超聲輔助提取對(duì)藍(lán)莓花青素提取率、抗氧化活性及化學(xué)組成的影響

羅水忠，潘利華

（1.合肥工業(yè)大學(xué)生物與食品工程學(xué)院，安徽合肥230009；2.安徽省農(nóng)產(chǎn)品精深加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽合肥230009）

超聲輔助提取對(duì)藍(lán)莓花青素提取率、抗氧化活性及化學(xué)組成的影響

羅水忠1，2，潘利華1，*

（1.合肥工業(yè)大學(xué)生物與食品工程學(xué)院，安徽合肥230009；2.安徽省農(nóng)產(chǎn)品精深加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽合肥230009）

采用Box-Behnken設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)分析超聲輔助提取工藝參數(shù)對(duì)藍(lán)莓花青素的提取率和抗氧化活性的影響，并通過HPLC-ESI-MS法分析超聲輔助溶劑浸提對(duì)藍(lán)莓花青素化學(xué)組成的影響。結(jié)果表明：提取率與抗氧化活性的最顯著影響因子、最佳工藝參數(shù)及回歸模型并不相同；提取率的最顯著影響因子為超聲溫度和超聲功率強(qiáng)度，最適條件為超聲溫度39℃、超聲功率強(qiáng)度490W、超聲pH3.5、超聲時(shí)間45min；而DPPH·清除率的最顯著影響因子為超聲時(shí)間，最適條件為超聲溫度45℃、超聲功率強(qiáng)度450W、超聲pH3.1、超聲時(shí)間37min；與溶劑浸提法相比，超聲輔助溶劑浸提法縮短了浸提時(shí)間，但沒有改變其化學(xué)組成，兩種方法都獲得11種花青素糖苷。

藍(lán)莓，花青素，溶劑浸提，超聲輔助浸提

藍(lán)莓果實(shí)中花青素含量高于其他所有水果與蔬菜，因此，藍(lán)莓果為天然花青素的提取提供了優(yōu)良資源。藍(lán)莓花青素由矢車菊色素、飛燕草色素、錦葵色素、芍藥色素、牽?；ㄉ氐?種花青素苷元（anthocyadin），以及它們各自與葡萄糖、乙酰葡萄糖、半乳糖、乙酰半乳糖、阿拉伯糖、乙酰阿拉伯糖連接形成的花青素糖苷（anthocyanin）所組成［1-2］，具有抗氧化、改善視力等多種生理功能［3］。為此，藍(lán)莓花青素的提取備受關(guān)注。當(dāng)前，藍(lán)莓花青素的提取通常采用乙醇溶劑浸提法或超聲波、微波、超臨界流體等輔助乙醇溶劑提取法［4-6］，其中，超聲輔助溶劑提取法由于超聲波的空化效應(yīng)、熱效應(yīng)、機(jī)械效應(yīng)等多種效應(yīng)，在破壞細(xì)胞壁和細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，增大物質(zhì)分子運(yùn)動(dòng)頻率和速度，增加溶劑穿透力，加速目標(biāo)分子進(jìn)入溶劑，提高提取率等方面優(yōu)勢(shì)突出［7］。但是，超聲處理是否改變花青素的穩(wěn)定性和生理活性仍有爭(zhēng)議。Dubrovic等［8］發(fā)現(xiàn)，20℃超聲處理草莓汁3～9m in，草莓花青素降解0.7%～4.4%；55℃超聲處理9m in，草莓總花青素含量減少5.8%～7.1%；然而，Tiwari等［9］的研究則顯示，超聲處理對(duì)黑莓汁中的花青素沒有顯著影響。Flores等［10］研究發(fā)現(xiàn)，提取劑對(duì)藍(lán)莓花青素的活性有影響，乙醇為提取劑時(shí)抗氧化活性較高而以丙酮為提取劑a-葡萄糖苷酶抑制活性較高。本文就超聲輔助提取對(duì)藍(lán)莓花青素的提取率、抗氧化活性及化學(xué)組成的影響開展研究，為超聲輔助提取在藍(lán)莓花青素的加工應(yīng)用提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

