靖西大果山楂皮紅色素的提取及抑菌活性的研究

李 容，覃 濤，梁榕珊，尹建華，黃祖良

（右江民族醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，廣西百色533000）

靖西大果山楂皮紅色素的提取及抑菌活性的研究

李 容，覃 濤，梁榕珊，尹建華，黃祖良*

（右江民族醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，廣西百色533000）

研究了微波輔助提取靖西大果山楂皮中紅色素的最佳工藝條件，考察乙醇濃度、料液比、微波功率、微波時(shí)間對(duì)色素提取的影響，通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)對(duì)上述條件進(jìn)行了優(yōu)化，并采用濾紙片瓊脂擴(kuò)散法測(cè)定了紅色素的抑菌活性。結(jié)果表明：山楂皮紅色素提取的最佳條件為：乙醇濃度60%，料液比1∶50（g/mL），微波功率500W，微波時(shí)間60s，提取2次。抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，紅色素對(duì)金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、大腸桿菌、傷寒桿菌均有一定的抑制作用。

靖西大果山楂，果皮，提取，色素，抑菌活性

山楂為我國(guó)傳統(tǒng)的藥食同源品之一，其果可生吃或作果脯果糕；干制后也可入藥，能健胃消食；降壓、降血脂，還有抑菌、抗腫瘤等藥理作用［1］。我國(guó)使用歷史非常悠久，品種資源來(lái)源極其復(fù)雜，市場(chǎng)上有北山楂、南山楂、廣山楂、云山楂等多個(gè)品種，不同品種，不同產(chǎn)地其品質(zhì)相差很大［2］。

靖西大果山楂（Crataegus jingxiensis Li）是20世紀(jì)80年代初期全國(guó)山楂普查時(shí)發(fā)現(xiàn)的一個(gè)新品種，1985年被林學(xué)專家黎向東等定為此名［3］。靖西大果山楂果產(chǎn)于廣西百色靖西縣，因果大而聞名，每公斤鮮果6～12個(gè)，比北方山楂大6～10倍，最大單果重120g［3］。目前，靖西大果山楂主要用于食品加工，已開發(fā)出山楂糕、山楂酸、山楂應(yīng)子等食品。在制作多種山楂食品時(shí)，常需去除山楂皮，因此，得到大量的食品加工副產(chǎn)品山楂皮。山楂紅色素，屬于天然花青素類色素，其紅色素主要存在于山楂果皮中，具有一定的藥用和保健價(jià)值［4］，具有很好的研究?jī)r(jià)值。大量研究表明，天然色素不僅安全、無(wú)毒，還有營(yíng)養(yǎng)、保健及藥理作用［5-6］。目前，從山楂果實(shí)中提取紅色素的研究已有大量報(bào)道，但未見從靖西果大果山楂果皮提取紅色素的報(bào)道。

微波作為一門新技術(shù)，被廣泛的應(yīng)用于植物有效成分的提取。近年來(lái)，微波輔助提取技術(shù)在色素提取領(lǐng)域也在逐漸推廣［7］。采用微波輔助提取山楂皮紅色具有工藝穩(wěn)定、提取速度快、時(shí)間短及對(duì)色素物質(zhì)破壞少等優(yōu)點(diǎn)。本文就靖西大果山楂皮的紅色素進(jìn)行微波輔助提取及抑菌活性研究，為山楂皮的綜合利用開辟新的途徑。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

山楂皮 購(gòu)自廣西百色市靖西縣；乙醇 分析純，成都科龍化工試劑廠；牛肉膏、蛋白胨、瓊脂 生化試劑，青島海博生物技術(shù)有限公司；供試菌種為大腸桿菌（Escherichia coli）、金黃色葡萄桿菌（Staphylococcus aureus）、傷寒桿菌（Salmonella enterica）、表皮葡萄球菌（Staphylococcusepiderm idis）由右江民族醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院微生物教研室提供。

FZ102型植物粉碎機(jī) 上海銳豐儀器儀表有限公司；TU-1800型紫外可見分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限公司；RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海安亭實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；CPA64型電子天平 北京塞多利斯儀器公司；XH-300A型微波超聲波組合合成萃取儀 北京祥鵠科技發(fā)展有限公司；LRH-150D型生化培養(yǎng)箱 韶關(guān)泰紅宏醫(yī)療器械有限公司；SWCJ-2型雙人雙面凈化工作臺(tái) 蘇州凈化設(shè)備有限公司；HVE50L型高壓蒸汽滅菌器 日本三洋公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 色素提取工藝流程 靖西大果山楂皮→50℃條件下烘干2h→植物粉碎機(jī)粉碎→過(guò)80目篩→以乙醇為溶劑微波輔助提取→抽濾→3000r/min轉(zhuǎn)速離心8min（取少量測(cè)吸光度）→減壓濃縮（回收乙醇）→真空干燥→紅色素浸膏。

