化與綜合評價(jià)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

荷葉 采集于安徽省蕪湖市安徽工程大學(xué)水塘；黃酒基酒（大飯） 安徽金沃農(nóng)業(yè)有限公司；Folin-Ciocalteu試劑、沒食子酸 Sigma公司；無水乙醇、無水碳酸鈉等試劑 均為分析純。

DZF-1型真空干燥箱 上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠；LXJ-Ⅱ型離心機(jī) 上海醫(yī)用分析儀廠；SHB-ⅢA型循環(huán)水式多用真空泵 鄭州市上街華科儀器廠；RE-52型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海青浦滬西儀器廠；HH-2型數(shù)顯恒溫水浴鍋 國華電器有限公司；721型分光光度計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 荷葉多酚提取工藝流程

1.2.2 總酚含量的測定與得率計(jì)算 采用Folin-Ciocalteu比色法［9］。

在760nm波長下測定沒食子酸濃度（線性范圍：0.0005～0.005mg/m L）與吸光度的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為：

據(jù)此計(jì)算荷葉總酚（Total polyphenolics：TP）得率（以沒食子酸計(jì)）：

式中：C—沒食子酸濃度（mg/m L）；V—提取液的總體積（m L）；m—荷葉粉質(zhì)量（g）；β—提取液總酚稀釋因子。

1.2.3 荷葉多酚提取實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及優(yōu)化

1.2.3.1 單因素實(shí)驗(yàn) 稱取2g的荷葉干粉，以荷葉多酚得率為指標(biāo)，考察提取溫度、提取時(shí)間、液料比對多酚得率的影響。

a.乙醇濃度對荷葉多酚得率的影響：固定液料比為50m L/g，提取時(shí)間1h，提取溫度50℃，提取二次，乙醇濃度分別為20%、30%、40%、50%、60%、70%，然后按照多酚提取工藝進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。b.液料比對荷葉多酚得率的影響：固定提取時(shí)間1h，提取溫度50℃，提取二次，乙醇濃度為50%，液料比分別為30∶1、40∶1、50∶1、60∶1、70∶1、80∶1m L/g，然后按照多酚提取工藝進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。c.提取溫度對荷葉多酚得率的影響：固定提取時(shí)間1h，提取二次，乙醇濃度為50%，液料比為50m L/g，提取溫度分別為20、30、40、50、60、70℃，然后按照多酚提取工藝進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。d.提取時(shí)間對多酚得率的影響：固定液料比為50m L/g，提取二次，乙醇濃度為50%，提取溫度為40℃，提取時(shí)間分別為2、4、6、8、10、12h，然后按照多酚提取工藝進(jìn)行提取。

1.2.3.2 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇單因素實(shí)驗(yàn)中對響應(yīng)值（多酚得率）有較明顯影響的數(shù)據(jù)區(qū)間，選取乙醇濃度、料液比、提取溫度、提取時(shí)間4個(gè)因素，采用L9（34）正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)（因素水平設(shè)計(jì)見表1），以多酚得率作為指標(biāo)優(yōu)化提取條件。

表1 L9（34）正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的因素與水平Table 1 Factors and levels of L9（34）orthogonal test

1.2.4 荷葉多酚黃酒的調(diào)配與理化指標(biāo)的測定 用淋飯酒不同后發(fā)酵期的基酒與提取的荷葉多酚濃縮液（其濃度為4.707mg/m L）按照50∶2、25∶2、50∶3、25∶3、50∶4、25∶4、50∶5、25∶5、50∶6、25∶6 10種比例混合得到酒樣經(jīng)發(fā)酵15d，測定這10種混合酒液的總酸、氨基酸態(tài)氮、多酚、總糖、酒精度的含量。

1.2.5 荷葉黃酒的評分 根據(jù)黃酒GB/T 13662-2008、QB/T 2746-2005清爽型黃酒評分標(biāo)準(zhǔn)，由8位具有一定資歷的高級品酒師對釀造的荷葉黃酒進(jìn)行口感品質(zhì)評分，求得其平均值后即為最終的口感評分。其口感評分表［10］如表2所示。