藍(lán)莓 兔眼藍(lán)莓巴爾德溫栽培種冷藏鮮果，由安徽徽王食品有限公司惠贈(zèng)；矢車菊素3-O-葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)品（DPPH） Sigma公司產(chǎn)品；其他試劑 均為分析純。

SY-1000E型多用途恒溫超聲提取器 北京弘祥隆生物技術(shù)開發(fā)有限公司；SHZCT15RT型高速冷凍離心機(jī) 上海天美科學(xué)儀器有限公司；Hei-VAP Advantage型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 德國(guó)Heidolph公司；V1100型可見光分光光度計(jì) 上海美譜達(dá)儀器有限公司；LGJ-18S型原位真空冷凍干燥機(jī) 北京松源華興科技發(fā)展有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 藍(lán)莓花青素的乙醇溶劑浸提過程 根據(jù)參考文獻(xiàn)［11］獲取藍(lán)莓花青素粗提液，即稱取500.0g干凈、無腐爛的藍(lán)莓鮮果，通過組織搗碎機(jī)搗碎成藍(lán)莓漿，再置于提取瓶中，加入藍(lán)莓漿8倍體積的pH3.0± 0.1的酸化乙醇提取劑（乙醇終體積分?jǐn)?shù)75%）在（50± 0.5）℃、（150±5）r/min的條件浸提150m in，接著將浸提液在10000r/m in、4℃條件下離心10m in，取上清液得到藍(lán)莓花青素粗提液；然后將藍(lán)莓花青素粗提液通過AB-8樹脂吸附，再用60%乙醇洗脫，收集乙醇洗脫流出液，50℃減壓濃縮除去乙醇后冷凍干燥即得到花青素A。

1.2.2 藍(lán)莓花青素的超聲輔助乙醇溶劑浸提過程 按照1.2.1的方法準(zhǔn)備藍(lán)莓漿和提取劑，放入恒溫超聲提取器中，在參考文獻(xiàn)［12］中單因素的實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，設(shè)定表1的超聲溫度、超聲頻率和超聲功率強(qiáng)度條件超聲提取一定時(shí)間后，將提取液按照1.2.1的方法離心，測(cè)定上清液中藍(lán)莓花青素含量及DPPH·清除率；上清液按照1.2.1的方法純化、減壓濃縮、冷凍干燥即得到花青素B。

表1 Box-Behnken設(shè)計(jì)因素水平表Table 1 Factors and levers of Box-Behnken design

1.2.3 超聲輔助提取工藝參數(shù)對(duì)藍(lán)莓花青素提取率及抗氧化活性的影響 采用Box-Behnken設(shè)計(jì)方法，選取3個(gè)中心點(diǎn)進(jìn)行27次實(shí)驗(yàn)（表1），測(cè)定每次實(shí)驗(yàn)中藍(lán)莓花青素的提取率及DPPH·清除率，分析超聲工藝參數(shù)對(duì)提取率及抗氧化活性的影響。藍(lán)莓花青素含量的測(cè)定采用雙波長(zhǎng)pH示差法［13］，以矢車菊素3-O-葡萄糖苷為參照，提取率（mg/g）以每g藍(lán)莓干果中花青素（矢車菊素3-O-葡萄糖苷）的mg數(shù)表示。DPPH·清除率的測(cè)定參考Cui等［14］報(bào)道的方法進(jìn)行，DPPH·清除率（%）=（A樣品－A對(duì)照）×100/A空白；DPPH清除率越大，表示抗氧化活性越強(qiáng)，反之DPPH·清除率越小，表示抗氧化活性越弱。

1.2.4 超聲輔助提取對(duì)藍(lán)莓花青素化學(xué)組成的影響

取藍(lán)莓花青素A和提取率最大時(shí)的藍(lán)莓花青素B，通過HPLC-ESI-MS法分析其化學(xué)組分，探討超聲輔助提取對(duì)藍(lán)莓花青素化學(xué)組成的影響。