1.2.2 單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù)山楂果實(shí)紅色素研究結(jié)果，選取乙醇為提取溶劑，色素的含量用最大吸收波長(zhǎng)520nm處的吸光度值來(lái)表示［8］。考察乙醇濃度、料液比、微波功率、微波時(shí)間對(duì)色素提取的影響，固定山楂皮粉末2g，乙醇濃度60%，料液比1∶50（g/m L），微波功率300W，提取時(shí)間40s，改變乙醇濃度（30%、40%、50%、60%、70%、80%），料液比（1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60、1∶70g/m L），微波功率（100、200、300、400、500、600W），微波時(shí)間（20、30、40、50、60s），在各條件下提取色素，抽濾，定容后測(cè)吸光度值。

1.2.3 正交實(shí)驗(yàn) 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取乙醇濃度、料液比、微波功率、微波時(shí)間的較優(yōu)水平，進(jìn)行L9（34）正交實(shí)驗(yàn)，優(yōu)化山楂皮紅色素提取工藝，正交實(shí)驗(yàn)因素水平見表1。

表1 因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment

1.2.4 提取次數(shù)的確定 稱取4份3g山楂皮粉末，在最佳工藝優(yōu)化條件下，分別提取1、2、3、4次，合并濾液，濃縮，定容，分別測(cè)定吸光度值，確定提取次數(shù)。

1.2.5 抑菌活性測(cè)定 采用濾紙片法測(cè)定山楂皮紅色素成分對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、傷寒桿菌、表皮葡萄球菌的抑制作用［9］。將山楂皮紅色素浸膏溶解在水中，配制成不同濃度梯度的待測(cè)液，用濾菌膜過(guò)濾除菌，備用。在無(wú)菌操作臺(tái)中將滅菌后的濾紙片浸泡在色素溶液中12h，得色素濾紙片。在平板培養(yǎng)基中加入菌懸液，涂布均勻制成含菌平板，將色素濾紙片貼于平板中，在37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，測(cè)量抑菌圈直徑大小。每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定3次，抑菌圈直徑取平均值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均用Origin 7.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 乙醇濃度對(duì)色素提取的影響 從圖1可知，紅色素吸光度值隨著乙醇濃度的增加而增大，在60%時(shí)達(dá)最大，隨著乙醇濃度的進(jìn)一步增大，紅色素的吸光度值急劇下降。其可能的原因是，乙醇體積分?jǐn)?shù)增大，極性減小，不利于山楂皮紅色素的溶解，只有在合適的極性條件下，才利于紅色素的提取。

圖1 乙醇濃度對(duì)提取的影響Fig.1 Effect of ethanol concentration on extraction

2.1.2 料液比對(duì)色素提取的影響 料液比對(duì)色素提取的影響如圖2所示，當(dāng)料液比達(dá)到1∶50（g/m L）時(shí)吸光度值已基本達(dá)到穩(wěn)定，進(jìn)一步增大料液比色素吸光度值無(wú)明顯提高。這表明色素在料液比為1∶50（g/m L）時(shí)已經(jīng)基本提取完全，考慮到溶劑及后序濃縮成本［10］，料液比以1∶50（g/m L）較合適。

圖2 料液比對(duì)色素提取的影響Fig.2 Effect of solid to liquid ratio on extraction

2.1.3 微波功率對(duì)色素提取的影響 微波功率對(duì)色素提取的影響如圖3所示，從圖3可知，微波功率在400W前，吸光度值隨微波功率的增大而增加，當(dāng)功率高于400W后，吸光度值下降，可能是微波功率過(guò)大，引起變色素的結(jié)構(gòu)改變［11］。

圖3 微波功率對(duì)色素提取的影響Fig.3 Effect ofmicrowave power on extraction

2.1.4 微波時(shí)間對(duì)色素提取的影響 微波時(shí)間對(duì)色素提取的影響如圖4所示，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)溶液的吸光度先增大后減小，微波提取時(shí)間為50s時(shí)達(dá)最大值，超過(guò)50s后吸光度值下降，其原因可能為長(zhǎng)時(shí)間微波加熱導(dǎo)致部分紅色素結(jié)構(gòu)破壞，因此微波加熱時(shí)間以50s較為合適。

圖4 微波時(shí)間對(duì)色素提取的影響Fig.4 Effect of microwave irradiation time on extraction

