TritonX-100-硫酸銨雙水相體系分離地榆根總黃酮

李學(xué)娟，張挺峰

（1.甘肅省中醫(yī)院，甘肅蘭州730050；2.河西學(xué)院農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院，甘肅張掖734000）

TritonX-100-硫酸銨雙水相體系分離地榆根總黃酮

李學(xué)娟1，張挺峰2，*

（1.甘肅省中醫(yī)院，甘肅蘭州730050；2.河西學(xué)院農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院，甘肅張掖734000）

目的：研究利用雙水相體系萃取地榆根總黃酮提取的最佳工藝條件。方法：探討了TritonX-100質(zhì)量分?jǐn)?shù)，硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)，黃酮粗提液質(zhì)量分?jǐn)?shù)、NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)和pH等因素對總黃酮萃取率的影響，并采用Box-Benhnken實驗確定了最佳實驗條件。結(jié)果：雙水相萃取黃酮最佳條件為，確定雙水相體系組成15%TritonX-100/15%硫酸銨，黃酮粗提液質(zhì)量分?jǐn)?shù)12%、NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%、pH6，地榆根總黃酮前萃取率達到80.02%；反萃取的最佳條件：取1.5mL黃酮萃取上相和2mL乙酸丁酯混合，反萃取率為80.03%。結(jié)論：采用雙水相萃取地榆根總黃酮簡單、易行，生產(chǎn)成本低，在中藥提取中具有良好應(yīng)用前景。

地榆根，總黃酮，雙水相，反萃取

地榆（Sanguisorba officinalis L.）是薔薇科（Rosaceae）地榆屬植物，在我國主要分布在東北、華北、西北及廣西等地。地榆是一種常用中藥，其根具有涼血止血，解毒斂瘡之功效，用于治療吐血、血痢、金瘡及燒傷等癥，為苦寒涼血之常用藥［1］。地榆根中含鞣質(zhì)、皂苷和黃酮類化合物［2-3］。其中黃酮類化合物含量豐富，具有抗氧化、抗腫瘤、抗菌、抗炎消腫等作用［4］。

地榆黃酮提取方法主要有機溶劑提取［5］、超聲輔助提取法［6］和加壓提取法［7］。這些提取方法存在提取效率較低或設(shè)備要求高、能耗高、成本高缺點。雙水相萃取作為一項新的分離技術(shù)因其操作簡單，條件溫和，處理量大，易于連續(xù)操作而日益受到重視。在生物物質(zhì)分離過程中得到應(yīng)用的雙水相系統(tǒng)有3類：聚合物-聚合物雙水相系統(tǒng)、聚合物-無機鹽雙水相系統(tǒng)和表面活性劑-無機鹽雙水相系統(tǒng)。表面活性劑雙水相系統(tǒng)與聚合物雙水相系統(tǒng)相比，體系中由表面活性劑形成的膠束為生物分子提供了獨立的封閉空間，減小了生物分子聚集沉淀變性的概率［8］。TritonX-100是含聚氧乙烯型功能基團的非離子表面活性劑，相對溫和，適宜于天然產(chǎn)物分離。采用TritonX-100-硫酸銨雙水相體系提取地榆總黃酮的方法尚未見報道。

本實驗建立了TritonX-100-硫酸銨雙水相萃取體系，通過單因素實驗和Box-Behnken的組合實驗，得到了地榆根總黃酮最佳萃取條件；用乙酸丁酯進行反萃取實驗，以期為植物中黃酮的分離純化與開發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

地榆 購買于張掖市歐式街德生堂；TritonX-100 平均聚合度9.5，購自Sigma公司；亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、無水乙醇 均為分析純。

PL-203型電子天平 梅特勒-托利多儀器有限公司；XO-SM5O型超聲波-微波反應(yīng)系統(tǒng) 南京先歐儀器制造有限公司；DKB-501型數(shù)顯超級恒溫水浴鍋 揚州市三發(fā)電子有限公司；DHG-9101.1型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱、722型分光光度計 上海光譜儀器有限公司；FZ102型植物試樣粉碎機 河北黃驊新興電器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 地榆粗提液的制備 用電子天平準(zhǔn)確稱取6.0g已粉碎的地榆根粉末，按照1∶10料液比加入50%的乙醇，在325W，超聲10m in，將地榆根細胞進行破碎，破碎后的地榆根細胞懸濁液再抽濾2次，即可得到含地榆總黃酮的粗提液，計算粗提液中地榆總黃酮的含量。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 采用NaNO2-A（ lNO3）3比色法［9］測定黃酮含量，在510nm處測吸光值，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：y=1.227x-0.0036（R2=0.990），其中，y為510nm處測吸光值，x為黃酮含量（mg）。