色譜條件：色譜柱為Waters X Bridge C18（4.6mm× 250mm，5μm）；流動(dòng)相的A相為5%甲酸水溶液，B相為乙腈；進(jìn)樣量20μL；流速0.8m L/min；柱溫25℃；線性洗脫梯度：0～15m in，5%～10%B；15～30m in，10%～13%B；30～34m in，13%～20%B；34～40min，20%～25% B；40～43m in，25%～100%B；DAD檢測(cè)器檢測(cè)波長(zhǎng)為530nm。色譜柱分離后樣品經(jīng)三通閥分流后進(jìn)入質(zhì)譜分析。質(zhì)譜條件：電噴霧離子源；數(shù)據(jù)采集使用軟件Agilent Chemstation Rev.A.09.01 software（Agilent，Palo A lto，CA）；正離子掃描模式，掃描范圍100～1500m/z；干燥氣溫度350℃；氮?dú)饬魉?2L/min；毛細(xì)管電流34nA；霧化器壓力0.31MPa。

2 結(jié)果與分析

2.1 超聲輔助提取工藝參數(shù)對(duì)藍(lán)莓花青素提取率的影響

利用Design-Expert 8.05軟件對(duì)表2中數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到響應(yīng)值Y（提取率）與影響提取率的關(guān)鍵因子超聲溫度（A）、超聲pH（B）、超聲功率強(qiáng)度（C）和超聲時(shí)間（D）的二次多項(xiàng)式回歸模型為：

表3方差分析結(jié)果表明，該模型（p＜0.01）高度顯著；失擬項(xiàng)p=0.4061＞0.05，差異不顯著，說明殘差由隨機(jī)誤差引起；R2=0.9524，表明該模型與實(shí)驗(yàn)擬合較好，自變量與響應(yīng)值線性關(guān)系顯著，可以用于藍(lán)莓花青素提取率對(duì)超聲輔助提取工藝參數(shù)響應(yīng)的理論預(yù)測(cè)。在p=0.05顯著水平剔除不顯著項(xiàng)，得到藍(lán)莓花青素提取率對(duì)超聲輔助提取響應(yīng)優(yōu)化方程為Y1=46.97－

從表3還可以看出，超聲pH（B）和超聲功率強(qiáng)度（C）的互作效應(yīng)對(duì)藍(lán)莓花青素提取率的影響高度明顯（p＜0.01），進(jìn)一步分析得到藍(lán)莓花青素提取率預(yù)測(cè)值最大時(shí)的因素水平為：超聲溫度38.7℃、超聲功率強(qiáng)度486W、超聲pH 3.5、超聲時(shí)間43.3m in，預(yù)測(cè)值為5.587mg/g。綜合考慮優(yōu)化為超聲溫度39℃、超聲功率強(qiáng)度490W、超聲pH3.5、超聲時(shí)間45min的條件下進(jìn)行驗(yàn)證，提取率平均值為5.478mg/g，與理論值5.512mg/g基本吻合，表明該模型合理有效。伍錦鳴等［15］用四因素五水平的響應(yīng)面分析法，測(cè)得美國(guó)藍(lán)莓果花青素的最佳提取條件為：超聲功率強(qiáng)度730W、料液比1∶18、提取時(shí)間40m in、提取溫度55℃，此工藝條件下花青素提取率為5.79%。Tian等［9］的結(jié)果則顯示，藍(lán)莓花青素超聲輔助提取的最優(yōu)工藝條件為超聲功率強(qiáng)度510W、提取時(shí)間30m in、料液比10∶1m L/g，此時(shí)提取率為2.903mg/g。這種差異可能是由于各研究所用原料、儀器、檢測(cè)方法等不同而造成的。

表2 響應(yīng)面設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 Design and results of response surface analysis

表3 提取率Box-Behnken實(shí)驗(yàn)回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis for regressionmodel of Box-Behnken experimenton extraction rate

2.2 超聲輔助提取工藝參數(shù)對(duì)藍(lán)莓花青素抗氧化活性的影響

利用Design-Expert 8.05軟件對(duì)表1中數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到響應(yīng)值Y2（藍(lán)莓花青素DPPH·清除率）與影響DPPH·清除率的關(guān)鍵因子超聲溫度（A）、超聲pH（B）、超聲功率強(qiáng)度（C）和超聲時(shí)間（D）的二次多項(xiàng)式回歸模型為：

