星點設(shè)計-效應(yīng)面法優(yōu)化肺衣抗氧化物質(zhì)的超聲輔助提取工藝

劉滿紅，劉曉芳，戴建輝，高云濤，王海龍

（1.云南民族大學(xué)化學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院，云南省聚乳酸基功能材料工程實驗室，云南昆明650500；2.云南民族大學(xué)，民族藥資源化學(xué)國家民委－教育部重點實驗室，云南昆明650500）

星點設(shè)計-效應(yīng)面法優(yōu)化肺衣抗氧化物質(zhì)的超聲輔助提取工藝

劉滿紅1，2，劉曉芳1，2，戴建輝1，2，高云濤1，2，王海龍1，2

（1.云南民族大學(xué)化學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院，云南省聚乳酸基功能材料工程實驗室，云南昆明650500；2.云南民族大學(xué)，民族藥資源化學(xué)國家民委－教育部重點實驗室，云南昆明650500）

利用超聲波輔助提取法從肺衣中提取抗氧化物質(zhì)，用星點設(shè)計-響應(yīng)面法對提取工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，采用DPPH自由基法檢測提取物的清除自由基能力，基于單因素實驗，以乙醇濃度、液固比、提取時間，做三因素五水平響應(yīng)面優(yōu)化，最佳工藝為：乙醇濃度為85.0%，液固比為18.6mL/g時，超聲提取時間為20.0min，在此條件下對DPPH自由基清除率為91.69%，預(yù)測值為92.829%，與預(yù)測值偏差為-1.227%。星點設(shè)計-響應(yīng)面法優(yōu)化法是一種較好的實驗設(shè)計方法。

肺衣，抗氧化活性，DPPH自由基，超聲提取，響應(yīng)面分析法

地衣（lichens）是植物界一個特殊類群，是真菌（fungi）和藻類（algae）高度結(jié)合的共生復(fù)合體，全世界約有地衣植物500余屬，26000多種。它們分布極為廣泛，從南北兩極到赤道，從高山到平原，從森林到荒漠均有地衣植物的存在。地衣含有松蘿酸、珠光酸、苔色酸等多種獨特的次生代謝產(chǎn)物，具有多方面的生物活性［1］。近幾年的文獻(xiàn)報道從地衣植物中分離得到了許多具有活性的新化合物或新天然產(chǎn)物，而國內(nèi)對地衣化學(xué)成分方面的研究已有一些報道［2-3］。而我國有豐富的地衣植物資源，尤其是在我國的西南地區(qū)，地衣植物在民間可以做藥用和食用，云南肺衣（俗名青蛙皮）為地衣的一種，被大理白族視為純天然山珍食品。

大量的科學(xué)實驗證實，氧自由基與機體損傷有著非常密切的關(guān)系［4-5］，抗病性抗氧化能力與其抗逆性及延緩衰老密切相關(guān)。目前國內(nèi)有對肺衣提取多酚［1-3］，國內(nèi)外還未見到用蒼山肺衣提取活性物質(zhì)及抗氧化研究報道。本文將超聲法與效應(yīng)面分析法耦合提取植物中活性物質(zhì)，并對抗氧化活性進(jìn)行評價。超聲波作為彈性介質(zhì)中的一種機械波，具有操作簡便快捷、能耗低、不破壞有效成分、提取效率高的特點［6］。本研究采用星點實驗設(shè)計（central composite design，CCD），結(jié)合響應(yīng)面分析法（RSM）［7］對抗氧化成分的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，CCD采用非線性數(shù)學(xué)模型擬合，用響應(yīng)曲面法，以肺衣提取物對DPPH自由基的清除率為響應(yīng)值對肺衣抗氧化成分的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，旨在得到最佳的抗氧化物質(zhì)提取工藝條件，對開發(fā)具有天然抗氧化功能的產(chǎn)品，實現(xiàn)肺衣資源的綜合利用具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

肺衣 購于云南大理，將肺衣洗凈去除其他附屬藻類植物，自然涼干，用粉碎機打碎成肺衣粉，封口袋密封保存；DPPH 美國Sigma A ldrich公司產(chǎn)品；其余所有試劑 均為分析純。