1.2.3 雙水相萃取方法 固定體系總質(zhì)量為10.00g，加入適量的TritonX-100和（NH4）2SO4，充分振蕩使成相物質(zhì)溶解，同時完成了地榆根總黃酮在雙水相系統(tǒng)中的分配過程，在一定條件下萃取。此雙水相系統(tǒng)靜置一定時間，當(dāng)兩相達到相分離，地榆根總黃酮富集于雙水相系統(tǒng)的上相中，分別測定相比R和地榆根總黃酮的含量，并計算其分配系數(shù)K及萃取率Y，如下式。

R=上相體積（V）t/下相體積（Vb）

K=上相總黃酮濃度（C）t/下相總黃酮濃度（Cb）

1.2.4 TritonX-100-硫酸銨雙水相體系的確定

1.2.4.1 硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)對雙水相體系的影響 在TritonX-100-（NH4）2SO4雙水相體系中，TritonX-100質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%不變，分別選取10%、12.5%、15%、17.5%、20%（NH4）2SO4組成雙水相，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%黃酮粗提液，在室溫（25℃）條件混合均勻，靜止分相后對上下相溶液進行分析，考察硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)對雙水相體系的影響。

1.2.4.2 TritonX-100質(zhì)量分?jǐn)?shù)對雙水相體系的影響

在TritonX-100-（NH）42SO4雙水相體系中，（NH）42SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)15%不變，分別選取10%、12.5%、15%、17.5%、 20%TritonX-100組成雙水相，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%黃酮粗提液，在室溫（25℃）條件混合均勻，靜止分相后對上下相溶液進行分析，考察TritonX-100質(zhì)量分?jǐn)?shù)對雙水相體系的影響。

1.2.5 影響地榆根總黃酮萃取的因素

1.2.5.1 黃酮粗提液質(zhì)量分?jǐn)?shù)對雙水相體系的影響在15%TritonX-100-15%（NH4）2SO4組成的雙水相體系中，分別選取粗提液質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8%、10%、12%、14%、16%，在室溫（25℃）條件混合均勻，靜止分相后對上下相溶液進行分析，考察粗提液質(zhì)量分?jǐn)?shù)對雙水相體系的影響。

1.2.5.2 NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)對雙水相體系的影響 在15% TritonX-100和15%（NH4）2SO4組成的雙水相體系中，粗提液質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12%不變，分別選取NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0%、0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%，在室溫（25℃）條件下，對上下相溶液進行分析，考察NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)對雙水相體系的影響。

1.2.5.3 體系pH對雙水相體系的影響 在15% TritonX-100-15%（NH4）2SO4組成的雙水相體系中，粗提液的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12%，NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%，在室溫（25℃）條件下，HCl和NaOH調(diào)節(jié)雙水相體系pH分別為5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，對上下相溶液進行分析。

1.2.6 Box-Behnken實驗設(shè)計 根據(jù)單因素實驗結(jié)果，設(shè)計黃酮粗提液質(zhì)量分?jǐn)?shù)、NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)、pH 3因素3水平的17組實驗，確定雙水相體系萃取地榆根總黃酮的最佳萃取條件，見表1。

表1 Box-Behnken設(shè)計因素水平表Table 1 Factors and levels of Box-Behnken Design

1.2.7 反萃取實驗

1.2.7.1 上相溶液體積對地榆根總黃酮反萃取效果的影響 取3m L乙酸丁酯加入10m L的刻度試管中，分別加入1、1.5、2、2.5、3m L前萃取上相溶液，在室溫（25℃）條件下，對上下相溶液進行分析。

1.2.7.2 乙酸丁酯對地榆根總黃酮反萃取效果的影響 取1.5m L的上相溶液加入10m L的刻度試管中，分別加入1、1.5、2、2.5、3m L乙酸丁酯，在室溫（25℃）條件下，對上下相溶液進行分析。

1.2.8 數(shù)據(jù)整理和分析 所有實驗均重復(fù)3次，采用Excel 2003和Design-Expert 7.0軟件進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗結(jié)果