表2 品酒的評分標(biāo)準(zhǔn)Table 2 The grading standard of tasting wine

1.3 數(shù)據(jù)處理方法

對測得的荷葉黃酒的固形物含量（總酸、氨基酸態(tài)氮、多酚、總糖、酒精度的含量）和口感評分采用SPSS version 21統(tǒng)計(jì)軟件，用主成分分析和逐步回歸分析作為統(tǒng)計(jì)方法，用雙尾檢測，當(dāng)顯著水平為0.05表示為顯著，為0.01時(shí)為極顯著。回歸方程的相關(guān)系數(shù)r2≥0.8，視為高度相關(guān)；0.5≤r2＜0.8，視為中度相關(guān)；0.3＜r2＜0.5，視為弱相關(guān)［11］。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)及分析

2.1.1 乙醇濃度對荷葉多酚得率的影響 多酚化合物的提取通常有溶劑法、絡(luò)合沉淀、層析法［12］。本實(shí)驗(yàn)采用溶劑法提取荷葉多酚。從圖1中可以看出，乙醇濃度對荷葉多酚得率影響的大致規(guī)律，隨著乙醇濃度的升高，多酚的提取率先呈上升的趨勢，當(dāng)乙醇濃度達(dá)到50%時(shí)荷葉多酚提取率達(dá)到最大值，之后隨著濃度的增加，提取率反而降低。這是因?yàn)楹扇~多酚中大部分都屬于類黃酮化合物及其衍生物，其溶解度隨著結(jié)構(gòu)的改變而改變。其中有一部分是水溶性的，如果水分含量少會導(dǎo)致荷葉多酚不能充分溶解［13］。因此初步確定50%乙醇濃度為提取多酚的最佳提取劑濃度。

圖1 提取溶劑對多酚得率的影響Fig.1 Effects of differentextraction solvents on TP yield

2.1.2 液料比對荷葉多酚得率的影響 從圖2中可以看出，當(dāng)液料比達(dá)50∶1（m L/g）時(shí)，多酚提取得率達(dá)到8.55mg/g，繼續(xù)增加提取溶劑用量，多酚提取得率沒有顯著提高。這是因?yàn)橐毫媳容^小時(shí)，荷葉粉溶解不充分；隨著液料比例的增加，荷葉粉在溶劑內(nèi)擴(kuò)散越快，多酚得率提高［14］；當(dāng)提取溶劑的量過大時(shí)，多酚得率增加緩慢最終趨于穩(wěn)定，原因可能是提取溶劑達(dá)到一定量時(shí)多酚幾乎溶解完全［15］。因此初步確定最佳液料比為50∶1m L/g。

圖2 液料比對多酚得率的影響Fig.2 Ratio of liquid to solid on TP yield

2.1.3 提取溫度對荷葉多酚得率的影響 從圖3中可以看出，在20～40℃多酚得率的升高幅度較為明顯，這是由于隨著溫度的升高，分子運(yùn)動(dòng)加速，氫鍵更易斷裂，多酚的滲透、溶解、擴(kuò)散速度也加快，因而酚類物質(zhì)更易于從原料中溶出，而在溫度為40～70℃時(shí)，多酚得率隨著溫度的升高而下降，這是因?yàn)楦邷叵露喾宇愇镔|(zhì)易于發(fā)生氧化或降解反應(yīng)從而可能會破壞多酚的結(jié)構(gòu)，綜合考慮溫度對多酚穩(wěn)定性及得率的影響，因此初步確定40℃為最佳提取溫度。

圖3 提取溫度對多酚得率的影響Fig.3 Effects of extraction temperature on TP yield

2.1.4 提取時(shí)間對荷葉多酚得率的影響 從圖4中可以看出提取得率隨提取時(shí)間延長而增加，在1h時(shí)得率基本上達(dá)到最大值，之后開始下降。這可能與縮合單寧（condensed tannins）進(jìn)一步縮合、溶出蛋白質(zhì)更多及金屬鹽離子發(fā)生了絡(luò)合等化學(xué)反應(yīng)有關(guān)，使測定值下降［16-18］。

圖4 提取時(shí)間對多酚得率的影響Fig.4 Effects of extraction time on TP yield

表3 荷葉多酚提取正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 3 Orthogonal experimental design and results for extraction TP from lotus leaf

2.2 荷葉多酚提取工藝優(yōu)化

由單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，提取溫度、提取時(shí)間、液料比和乙醇濃度對荷葉多酚得率影響較大。由此可以采用4因素3水平的正交實(shí)驗(yàn)表進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)。結(jié)果如表3所示。