AS10200AD型超聲波清洗器 天津奧特賽恩斯儀器有限公司；9200型紫外-可見光分光光度計 北京瑞利分析儀器公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 超聲波輔助肺衣抗氧化物提取工藝流程 肺衣粉→稱重→石油醚→提取→濾渣干燥→一定濃度乙醇提?。ǔ暡ㄝo助）→過濾→取濾液定容檢測抗氧化性。

1.2.2 DPPH貯備液的配制及標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制［8］準(zhǔn)確稱取DPPH試劑0.2530g于小燒杯中，用95%乙醇溶解，定量移入1000m L容量瓶中，用95%乙醇稀釋至刻度，搖勻，得253.0mg/L DPPH貯備液，置于冰箱中冷藏備用。

準(zhǔn)確移取10.0m L上述DPPH貯備液至100m L容量瓶中，用95%乙醇稀釋至刻度，搖勻，得25.3mg/L DPPH標(biāo)準(zhǔn)溶液。用吸量管分別加入25.3mg/L的DPPH標(biāo)準(zhǔn)溶液1.0、2.0、4.0、6.0、8.0m L和10.0m L于6個10m L容量瓶中，用95%乙醇稀釋至刻度，搖勻，以95%的乙醇溶劑為參比，在波長517nm處測定各溶液的吸光度。以DPPH質(zhì)量濃度（C）為橫坐標(biāo)，吸光度（A）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性回歸方程為A=0.059C+ 0.0497，相關(guān)系數(shù)r=0.99935，在DPPH質(zhì)量濃度為2.53～25.3mg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

1.2.3 DPPH自由基法檢測抗氧化活性［8-9］測定方法參考李姣娟［8］中的方法進(jìn)行，將DPPH貯備液稀釋至25.3mg/L，分別在5.00m L DPPH溶液中加入1.00m L的抗氧化劑溶液，總體積為6.00m L，混勻放置30m in后，用1cm比色皿于517nm處測定吸光度，根據(jù)DPPH標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程計算DPPH質(zhì)量濃度，并按下列公式計算DPPH·清除率。

式中：Co表示0時刻反應(yīng)體系中DPPH的起始質(zhì)量濃度，mg/L；Ct表示t時刻反應(yīng)體系中DPPH的質(zhì)量濃度，mg/L。

1.2.4 單因素實驗 稱取肺衣粉2.00g于錐形瓶中，加入20m L石油醚超聲提取20m in后過濾（以除去肺衣自身顏色葉綠素和脂溶性成分），待濾渣在室溫?fù)]發(fā)干燥后將其移回錐形瓶中，根據(jù)不同的液固比加入溶劑，按照不同的條件（乙醇濃度、液固比、超聲時間）進(jìn)行超聲波提取一次，提取后過濾，取濾液定容至50m L，研究不同條件提取物對DPPH自由基清除率的影響。

1.2.4.1 乙醇濃度的選擇 固定液固比為15∶1、超聲提取30m in，提取一次，乙醇濃度分別為50%、60%、70%、80%、90%（V/V），測定肺衣提取物對抗氧化活性的影響。

1.2.4.2 液固比的選擇 固定乙醇濃度以75%（V/V）、超聲提取30m in，提取一次，液固比分別為（m L/g）為（5∶1、8∶1、10∶1、12∶1、15∶1、20∶1），測定肺衣提取物對抗氧化活性的影響。

1.2.4.3 超聲時間的選擇 固定乙醇濃度以75%（V/ V）、液固比分別為（m L/g）為15∶1，提取一次，超聲時間分別為10、20、30、40、50、60min，測定肺衣提取物對抗氧化活性的影響。

1.2.5 實驗設(shè)計［10-11］根據(jù)單因素實驗結(jié)果，以乙醇濃度（V/V%）、液固比（m L/g）和超聲提取時間（m in）這三個因素為自變量，肺衣抗氧化活性為因變量，應(yīng)用Design-Expert Software 7.16軟件，進(jìn)行三因素五水平星點設(shè)計實驗，對實驗結(jié)果進(jìn)行多元線性回歸和二項式擬合。因素水平見表1。

表1 星點設(shè)計因素水平編碼表Table 1 Coded variables and their coded levels in CCD-response surface analysis