2.1.1（NH4）2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)對地榆根總黃酮分配行為的影響 由圖1可知，當(dāng)（NH4）2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)達到15%時，總黃酮萃取率和分配系數(shù)都達到最大，此后，隨著（NH4）2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)的不斷增加，總黃酮萃取率和分配系數(shù)都顯著下降。這是因為（NH4）2SO4用量不同，上下相電位差不同，影響分配系數(shù)和萃取率。另外，（NH4）2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)過大影響黃酮表面疏水性，且擾亂雙水相體系，改變各項中成相物質(zhì)的組成。因此，（NH4）2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)最佳選擇15%。

圖1 硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)對地榆根總黃酮分配行為的影響Fig.1 Effect of ammonium sulfate concentration on Sanguisorba officinalis L.root total flavonoids distribution behavior

2.1.2 TritonX-100質(zhì)量分?jǐn)?shù)對地榆根總黃酮分配行為的影響 由圖2可知，隨著TritonX-100質(zhì)量分?jǐn)?shù)的不斷增加，萃取率和分配系數(shù)先是不斷上升，當(dāng)TritonX-100質(zhì)量分?jǐn)?shù)達到15%時，總黃酮萃取率和分配系數(shù)都達到最大，此后，隨著TritonX-100質(zhì)量分?jǐn)?shù)的不斷增加，總黃酮萃取率和分配系數(shù)都顯著下降，萃取率和分配系數(shù)的變化基本是同步的。其原因可能是由于表面活性劑具有兩親基團，其膠束具有自組裝的特性，膠束的形狀和大小可通過改變雙水相體系組成條件進行調(diào)節(jié)［10］，表面活性劑能起增溶作用，增加地榆根黃酮在上相中溶解性。但是，當(dāng)TritonX-100質(zhì)量分?jǐn)?shù)過大時，地榆中其他成分溶出量也會增加，影響黃酮萃取效果。因此，選擇TritonX-100的最佳質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15%。

圖2 TritonX-100質(zhì)量分?jǐn)?shù)對地榆根總黃酮分配行為的影響Fig.2 Effect of TritonX-100mass concentration on Sanguisorba officinalis L.root total flavonoids distribution behavior

2.1.3 粗提液質(zhì)量分?jǐn)?shù)對地榆根總黃酮分配行為的影響 由圖3可知，當(dāng)粗提液質(zhì)量分?jǐn)?shù)在12%時，地榆根總黃酮的萃取率和分配系數(shù)達到最大。主要原因是隨著粗提液質(zhì)量分?jǐn)?shù)逐漸增加，粗提液中鞣質(zhì)和蛋白質(zhì)也被萃取到雙水相體系上相，阻礙了粗提液中黃酮的萃取?？梢?，粗提液的質(zhì)量分?jǐn)?shù)影響上下相的分配，當(dāng)粗提液的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12%時，地榆根總黃酮的萃取率和分配系數(shù)達到最大。因此，確定粗提液的最佳質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12%。

圖3 粗提液質(zhì)量分?jǐn)?shù)對地榆根總黃酮分配行為的影響Fig.3 Effect of crude extracts concentration on Sanguisorba officinalis L.root total flavonoids distribution behavior

2.1.4 pH對地榆根總黃酮分配行為的影響 如圖4所示，當(dāng)pH＜6時，隨著pH增大分配系數(shù)和萃取率逐漸增大；pH為6時分配系數(shù)和萃取率達最大；當(dāng)pH＞6時，分配系數(shù)和萃取率隨pH的增大而減小。這是因為黃酮的酚羥基在水溶液中能電離出氫離子，在不同pH的水溶液中，以分子形式存在的黃酮和以離子形式存在的黃酮比例不同。當(dāng)體系pH為6時，萃取過程中黃酮以分子形式被萃入雙水相體系上相，因此，當(dāng)pH為6時，地榆根總黃酮的萃取率和分配行為最佳。

圖4 pH對地榆根總黃酮分配行為的影響Fig.4 Effect of pH on Sanguisorba officinalis L.root total flavonoids distribution behavior