表4 DPPH·清除率Box-Behnken實(shí)驗(yàn)回歸模型方差分析Table 4 Variance analysis for regressionmodel of Box-Behnken experimenton DPPH scavenging rate

表4方差分析結(jié)果表明，該模型（p＜0.01）高度顯著；失擬項(xiàng)p=0.3710＞0.05，差異不顯著，說明殘差由隨機(jī)誤差引起；R2=0.9247，表明該模型與實(shí)驗(yàn)擬合較好，自變量與響應(yīng)值線性關(guān)系顯著，可用于藍(lán)莓花青素DPPH清除率對(duì)超聲輔助提取響應(yīng)規(guī)律的理論預(yù)測(cè)。在p=0.05顯著水平剔除不顯著項(xiàng)，得到優(yōu)化方程為Y2=83.87＋2.23D－3.25AB＋7.70AD－4.05BD－8.09A2－8.87B2－2.78C2－8.89D2式（4）

從表3還可以看出，超聲溫度（A）和超聲pH（B）、以及超聲pH（B）和超聲時(shí)間（D）的互作效應(yīng)對(duì)藍(lán)莓花青素DPPH·清除率影響高度顯著（p＜0.01），超聲溫度（A）和超聲時(shí)間（D）的互作效應(yīng)影響顯著（p＜0.05），交互作用表現(xiàn)為藍(lán)莓花青素對(duì)DPPH·清除率的增大。通過進(jìn)一步分析計(jì)算，得到藍(lán)莓花青素對(duì)DPPH·清除率預(yù)測(cè)值最大時(shí)的因素水平為：超聲溫度45.2℃、超聲功率強(qiáng)度447W、超聲pH 3.1、超聲時(shí)間36.6min，預(yù)測(cè)值為84.14%。綜合考慮優(yōu)化為超聲溫度45℃、超聲功率強(qiáng)度450W、超聲pH 3.1、超聲時(shí)間37min的條件下進(jìn)行驗(yàn)證，DPPH清除率平均值為82.69%，與理論值82.87%十分吻合，表明該模型合理有效。

2.3 超聲輔助提取對(duì)藍(lán)莓花青素化學(xué)組成的影響

根據(jù)HPLC-ESI-MS信息及花青素在530nm附近有特征吸收，可以此判斷是否為花青素［16］。圖1結(jié)果表明，花青素A和花青素B都得到了較好的分離，均有11個(gè)吸收峰（峰2-峰12，峰1為溶劑峰），且各吸收峰占總吸收峰峰面積的百分比沒有顯著差異，這顯示，兩種提取方法所獲得的藍(lán)莓花青素的化學(xué)組成相同，根據(jù)表5色譜峰的相關(guān)信息及文獻(xiàn)信息［17-20］，推知它們分別為飛燕草-3-半乳糖苷（delphindin-3-galactoside）、飛燕草-3-葡萄糖苷（delphindin-3-glucoside）、矢車菊-3-半乳糖苷（cyanidin-3-galactioside）、矢車菊-3-葡萄糖苷（cyanidin-3--glucoside、牽?；?3-半乳糖苷（petunidin-3-galactoside）、矢車菊-3-阿拉伯糖苷（cyanidin-3-arabinoside）、牽?；?3-葡萄糖苷（petunidin-3-glucoside）、芍藥素-3-葡萄糖苷（peonidin-3-glucoside）、錦葵素-3-半乳糖苷（malvidin-3-galactoside）、錦葵素-3-葡萄糖苷（malvidin-3-glucoside）和錦葵素-3-阿拉伯糖苷（malvidin-3-arabinoside）?？梢?，與乙醇溶劑浸提法相比，超聲輔助乙醇溶劑浸提法并沒有改變藍(lán)莓花青素的化學(xué)組成，提取樣品都為花青素糖苷。

