高產(chǎn)阿魏酸酯酶菌株的篩選及其產(chǎn)酶條件優(yōu)化

陳 錦，胡茂豐，吳章華，劉素純，4，*

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙410128；2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙410128；3.長(zhǎng)沙市調(diào)料食品工程技術(shù)研究中心，湖南長(zhǎng)沙410000；4.食品科學(xué)與生物技術(shù)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南長(zhǎng)沙410128）

高產(chǎn)阿魏酸酯酶菌株的篩選及其產(chǎn)酶條件優(yōu)化

陳 錦1，胡茂豐2，吳章華3，劉素純1，4，*

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙410128；2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙410128；3.長(zhǎng)沙市調(diào)料食品工程技術(shù)研究中心，湖南長(zhǎng)沙410000；4.食品科學(xué)與生物技術(shù)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南長(zhǎng)沙410128）

通過初篩、復(fù)篩從茯磚茶中篩選到了1株產(chǎn)阿魏酸酯酶活力較高的菌株，經(jīng)個(gè)體形態(tài)和菌落特征初步鑒定其為冠突散囊菌；以阿魏酸酯酶酶活為衡量指標(biāo)，選取黑毛茶含水量、接種量、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時(shí)間為因子，研究確定篩選出來(lái)的冠突散囊菌進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵黑毛茶的產(chǎn)酶條件。結(jié)果表明：黑毛茶固態(tài)發(fā)酵實(shí)驗(yàn)中，黑毛茶含水量26%，接種量1‰，溫度30℃條件下培養(yǎng)4d，其酶活力最高可以達(dá)到142mU/g。

阿魏酸酯酶，酶活，發(fā)酵型茶，冠突散囊菌，篩選

茯磚茶是具有濃郁地方特色的中國(guó)傳統(tǒng)茶類之一，屬于“后發(fā)酵茶”，有其獨(dú)特的品質(zhì)風(fēng)味，深受人們喜愛。微生物在其渥堆過程中起到關(guān)鍵作用，Green walt［1］研究表明經(jīng)微生物發(fā)酵后的茶比綠茶具有更高的生物活性，這種活性主要來(lái)源于酚酸類物質(zhì)。阿魏酸是桂皮酸的衍生物，是普遍存在的一種酚酸，具有抗氧化［2］、抗血栓［3］、降血脂［4］、抗菌消炎［5］以及抗突變防癌［6］等功能。阿魏酸酯酶（FAE）是酸羧酸酯水解的一個(gè)亞類，屬胞外酶，能水解阿魏酸甲酯、低聚糖阿魏酸酯酸和多糖中的酯鍵，將阿魏酸游離出來(lái)，真菌、細(xì)菌和酵母都能分泌阿魏酸酯酶［7］。各種微生物分泌的阿魏酸酯酶，在氨基酸序列、肽鍵的結(jié)構(gòu)、物化性質(zhì)和催化特性上都有所不同。但目前，由真菌分泌的阿魏酸酯酶受到研究者的關(guān)注較多。國(guó)內(nèi)外大多集中在黑曲霉（Aspergillusniger）、米曲霉（Aspergillus oryzae）、嗜松青霉（Penicillium pinophilum）等的研究上［8］，而發(fā)酵原料也主要以甘蔗渣、麥麩為主，國(guó)內(nèi)目前還未見茯磚茶中微生物產(chǎn)阿魏酸酯酶的報(bào)道。筆者從茯磚茶中篩選出一株高產(chǎn)阿魏酸酯酶菌株，通過菌落形態(tài)和個(gè)體形態(tài)初步鑒定為冠突散囊菌，并通過實(shí)驗(yàn)對(duì)該菌株的固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)阿魏酸的培養(yǎng)條件進(jìn)行了研究，希望能為生產(chǎn)實(shí)踐提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

菌種篩選茶葉樣本 湖南黑茶市場(chǎng)所購(gòu)得湘益茯磚茶，湖南益陽(yáng)茶廠有限公司，中藥粉碎機(jī)粉碎過100目篩后于陰涼處避光保存；產(chǎn)酶條件優(yōu)化實(shí)驗(yàn)所用原料 湖南黑茶市場(chǎng)所購(gòu)黑毛茶原料，中藥粉碎機(jī)粉碎過100目篩后，備用。