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗結(jié)果

2.1.1 乙醇濃度對肺衣提取物抗氧化活性的影響由圖1可知，DPPH·清除率隨著乙醇濃度的先增大后減小，濃度在50%～70%有顯著性差異，再增大濃度，沒有顯著性差異。肺衣中含有多酚和有機酸，不同的乙醇濃度具有不同的極性［12］，最佳乙醇濃度選擇在75%～85%，后續(xù)實驗中使用75%乙醇做溶劑。

2.1.2 液固比對肺衣提取物抗氧化活性的影響 由圖2可知，DPPH自由基清除率隨液固比的增大先增大后減小，從傳質(zhì)速率的角度講，主要表現(xiàn)在影響固相主體和液相主體之間的濃度差，即傳質(zhì)推動力。液固比小，提取過程中液相濃度增加快，兩相間的濃度差減少加快，從而使傳質(zhì)推動力衰減加快。其次，液固比的大小會影響兩相的混合情況。尤其在攪拌不充分的情況下，會改變表觀傳質(zhì)系數(shù)，從而影響傳質(zhì)速率。液固比的提高必然會在較大的程度上提高傳質(zhì)推動力，但也提高了生產(chǎn)成本及后續(xù)處理的難度，所以液固比也不宜太高［13］，15∶1時的DPPH自由基清除率有顯著性差異。因此，液固比選擇在15∶1比較合適。

圖1 乙醇濃度對提取物抗氧化性的影響Fig.1 Effect of ethanol concentration on the antioxidant activity of extracts

圖2 液固比對提取物抗氧化性的影響Fig.2 Effect of liquid solid ratio on the antioxidant activity of extracts

2.1.3 超聲時間對提取物抗氧化活性的影響 由圖3可知，DPPH自由基清除率隨著超聲時間的增加先增大后減小，超聲波獨具的物理特性能促使植物細(xì)胞組織破壁或變形，短時間內(nèi)即可獲得最佳提取率［14］，但超聲時間過長，溶液溫度較高，可能破壞了肺衣中抗氧化物質(zhì)，清除率降低，因此超聲時間控制在20min較為合適。

圖3 超聲波時間對提取物抗氧化性的影響Fig.3 Effect of ultrasonic time on the antioxidant activity of extracts

2.2 星點設(shè)計實驗結(jié)果與分析

2.2.1 實驗結(jié)果與模型擬合 根據(jù)中心組合設(shè)計原理，以乙醇濃度、液固比、超聲時間三個因素為自變量A、B、C，提取物對DPPH自由基清除率為響應(yīng)值，設(shè)計了共20個實驗點的響應(yīng)面分析實驗，實驗設(shè)計及結(jié)果見表2。

表2 星點設(shè)計響應(yīng)面實驗設(shè)計與結(jié)果Table 2 Experimental design and corresponding results for CCD-response surface analysis

本實驗數(shù)據(jù)使用Design-Expert Software 7.16軟件，采用星點設(shè)計分析方法，進(jìn)行多元線性歸和二項式擬合，對表2中的實驗結(jié)果進(jìn)行多元線性回歸和二項式擬合，二次回歸方程模型為：

對該回歸方程進(jìn)行方差分析（見表3），可以看出模型的p＜0.0001，說明該模型得到的回歸方程是顯著的，實驗設(shè)計可靠，模型相關(guān)系數(shù)R2=0.9492，進(jìn)一步說明模型具有較好的可信度。在所選取的各因素水平范圍內(nèi)，按照對結(jié)果的影響排序，乙醇濃度＞液固比＞超聲時間。

從表3可以看出，方差分析的結(jié)果表明方程的總模型、乙醇濃度（A）、液固比（B）對DPPH自由基清除率的影響極顯著；A2、B2、C2對DPPH自由基清除率的影響顯著，而超聲時間（C）、交互項AB、AC、BC對DPPH自由基清除率的影響不顯著。

表3 星點設(shè)計-響應(yīng)面實驗結(jié)果方差分析表Table 3 Analysis variance for response CCD-surfacemodel

2.2.2 響應(yīng)面分析 響應(yīng)面方法（RSM）的圖形是特定的響應(yīng)值Y對應(yīng)的因素構(gòu)成的一個三維空間圖，可以直觀地反映各因素對響應(yīng)值的影響，可直觀的反映各實驗因素的交互作用等［15-17］。