2.1.5 NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)對地榆根總黃酮分配行為的影響 由圖5可知，隨著NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，地榆根總黃酮的萃取率和分配系數(shù)也隨著增大，當(dāng)NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%左右時，地榆根總黃酮的萃取率達到最大值，再繼續(xù)增加NaCl的量，地榆根總黃酮的萃取率和分配系數(shù)開始下降。其原因是無機鹽的加入可以改變兩相間的電位差和相比，縮短了分相時間，提高了相分離速度，從而增加了總黃酮在上相的分配，但鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加到一定程度后，萃取相的極性增強，使總黃酮的溶解度下降導(dǎo)致出現(xiàn)鹽析現(xiàn)象，使分配系數(shù)降低。因此，確定NaCl的最佳質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%。

2.2 響應(yīng)面結(jié)果分析

通過以上單因素實驗結(jié)果分析，在確定雙水相體系組成的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面方法進一步優(yōu)化實驗條件。根據(jù)Box-Behnken的中心組合設(shè)計原理，以萃取率為響應(yīng)值，在TritonX-100-（NH4）2SO4雙水相體系中，對粗提液質(zhì)量分?jǐn)?shù)（A）、NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)（B）、pH（C）設(shè)計了3因素3水平的17組實驗，其中有5組中心點重復(fù)實驗，實驗方案和結(jié)果見表2。

圖5 NaCl對地榆根總黃酮分配行為的影響Fig.5 Effect of NaCl concentration on Sanguisorba officinalis L. root total flavonoids distribution behavior

表2 Box-Behnken設(shè)計方案與結(jié)果Table 2 Arrangementand results of Box-Behnken Design

2.2.1 Box-Benhnken Design實驗數(shù)據(jù)分析 以地榆根總黃酮萃取率Y為響應(yīng)值，根據(jù)表2的實驗結(jié)果，用Design-Expert 7.0軟件進行多元回歸分析，具體結(jié)果見表3。經(jīng)回歸擬合后，實驗因子對響應(yīng)值的影響可用以下回歸方程表示：

由表3可以看出，本模型擬合程度明顯，其F= 146.5681，p＜0.0001，說明該模型極顯著；失擬項不顯著，其失擬檢驗的F值為6.513554，存在5.1%的概率失擬，失擬項在α=0.05水平上不顯著（p=0.0510＞0.05），模型的R2為0.994721，說明該模型的可信度很高，表中p＜0.01，對應(yīng)項為模型影響極顯著項，因此該模型中A、AB、AC、BC、A2、B2、C2極顯著。在所選取的各因素水平范圍內(nèi)，按照對結(jié)果的影響排序：粗提液質(zhì)量分?jǐn)?shù)（A）＞pH（C）＞NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)（B）。

表3 Box-Behnken實驗結(jié)果的回歸分析Table 3 The regression analysis of Box-Behnken experiment results

2.2.2 響應(yīng)面優(yōu)化及模型驗證實驗 響應(yīng)面圖形是本實驗中的響應(yīng)值對各個實驗因子：粗提液質(zhì)量分?jǐn)?shù)、NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)、pH構(gòu)成的響應(yīng)面圖，結(jié)果如圖6所示，AB、AC、BC對地榆根總黃酮萃取率極顯著。當(dāng)pH固定不變，一定范圍內(nèi)，總黃酮萃取率隨著粗提液質(zhì)量分?jǐn)?shù)和NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加而增大，兩者交互作用極顯著。當(dāng)NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)固定不變，一定范圍內(nèi)，隨著粗提液質(zhì)量分?jǐn)?shù)和pH增加，地榆根總黃酮萃取率逐漸增大到最大值然后下降。當(dāng)粗提液質(zhì)量分?jǐn)?shù)固定不變，一定范圍內(nèi)，隨著NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)和pH增加，地榆根總黃酮萃取率逐漸增大到最大值然后下降。

根據(jù)Box-Behnken實驗所得的結(jié)果和二次多項回歸方程，利用Design-Expert 7.0軟件獲得了各個因素的最佳條件組合：粗提液質(zhì)量分?jǐn)?shù)12.18%、NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.495%、pH6.05，萃取率為80.8008%。根據(jù)實驗操作實際條件，對最佳條件修正為：粗提液質(zhì)量分?jǐn)?shù)12%、NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%、pH 6，在此萃取條件下，進行3次重復(fù)實驗，地榆根總黃酮的平均萃取率可達80.02%?？梢?，采用響應(yīng)面分析法對地榆根總黃酮最佳萃取條件的優(yōu)化是行之有效的。