FW 135中藥粉碎機(jī) 天津市泰斯特儀器有限公司；SW-CJ-2G雙人單面凈化工作臺(tái) 江蘇通凈凈化設(shè)備有限公司；DNP恒溫培養(yǎng)箱 上海精宏儀器設(shè)備有限公司；BCD-206BD電冰箱 青島海爾有限公司；TE214S分析天平 長(zhǎng)沙康源科技開發(fā)有限公司；LDZX-50KBS高壓滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠；UV-1601紫外可見分光光度計(jì) 北京瑞利分析儀器有限公司；CF-RXⅡ離心機(jī) 日本日立公司；CG-3015A光學(xué)顯微鏡 上海普光光學(xué)儀器廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)基的配制

1.2.1.1 菌種分離培養(yǎng)基（PDA） 馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂20g，水1000m L，pH 6.8［9］。

1.2.1.2 初篩培養(yǎng)基 FeSO4·7H2O 0.01g，NaNO32.0g，KCl 0.5g，MgSO4·7H2O 0.5g，K2HPO41.0g，蔗糖30g，瓊脂20g，蒸餾水1L，pH自然；121℃滅菌20m in。每個(gè)平板倒入約20m L培養(yǎng)基后，立即加入0.3m L無(wú)菌的含阿魏酸乙酯的二甲基甲酰胺溶液（質(zhì)量體積比為10%），搖勻至平板呈均勻的乳白色［10］。

1.2.1.3 復(fù)篩培養(yǎng)基（發(fā)酵培養(yǎng)基） FeSO4·7H2O 0.01g，NaNO32.0g，KCl0.5g，K2HPO40.76g，MgSO4·7H2O 0.5g，蒸餾水1L，pH 6.8，取50m L培養(yǎng)基，1g黑毛茶于250m L三角瓶中，于121℃滅菌20min。將培養(yǎng)24h的種子液按體積比為4%的接種量接種到50m L發(fā)酵培養(yǎng)基中，于30℃，180r·min-1下培養(yǎng)3d［11］。

1.2.2 菌種的篩選與鑒定 將茶葉樣品湘益茯磚茶用中藥粉碎機(jī)粉碎至100目過篩后，稱取粉碎后的樣品25g，放置在含225m L無(wú)菌生理水與玻璃珠的500m L三角瓶?jī)?nèi)，蓋上封口膜，在振蕩儀上200r·min-1振搖30m in，使其中微生物充分分散，制成10-1倍樣品稀釋液。在超凈工作臺(tái)上用梯度稀釋法得到10-2、10-3、10-4、10-5、10-6倍樣品稀釋液，取10-4、10-5、10-6三個(gè)稀釋度樣液各1m L涂布于改良PDA，放置在28℃培養(yǎng)箱內(nèi)倒置培養(yǎng)2d。

分離純化后的單菌落接種到初篩培養(yǎng)基的平板上，于30℃培養(yǎng)5d；然后將產(chǎn)生透明圈的菌落用劃線分離的方法再一次接種于初篩培養(yǎng)基的平板上，培養(yǎng)4d得到純菌落平板。最后，從純化后的平板上選取1株透明圈最大的菌種，接種于50m L的PDA種子培養(yǎng)基，于30℃培養(yǎng)1d后以體積比為4%的接種量接于50m L復(fù)篩培養(yǎng)基中，于30℃培養(yǎng)7d，每24h取樣1次測(cè)定酶活。在馬鈴薯瓊脂平板上培養(yǎng)菌株，觀察菌落培養(yǎng)特征和顯微形態(tài)，依照《食品微生物學(xué)標(biāo)準(zhǔn)鑒定圖譜》［12］以及《中國(guó)真菌志》［13］對(duì)其進(jìn)行鑒定。