圖1 乙醇浸提與超聲輔助乙醇浸提的藍(lán)莓花青素的液相色譜圖（530nm）Fig.1 HPLC chromatogram of blueberry anthocyanins obtained by at530nm

表5 藍(lán)莓花青素A與藍(lán)莓花青素B各組分的質(zhì)譜信息及其結(jié)構(gòu)推測(cè)Table 5 HPLC/MSand conjectural structure of blueberry anthocyanins

3 結(jié)論

3.1 花青素提取率及其抗氧化活性的最適超聲輔助提取工藝條件不同。影響花青素提取率的最顯著因子是超聲溫度和超聲功率強(qiáng)度，最適提取工藝條件為超聲溫度39℃、超聲功率強(qiáng)度490W、超聲pH 3.5、超聲時(shí)間45m in，預(yù)測(cè)值最大為5.478mg/g；而影響花青素DPPH·清除率的最顯著因子是超聲時(shí)間，最適提取工藝條件為超聲溫度45℃、超聲功率強(qiáng)度450W、超聲pH 3.1、超聲時(shí)間37m in，預(yù)測(cè)值最大82.69%。

3.2 超聲輔助乙醇浸提法能夠顯著縮短浸提時(shí)間、提高提取率而沒有改變藍(lán)莓花青素的化學(xué)組成。乙醇浸提和超聲輔助乙醇浸提的藍(lán)莓花青素均為花青素糖苷，它們的化學(xué)組成沒有顯著差別。

3.3 超聲輔助浸提藍(lán)莓花青素時(shí)，應(yīng)該根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪x擇適宜的評(píng)價(jià)指標(biāo)，當(dāng)提取產(chǎn)物僅作為色素添加劑時(shí)，可以以提取率為評(píng)價(jià)指標(biāo)進(jìn)行工藝優(yōu)化；當(dāng)提取產(chǎn)物作為抗氧化功能因子時(shí)，可以以DPPH·清除率為評(píng)價(jià)指標(biāo)進(jìn)行工藝優(yōu)化。

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Effect of ultrasonic-assisted extraction on the extraction rate，antioxidant activity and chemical composition of blueberry anthocyanins

LUO Shui-zhong1，2，PAN Li-hua1，*
（1.School of Biotechnology and Food Engineering，HefeiUniversity of Technology，Hefei230009，China；2.Key Laboratory for Agriculture Products Processing of Anhui Province，Hefei230009，China）

In order to obtain the characteristics of the extraction rate，antioxidant activity and chemical compositionof blueberry anthocyanins in the ultrasonic assisted extraction，Box -Behnken design，and antioxidant activitytest in vitro and HPLC-ESI-MS analysis were employed. The results showed that there were differences in themost significant affecting factors and optimal conditions between the extraction rate and the DPPH scavengingrate of blueberry anthocyanins. The ultrasonic temperature and the ultrasonic power were the most significantfactors affecting the extraction rate of blueberry anthocyanins，while the ultrasonic time was the most significantfactors affecting the DPPH scavenging rate of blueberry anthocyanins. The optimal conditions for the extractionrate of blueberry anthocyanins were ultrasonic temperature 39℃，ultrasonic power 490W，ultrasonic pH3.5 andultrasonic time 45min，while for the DPPH scavenging rate of blueberry anthocyanins were ultrasonic temperature45℃，ultrasonic power 450W，ultrasonic pH3.1 and ultrasonic time 37min. The results of HPLC-ESI-MS analysisshowed that 11 anthocyanins from blueberry belonged to anthocyanin glycosides and had the similar chemicalcomposition obtained by both the classic extraction and ultrasound-assisted extraction.

blueberry；anthocyanins；solvent maceration；ultrasonic-assisted extraction

TS254

B

1002-0306（2015）08-0235-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.08.041

2014－07－15

羅水忠（1975-），男，博士，副教授，研究方向：農(nóng)產(chǎn)品加工。

*通訊作者：潘利華（1972-），女，博士，副教授，研究方向：農(nóng)產(chǎn)品加工與貯藏。

安徽省2012年度科技攻關(guān)項(xiàng)目（1201032075）；安徽省2013年度科技攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目（1301032165）。