圖4 肺衣抗氧化性物質(zhì)提取條件優(yōu)化的響應(yīng)曲面圖Fig.4 Response surface graphs for optimizing the extraction of antioxidants from Lobaria Pulmonariaon

由圖4（a）和4（b）可知，隨著乙醇濃度的增加，肺衣對DPPH自由基清除率升高，增大明顯，乙醇濃度影響顯著，由圖4（a）和4（c）可知，隨著液固比升高，對DPPH自由基清除率先增后降，液固比影響顯著，從等高線可以看出，兩因素的交互作用不顯著。由圖4（b）和4（c）可知，隨著超聲提取時間的增大，肺衣對DPPH自由基清除率先增大，當(dāng)達(dá)到最大值后，再增加時間，清除率降低，超聲提取時間影響不顯著。

利用軟件中的Optimization Choices模塊的Point Prediction功能進(jìn)行預(yù)測分析，獲得一組響應(yīng)值最大的優(yōu)化條件：乙醇濃度為85.24%，液固比為18.6m L/g，超聲時間為20.0m in，在此優(yōu)化條件下，肺衣提取物對DPPH自由基清除率預(yù)測值為為92.8293%，參照理論上的優(yōu)化條件進(jìn)行驗證實驗，考慮到實際操作的可行性，條件修正為：乙醇濃度為85.0%，液固比為18.6m L/g，超聲時間為20.0min，對DPPH自由基清除率實驗值91.69%（n=5），與預(yù)測值的相對偏差為-1.227%。

3 結(jié)論

在單因素實驗的基礎(chǔ)上，采用RSM法優(yōu)化了超聲輔助提取肺衣抗氧化物質(zhì)工藝參數(shù)，其肺衣提取物具有較好的抗氧化性，建立了回歸模型方程，該模型回歸極顯著，說明該方程對實驗擬合較好，得出了乙醇濃度和液固比是影響肺衣提取物清除DPPH自由基的抗氧化活性的主要因素，且無交互作用，超聲時間影響不顯著。同時也獲得了該體系提取工藝參數(shù)：乙醇濃度為85.0%，液固比為18.6m L/g，超聲時間為20.0m in，對DPPH自由基清除率實驗值91.69%（n=5），與預(yù)測值基本相符，說明了用響應(yīng)面分析法來設(shè)計最佳提取工藝的可靠性。超聲波提取是一種節(jié)時、節(jié)能、節(jié)料的方法，能較好地應(yīng)用于植物活性物質(zhì)的提取，星點設(shè)計-響應(yīng)面法優(yōu)化法是一種較好的實驗設(shè)計方法。

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Optimization of ultrasound-assisted extraction of antioxidants from Lobaria Pulmonaria by central composite design-response surface methodology

LIU M an-hong1，2，LIU Xiao-fang1，2，DAI Jian-hui1，2，GAO Yun-tao1，2，WANG Hai-long1，2
（1.The Engineering Laboratory of Polylactic Acid-Based Functional Materials of Yunnan，School of Chemistry and Biotechnology，Yunnan Minzu University，Kunming 650500，China；2.Key Laboratory of Chemistry in Ethnic Medicinal Resources，State Ethnic Affairs Commission&Ministry of Education，Yunnan University of Nationalities，Kunming 650500，China）

To optimize ultrasound-assisted extraction technology process condition of antioxidants from LobariaPulmonaria by central composite design -response surface methodology. For the evaluation of the ability ofextract to scavenge free radicals，a DPPH free radical system was constructed. Based on ethanol concentration，liquid to solid ratio，extraction time of single factor experiment，the principle of design for 3 star factor 5 fivelevel response surface methodology was applied. The ethanol concentration of 85.0％ ，liquid solid ratio of18.6mL/g，extraction time of 20.0min were selected as the optimum conditions. The extraction under theseconditions presented a DPPH radical scavenging ratio was 91.69％，with the theoretical 92.829％ for therelative error of -1.227％. Central Composite Design-response surface methodology was highly predictive inexperimental design.

Lobaria Pulmonaria；antioxidant activity；DPPH free radical；ultrasonic wave extraction；response surface analysis

TS201.1

B

1002-0306（2015）08-0240-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.08.042

2014－04－11

劉滿紅（1962-），女，碩士，教授，研究方向：物理化學(xué)教學(xué)與科研。

國家民委科研項目（12YNZ007）。