1.2.3 固態(tài)發(fā)酵劑的制備 15g粉碎后的黑毛茶加水10m L充分混勻于三角瓶中121℃滅菌20m in，接種，30℃培養(yǎng)3d后開始每4h檢測(cè)，稱取1g干燥后的發(fā)酵產(chǎn)物，加入90m L無(wú)菌水振蕩10m in，用三層紗布過濾，濾液制成孢子懸浮液，用血球計(jì)數(shù)板倍量稀釋法鏡檢其孢子量，每處理設(shè)5個(gè)重復(fù)，直至孢子量達(dá)到1010CFU/g，32℃干燥5h制成固體發(fā)酵劑。

1.2.4 阿魏酸酯酶產(chǎn)酶條件的確定

1.2.4.1 接種量的確定 15g黑毛茶加水10m L充分混勻于三角瓶中滅菌，固體發(fā)酵劑接種量為0.4‰、0.6‰、0.8‰、1.0‰、1.2‰、1.4‰，在1.2.4.1的溫度結(jié)果下培養(yǎng)4d，測(cè)定阿魏酸酶活力。

1.2.4.2 溫度的確定 15g黑毛茶加水10m L充分混勻于三角瓶中滅菌，接種0.8‰固體發(fā)酵劑至滅菌的黑毛茶上，于24、26、28、30、32、34℃培養(yǎng)4d，測(cè)其阿魏酸酯酶酶活變化。

1.2.4.3 黑毛茶含水量的確定 取干燥的黑毛茶添加蒸餾水至含水量分別為14%、18%、22%、26%、30%、34%，各取15g于6個(gè)三角瓶中滅菌，在1.2.4.1～1.2.4.2的結(jié)果下培養(yǎng)4d，測(cè)定阿魏酸酶活力。

1.2.4.4 發(fā)酵時(shí)間的確定 在1.2.4.1～1.2.4.3的結(jié)果下培養(yǎng)2、3、4、5、6、7d，測(cè)其阿魏酸酯酶酶活變化。

1.2.5 粗酶液的制備 加入75m L去離子水，于40℃水浴鍋中浸提1h，再在70℃下浸提1h，于10000r·m in-1離心15min，上清液即為粗酶液。

1.2.6 阿魏酸酶活力的測(cè)定 阿魏酸酯酶的酶活定義：在50℃，pH為6.0的條件下，每分鐘酶解阿魏酸乙酯，生成1μmol阿魏酸所需的酶量。

取250μL粗酶液于2m L離心管中，于50℃保溫5m in；然后，加入250μL一定濃度的阿魏酸乙酯溶液，反應(yīng)10min，再加入體積比為10%的500μL的冰乙酸終止反應(yīng)。空白樣品為煮沸失活的發(fā)酵上清液，處理方法同上?？瞻讟悠分斜宜嵩诜磻?yīng)前加入，其他處理同上。樣品離心后于4℃保存。取250μL上清酶液于離心管中，再加入去離子水1750μL，再用紫外分光光度計(jì)測(cè)定314nm條件下樣品的吸光度［14］。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌種篩選

2.1.1 菌種初篩實(shí)驗(yàn) 從茶葉樣品中篩選出菌落生長(zhǎng)快、透明圈大的菌株13株，包括5株真菌和8株細(xì)菌，初篩結(jié)果見圖1和圖2。

圖1 初篩試驗(yàn)結(jié)果（真菌）Fig.1 Screening test result（Fungus）

如圖1～圖2所示，圖1中真菌F1、F2的透明圈直徑明顯大于F3、F4、F5，阿魏酸酯酶酶活較高；圖2中細(xì)菌B3、B7的透明圈直徑明顯大于B1、B2、B4、B5、B6、B8，產(chǎn)阿魏酸酯酶較多，故選擇初篩結(jié)果較好的2株真菌和2株細(xì)菌進(jìn)行復(fù)篩實(shí)驗(yàn)。