表4 不同配方酒樣的各指標(biāo)含量和評分Table 4 Various indexes contents and ratings of different formula ofwine samples

從表3的正交結(jié)果可以得出，影響荷葉多酚提取的因素大小順序?yàn)锳＞D＞B＞C。即乙醇濃度對荷葉多酚提取得率的影響最大，溫度對荷葉多酚提取得率的影響最小。從直觀分析中可以看出最佳組合為A2B3C3D1。即乙醇濃度為50%，液料比為60∶1，提取溫度為50℃，提取時(shí)間為50m in時(shí)，荷葉多酚的提取得率最高。

按表3所得出的最佳組合條件提取荷葉多酚。通過驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)得出在最佳條件下多酚得率最高為9.01mg/g，且高于正交實(shí)驗(yàn)表中其他組合的多酚得率。

2.3 荷葉多酚黃酒的固形物含量與感官評定

總酸、氨基酸態(tài)氮、多酚、總糖、酒精度含量的測定結(jié)果見表4，國標(biāo)規(guī)定半干黃酒的酒精度（20℃）（% vol）≥8.0，總酸（g/L）在2.5～7，氨基酸態(tài)氮（g/L）≥0.25，故所有樣品均符合國家標(biāo)準(zhǔn)?？偺牵╣/L）在15.1～40，酒樣中基酒與多酚比例為25∶3、50∶5這兩配方酒樣的總糖含量低于國家標(biāo)準(zhǔn)。同時(shí)從表中也可以看出十種配方的酒樣其多酚含量都高于基酒的多酚含量。據(jù)文獻(xiàn)［19］報(bào)道，紅葡萄酒中含有大量多酚化合物，例如黃酮類、花青素、酚酸以及聚合物單寧。大多數(shù)這些化合物是紅酒品質(zhì)中最基本的成分，因?yàn)樗鼈儧Q定著酒的顏色、苦味、澀味、風(fēng)味和抗氧化能力。而且適當(dāng)?shù)財(cái)z入多酚可以防止糖尿病和某些癌癥。然而不同的葡萄酒中多酚的含量變化也很大，可能是由于不同的釀酒工藝造成的［20］，由此可見，在黃酒中添加荷葉多酚既可以達(dá)到保健的效果又可以改善黃酒的口感。

2.4 多酚等固形物對黃酒品質(zhì)的貢獻(xiàn)

表5 2個(gè)主成分的特征值和貢獻(xiàn)率Table 5 Eigenvalues of 2 principal components and their contribution and cumulative contribution

將所得到的固形物含量與口感評分通過SPSS version 21統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行主成分分析得到的結(jié)果如表5所示。

對測得的荷葉黃酒的理化指標(biāo)與口感評分進(jìn)行主成分分析，從表5中可以看出，前2個(gè)主成分的累積貢獻(xiàn)率達(dá)80.199%，即表示前2個(gè)主成分已經(jīng)包含原始數(shù)據(jù)80.199%的信息。且各配方黃酒的品質(zhì)評價(jià)可由2個(gè)主成分表示，表達(dá)為原5個(gè)指標(biāo)的加權(quán)組合，其線性組合如下式：

其中變量1～5分別為酒精含量、總酸、多酚含量、總糖、氨基酸氮。從以上模型可以看出，酒精含量、多酚、氨基酸態(tài)氮在第一主成分中起主要作用，第一主成分對總方差的貢獻(xiàn)率為45.304%，總酸、總糖對第二主成分的影響顯著，第二主成分對總方差的貢獻(xiàn)率為34.894%。

由此可得回歸方程為：Y=-2.705+0.696Z1-0.599Z2式（3）

由表6、表7可以看出，回歸方程的方差分析達(dá)到極顯著水平，表明回歸方程的建立是有意義的。而入選的兩個(gè)主成分對荷葉黃酒品質(zhì)的決定回歸系數(shù)達(dá)到R2=0.804屬于高擬合度方程，說明建立的模型中所包含的2個(gè)變量因素能夠解釋建立模型80.4%的因變量變化，故擬合的方程在評價(jià)荷葉黃酒的品質(zhì)中具有較好的參考價(jià)值。