2.3 反萃取實驗

在前萃取基礎(chǔ)上，對地榆根總黃酮進行反萃取。探討上相溶液、乙酸丁酯加入體積對地榆根總黃酮反萃取效果的影響。

2.3.1 上相溶液體積對地榆根總黃酮反萃取效果的影響 由圖7可知，隨著上相溶液體積的增加，反萃取率和分配系數(shù)先上升，當(dāng)上相溶液體積達到1.5m L時，總黃酮反萃取率和分配系數(shù)都達到最大，此后，隨著上相溶液體積的不斷增加，總黃酮分配系數(shù)和反萃取率趨于穩(wěn)定。因此，選擇上相溶液體積1.5m L時為最佳。

圖6 各因素交互作用的響應(yīng)面圖Fig.6 Response surface plots for the pairwise interactive effects

圖7 上相加入量對地榆根總黃酮分配行為的影響Fig.7 Effect of upper phase addition amounton Sanguisorba officinalis L.root total flavonoids distribution

2.3.2 乙酸丁酯對地榆根總黃酮分配行為的影響 由圖8可知，隨著乙酸丁酯量的不斷增加，反萃取率和分配系數(shù)先是不斷上升，當(dāng)乙酸丁酯達到2m L時，總黃酮反萃取率和分配系數(shù)都達到最大，此后，隨著乙酸丁酯量的不斷增加，總黃酮反萃取率和分配系數(shù)都顯著下降。因此，選擇乙酸丁酯2m L時為最佳。

圖8 乙酸丁酯對地榆根總黃酮分配行為的影響Fig.8 Effect of butyl acetate on Sanguisorba officinalis L.root total flavonoids distribution

2.3.3 最佳反萃取驗證實驗 依次加取1.5m L上相溶液，2m L乙酸丁酯入10m L的刻度試管中，在室溫（25℃）條件下，對上下相溶液進行分析，得到地榆根總黃酮反萃取率為80.03%。

3 結(jié)論

TritonX-100-（NH4）2SO4雙水相中TritonX-100質(zhì)量分?jǐn)?shù)、（NH4）2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)、粗提液質(zhì)量分?jǐn)?shù)、pH、NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)等因素都對雙水相體系的萃取率和分配系數(shù)有一定的影響，并且確定了雙水相體系組成為15%TritonX-100和15%（NH4）2SO4；得到了地榆根總黃酮的最佳萃取條件：粗提液質(zhì)量分?jǐn)?shù)12%、NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%、pH 6，萃取率達到80.02%；反萃取的最佳條件：將1.5m L黃酮上相和2m L乙酸丁酯進行反萃取，反萃取率為80.03%。因此，本實驗說明采用TritonX-100-（NH4）2SO4雙水相體系分離純化地榆根總黃酮是可行的。

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Optimization of TritonX-100-（NH4）2SO4aqueous two-phase extraction of total flavonoids from Sanguisorba officinalis L.root

LIXue-juan1，ZHANG Ting-feng2，*
（1.Gansu Provincial Hospital of TCM，Lanzhou 730050，China；2.The College of Agriculture and Biotechnology（CAB），Hexi University，Zhangye 734000，China）

Objective:To study the extracting process of total flavonoids in the roots of Sanguisorba officinalis L.by using aqueous two-phase system. Methods:The effects of TritonX-100 concentration，ammonium sulfateconcentration，crude extract concentration，NaCl concentration and pH value on the extraction efficiency of totalflavonoids were explored by one-factor-at-a-time and Box-Benhnken design methods. Results:The optimalaqueous two-phase extraction conditions were 15％ TritonX-100，15％ ammonium sulfate，crude extract massconcentration 12％，NaCl concentration 0.5％ and pH6. The forward extraction yields of total flavonoids reached80.02％. The optimal condition of backward extraction were as follows:butyl acetate 2mL，the upper phase1.5mL. The efficiency of backward extraction was 80.03％. Conclusion:This method was not only simple but alsolow-cost. Therefore it would have a well application perspective.

Sanguisorba officinalis root；total flavonoids；aqueous two-phase；back extraction

TS201.1

B

1002-0306（2015）08-0268-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.08.047

2014－04－10

李學(xué)娟（1979-），女，本科，藥師，主要從事藥物化學(xué)成分方面的研究。

*通訊作者：張挺峰（1979-），男，碩士，講師，主要從事高山植物生物學(xué)方面的研究。