圖2 初篩試驗(yàn)結(jié)果（細(xì)菌）Fig.2 Screening test result（Bacteria）

2.1.2 阿魏酸標(biāo)準(zhǔn)曲線制作及線性關(guān)系考察 以阿魏酸濃度（μg/m L）為橫坐標(biāo)，吸光度值A(chǔ)為縱坐標(biāo)做標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見圖3，回歸方程y=0.0811x+0.0113，R2=0.9993。

圖3 阿魏酸標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3 Standard curve of FEA

2.1.3 菌種復(fù)篩實(shí)驗(yàn) 將初篩所得的2株真菌和2株細(xì)菌進(jìn)行分離純化，再進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)酶實(shí)驗(yàn)即復(fù)篩實(shí)驗(yàn)，測(cè)定其阿魏酸酯酶酶活，結(jié)果見圖4。

圖4 復(fù)篩試驗(yàn)結(jié)果Fig.4 Result of second screening

從復(fù)篩實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，F(xiàn)2菌株固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)阿魏酸酯酶酶活相對(duì)較高，可達(dá)130mU/g，明顯高于其他菌株酶活水平。因此，選取F2菌株進(jìn)行鑒定并優(yōu)化其產(chǎn)酶條件。

2.1.4 菌株初步鑒定 阿魏酸酯酶活力較高的菌株F2在馬鈴薯培養(yǎng)基上生長(zhǎng)3d后菌落直徑達(dá)5～10mm，呈淡黃色；5d后，直徑達(dá)12～16mm，周邊淡黃色，內(nèi)部顏色稍深，呈黃色；10d后見圖5，直徑達(dá)18～22mm，菌落邊緣呈淡黃色，接近于橄欖淺黃色，內(nèi)部顏色較深，近于橄欖褐至丁香褐色，老后變成褐色；21d后，直徑達(dá)20～25mm，顏色全部變成褐色，菌落周圍的培養(yǎng)基呈黑褐色。這與溫瓊英［15］觀察的冠突散囊菌的菌落形態(tài)變化結(jié)果一致。

圖5 純化后PDA培養(yǎng)基上菌落形態(tài)Fig.5 Colonymorphology on the PDA plate after Purification

圖6 菌株個(gè)體形態(tài)圖Fig.6 Individualmorphology figure of the strain

菌株的個(gè)體形態(tài)中（圖6）可以看出，分生孢子頭輻射狀，灰綠色，分生孢子梗壁光滑，頂囊近球形，表面粗糙具小刺，與《中國(guó)真菌志》［13］中冠突散囊菌的個(gè)體形態(tài)描述相符。綜上所述，可初步鑒定菌株F2為冠突散囊菌。

2.2 阿魏酸酯酶產(chǎn)酶條件的確定

圖7 接種量對(duì)產(chǎn)酶的影響Fig.7 Effects of bacteria concentration on FAE

2.2.1 接種量的確定 接種量對(duì)產(chǎn)酶量的影響如圖7所示，從圖7中可以看出，隨著菌體濃度的增多，阿魏酸酯酶的產(chǎn)量也隨著增加，當(dāng)接種量高為1‰，酶活達(dá)到129mU/g，之后隨接種量增加產(chǎn)酶量已無(wú)明顯增加。出現(xiàn)這一結(jié)果的原因可能是由于微生物生長(zhǎng)繁殖到一定數(shù)量后，黑毛茶的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)有限，菌體的代謝產(chǎn)物堆積，抑制了菌體的繼續(xù)大量增殖。

2.2.2 培養(yǎng)溫度對(duì)阿魏酸酯酶產(chǎn)酶量的影響 考察溫度對(duì)產(chǎn)酶量的影響，如圖8所示，培養(yǎng)溫度在28～32℃之間酶的活性較強(qiáng)，這是由于28～32℃是該菌株的最適宜生長(zhǎng)溫度，即在此條件下，酶活較高，產(chǎn)酶能力也比較強(qiáng)，其中30℃時(shí)阿魏酸酯酶活性136mU/g，因此確定培養(yǎng)溫度為30℃。

圖8 培養(yǎng)溫度對(duì)產(chǎn)酶的影響Fig.8 Effect of cultivation temperature on feruloyl esterase production