表8是回歸方程系數(shù)的顯著性檢驗(yàn)結(jié)果，回歸方程入選的主成分Z1、Z2都達(dá)到了極顯著水平。建立的回歸方程為式（3），該方程校正后的回歸系數(shù)達(dá)到R2=0.804，經(jīng)回歸方程的顯著性檢驗(yàn)F=21.571＞F0.01（p=0.001），因此該方程的建立是可靠的。故用荷葉黃酒的理化指標(biāo)：總酸、氨基酸態(tài)氮、多酚、總糖、酒精度含量數(shù)據(jù)的第一主成分和第二主成分對荷葉黃酒品質(zhì)進(jìn)行預(yù)測是可行的。且由數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化處理后得到荷葉黃酒的口感評分并結(jié)合黃酒的國標(biāo)得出其最佳配方為基酒與多酚比例為25∶5。

表6 回歸方程的模型Table 6 Model summary of the regression equation

表7 線性回歸方程的方差分析Table 7 Analysis of variance of linear regression equation

表8 回歸方程系數(shù)的顯著性檢驗(yàn)Table 8 Significant test of the regression equation coefficients

3 結(jié)論

3.1 用正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化荷葉多酚提取工藝，得最佳條件：乙醇濃度為50%，液料比為60∶1m L/g，提取溫度為50℃，提取時(shí)間為50min時(shí)，荷葉多酚的提取得率最高為9.01mg/g。

3.2 對10種配方的荷葉黃酒的口感評分與理化指標(biāo)的相關(guān)分析，并對這兩者進(jìn)行主成分回歸分析，結(jié)果表明：酒精含量、多酚、氨基酸態(tài)氮在第一主成分中起主要作用，第一主成分對總方差的貢獻(xiàn)率為45.304%，總酸、總糖對第二主成分的影響顯著，第二主成分對總方差的貢獻(xiàn)率為34.894%。

3.3 對荷葉黃酒的口感評分與入選的主成分建立回歸方程，表明總酸、氨基酸態(tài)氮、多酚、總糖、酒精度的含量數(shù)據(jù)的第一主成分和第二主成分對荷葉黃酒品質(zhì)進(jìn)行預(yù)測是可行的。在一定程度上可以基于口感評分結(jié)果對荷葉黃酒的理化指標(biāo)進(jìn)行預(yù)測，從而為荷葉黃酒的配方和口感評估提供參考。

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Lotus leaf polyphenol extraction and application in rice wine

XU Hui-ling1，CAIW ei-rong1，*，CAO Tian-liang2，*，WANG W ei-shuang1
（1.College of Biological and Chemical Engineering，Anhui Polytechnic University，Wuhu 241000，China；2.Anhui Jinwo Agriculture Co.，Ltd.，Nanling 242400，China）

Optimization of extraction of polyphenols from lotus leaf to improve resource utilization and its applicationin rice wine. On the basis of single factor test，using the orthogonal test method on extraction time，solid-liquidratio ，extraction temperature and ethanol concentration extraction conditions were optimized. The resultsshowed that optimization of process was:the concentration of ethanol 50％ ，extraction time 50min，60 ∶1mL/gliquid material ratio，extraction temperature 50℃，lotus leaf polyphenol yield of 9.01mg/g. Lotus leaf polyphenolconcentrate was employed to prepare lotus leaf rice wine. The physicochemical indexes and taste rating ofdifferent formulations of lotus leaf rice wine was used to carry out the principal component analysis andstepwise regression analysis of SPSS software. The regression equation reached extremely significant level byanalysis of variance. It was feasible to predict the quality of lotus leaf rice wine. Finally，the optimum formulationof lotus leaf rice wine was that the ratio of base wine and polyphenols was 25∶5.

lotus leaf；polyphenols；extraction；lotus leaf rice wine；principal component analysis

TS262.4

B

1002-0306（2015）08-0277-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.08.049

2014－07－15

許惠玲（1990-），女，在讀碩士研究生，研究方向：農(nóng)產(chǎn)品深加工技術(shù)工程。

*通訊作者：蔡為榮（1963-），男，博士，教授，研究方向：天然產(chǎn)物功能因子。曹天亮（1970-），男，高級釀酒師，國家一級品酒師，研究方向：生物發(fā)酵、黃酒。

蕪湖市科技局專利產(chǎn)業(yè)化專項(xiàng)（2013119）；安徽省大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練項(xiàng)目（201210363018）。