2.2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of orthogonal experiment

表3 方差分析Table 3 The results of variance analysis

正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果和方差分析如表2、表3所示。從表2分析可知，各因素對(duì)色素吸光度的影響因素順序?yàn)椋篋＞A＞C＞B，即微波時(shí)間＞乙醇濃度＞微波功率＞料液比；方差分析可知，D因素對(duì)色素提取工藝有顯著影響，A和C對(duì)提取工藝無(wú)顯著影響。綜合分析，最優(yōu)組合為A3B2C3D3，即最佳工藝為：乙醇濃度60%，料液比1∶50，微波功率500W，微波時(shí)間60s，吸光度值平均為1.531（n=3）。

2.3 提取次數(shù)

在最佳工藝下對(duì)山楂皮紅色素進(jìn)行反復(fù)提取，分別測(cè)定提取1～4次的吸光度值，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5所示。山楂皮紅色素經(jīng)過(guò)2次提取后，吸光度值則沒有明顯提高，表示紅色素已基本溶出，故提取次數(shù)確定為2次。

圖5 次數(shù)對(duì)色素提取的影響Fig.5 Effect of times on extraction

2.4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

取山楂皮粉末5份，每份3g，在最佳工藝條件下重復(fù)提取2次，合并2次濾液，定容測(cè)吸光度值。5份色素溶液的吸光度值分別為2.186、2.315、2.301、2.270、2.261，平均吸光度值為2.277，RSD為2.21%，表明該工藝穩(wěn)定。

2.5 抑菌實(shí)驗(yàn)

表4 紅色素抑菌活性（mm，n=3）Table 4 Antibacterial activities of red pigment（mm，n=3）

采用濾紙片法測(cè)定山楂皮紅色素成分的抑菌活性，結(jié)果見表4。由表4可知，山楂皮紅色素對(duì)對(duì)四種供試菌株均有一定的抑制作用，其抑菌作用與色素的濃度呈正相關(guān)性，濃度太低抑菌效果不理想。四種菌株對(duì)比，紅色素對(duì)表皮葡萄球菌和傷寒桿菌的抑制作用較大腸桿菌和金黃葡萄球菌的作用要強(qiáng)。

3 結(jié)論

采用微波輔助法從靖西大果山楂皮中提取紅色素，考察了乙醇濃度、料液比、微波功率、微波時(shí)間對(duì)色素提取的影響，通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)對(duì)上述條件進(jìn)行了優(yōu)化，優(yōu)化后的提取工藝條件為：乙醇濃度60%，料液比1∶50（g/m L），微波功率500W，微波時(shí)間60s。抑菌活性實(shí)驗(yàn)表明，山楂皮紅色素對(duì)表皮葡萄球菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、傷寒桿菌均有一定的抑制作用。從山楂皮中提取得到的紅色素安全、無(wú)毒副作用，可用于食品、藥品和化妝品等多方面，具有良好的市場(chǎng)開發(fā)應(yīng)用前景。

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Study on extraction and antibacterial activity of the red pigment fromCrataegus jingxiensis Li peel

LIRong，QIN Tao，LIANG Rong-shan，YIN Jian-hua，HUANG Zu-liang*
（Youjiang Medical University for Nationalities，Baise 533000，China）

Studied the best condition for the extraction of the red pigment from the Crataegus jingxiensis Li peelthrough microwave -assisted technology，and investigated the influence of alcohol concentration，liquid ratio，microwave power，microwave minute on the extraction of the pigment. In the whole process of the experiment，the above conditions were optimized by the orthogonal experiment. Antibacterial activities of red pigment weredetermined by paper disk diffusion. Results showed that the best conditions for the extraction of the redpigment from the Crataegus jingxiensis Li peel were as follows:alcohol concentration 60％，liquid ratio 1∶50（g/mL），microwave power 500W，microwave minute 60s and extraction twice. The results of the antibacterial experimentsshowed that the red pigment had certain inhibitory effect on Staphylococcus aureus ， Staphylococcusepidermidis，Escherichia coli and Salmonella enterica.

Crataegus jingxiensis Li；peel；extraction；pigment；antibac terialactivities

TS255.1

B

1002-0306（2015）08-0226-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.08.039

2014－08－01

李容（1981-），女，碩士，講師，研究方向：天然產(chǎn)物有效成分提取分離及活性研究。

*通訊作者：黃祖良（1965-），男，本科，教授，研究方向：中草藥有效成分及活性研究。

廣西百色市科學(xué)研究與技術(shù)開發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（20121402）；校級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（XJCXB20l414）。