2.2.3 黑毛茶含水量對(duì)阿魏酸酯酶產(chǎn)酶量的影響 考察黑毛茶含水量對(duì)產(chǎn)酶量的影響，由圖9可以看出，黑毛茶中加水量對(duì)產(chǎn)酶影響較為明顯，當(dāng)含水量達(dá)到26%時(shí)，產(chǎn)酶量最大，隨后逐漸減少，這可能是因?yàn)楹繉?duì)供氧量及黑毛茶中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的濃度有一定影響，從而影響菌體的生長(zhǎng)。因此，確定含水量為26%。

圖9 黑毛茶含水量對(duì)產(chǎn)酶的影響Fig.9 Influence of black primarytea moisture content on the enzyme production

2.2.4 發(fā)酵產(chǎn)酶的時(shí)間對(duì)產(chǎn)酶量的影響 該菌株產(chǎn)酶的時(shí)間對(duì)產(chǎn)酶量的影響如圖10所示。從圖10可知，發(fā)酵酶活以每天10%左右的速度增長(zhǎng)，培養(yǎng)至第4d達(dá)到最高，之后開始有所下降。這與微生物典型的生長(zhǎng)曲線相吻合，可能是由于隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，菌體數(shù)量開始增長(zhǎng)，到達(dá)穩(wěn)定期后菌體數(shù)量開始減少，酶活自然降低。由此確定4d為產(chǎn)酶時(shí)間，酶活性可達(dá)142mU/g。

圖10 發(fā)酵時(shí)間對(duì)產(chǎn)酶量的影響Fig.10 Effect of fermentation time on the quantity of enzyme production

3 結(jié)論

通過梯度稀釋的方法從茶葉中篩選到能產(chǎn)生透明圈，即阿魏酸酯酶酶活性較高的菌株13株，通過復(fù)篩實(shí)驗(yàn)后獲得高產(chǎn)阿魏酸酯酶的菌株F2，由菌落形態(tài)和個(gè)體形態(tài)特征初步鑒定為冠突散囊菌，并通過單因素實(shí)驗(yàn)確定了發(fā)酵黑毛茶產(chǎn)阿魏酸酯酶的條件：接種量為1‰，培養(yǎng)溫度30℃，黑毛茶含水量26%，培養(yǎng)4d，此時(shí)阿魏酸酯酶酶活可達(dá)142mU/g。

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Selection of high-yield ferulic acid esterase strain and optimization of enzyme production conditions

CHEN Jin1，HU Mao-feng2，WU Zhang-hua3，LIU Su-chun1，4，*
（1.College of Food Science and technology Hunan Agricultural University，Changsha 410128，China；2.College of Bioscience and Biotechnology Hunan Agricultural University，Changsha 410128，China；3.Changsha Seasoning Food Engineering Technology Research Center，Changsha 410000，China；4.Hunan Key Laboratories of Food Science and Biotechnology，Changsha 410128，China）

Through preliminary and secondary screening，a strains with high enzyme activity which could produceferuloyl esterase was screened out from Fu-brick tea，according to its individual and colony characteristics，itwas identified as Eurotium cristatum. Feruloyl esterase enzyme activity was used as measurable indicator，watercontent，inoculums-size，temperature and time was chosen as variables，the solid-state fermentation conditionsof chosen Eurotium cristatum were optimized. The results showed that black primarytea the optimal conditionwas 1‰ inoculums size，26％moisture content and cultivated at 30℃ for 4 days，the highest enzyme activityreached 142mU/g in the black Maocha solid-state fermentation experiment.

ferulic acid esterase；activity；fermented tea；Eurotium cristatum；screening

TS201.1

A

1002-0306（2015）08-0218-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.08.037

2014－11－26

陳錦（1989-），女，碩士研究生，研究方向：營(yíng)養(yǎng)與食品衛(wèi)生學(xué)。

*通訊作者：劉素純（1966-），女，博士，教授，研究方向：營(yíng)養(yǎng)與食品衛(wèi)生學(xué)。

湖南省科技計(jì)劃項(xiàng)目（2012NK3072）。