響應(yīng)面法優(yōu)化荸薺淀粉酶解工藝及動(dòng)力學(xué)研究

高義霞，路興旺，吳亞楠

（天水師范學(xué)院生命科學(xué)與化學(xué)學(xué)院，甘肅天水741001）

響應(yīng)面法優(yōu)化荸薺淀粉酶解工藝及動(dòng)力學(xué)研究

高義霞，路興旺，吳亞楠

（天水師范學(xué)院生命科學(xué)與化學(xué)學(xué)院，甘肅天水741001）

以葡萄糖當(dāng)量值（DE）為考察指標(biāo)，利用單因素和響應(yīng)面法對(duì)α-淀粉酶酶解荸薺淀粉工藝進(jìn)行優(yōu)化，并計(jì)算相應(yīng)酶解動(dòng)力學(xué)參數(shù)。結(jié)果表明：α-淀粉酶酶解荸薺淀粉優(yōu)化工藝為：時(shí)間88min、溫度53℃、E/S=0.12U/mg和pH7.7。在此條件下，驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)DE為（53.393%±0.899%）。在pH7.0，60℃條件下，Km=47.298mg/mL，Vmax=0.335mg/（mL·min），Ea= 11.995kJ/mol，△H=71.882kJ/mol。

荸薺，酶解，動(dòng)力學(xué)，響應(yīng)面

荸薺（Eleocharis tuberosa），又稱馬蹄、地栗等，為莎草科荸薺屬多年水生或沼生果蔬植物［1］。荸薺淀粉含量高、粘性強(qiáng)、回生溫度低、透明度和膨脹度好［2］，有“地下雪梨”和“江南人參”的美譽(yù)［3］。利用非糧淀粉質(zhì)原料生產(chǎn)燃料乙醇，符合國(guó)家生物質(zhì)能源戰(zhàn)略［4-5］，因此，對(duì)其酶解工藝進(jìn)行優(yōu)化具有重要的實(shí)踐意義。另外，由于影響淀粉糖生產(chǎn)效率和產(chǎn)品品質(zhì)的因素有酶類型、離子強(qiáng)度、淀粉種類和濃度、pH和溫度等，故常規(guī)的米氏方程難以真實(shí)描述反應(yīng)過程［6］。探討酶解動(dòng)力學(xué)過程各參數(shù)，有助于加深對(duì)影響該過程的因素的理解和控制，以更充分發(fā)揮酶的催化作用，因而在生產(chǎn)實(shí)踐中具有指導(dǎo)意義。國(guó)內(nèi)外有關(guān)玉米、小麥、甘薯、木薯及馬鈴薯等酶解工藝的研究較多［7］，但對(duì)酶解動(dòng)力學(xué)研究不足，且不同來源的淀粉，其性質(zhì)差異較大。本實(shí)驗(yàn)以時(shí)間、溫度、E/S及pH為因素，通過響應(yīng)面法優(yōu)化α-淀粉酶酶解荸薺淀粉工藝，同時(shí)對(duì)酶解動(dòng)力學(xué)進(jìn)行研究，為荸薺淀粉資源的進(jìn)一步開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

荸薺淀粉 購自平樂宏源農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司，淀粉含量為（75.875%±0.941%，n=6）；α-淀粉酶 為Sigma產(chǎn)品（58.7U/mg）；酒石酸鉀鈉、氫氧化鈉、3，5-二硝基水楊酸、亞硫酸氫鈉、苯酚、葡萄糖等 均為分析純。

AL204型電子天平 梅特勒-托利多儀器有限公司；TGL-20M型高速冷凍離心機(jī) 湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司；PHS-3D雷磁pH計(jì) 上海精密科學(xué)有限公司；722型可見分光光度計(jì) 上海欣茂有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 參考3，5-二硝基水楊酸（DNS）法［8］。Y=2.633X-0.091，r=0.994（X為葡萄糖質(zhì)量，mg；Y為OD）。

1.2.2 單因素實(shí)驗(yàn) 稱取荸薺淀粉，加20m L pH7.0的磷酸緩沖液，80℃糊化5m in。冷卻，按E/S=0.02U/mg加入α-淀粉酶，混勻，100m in后迅速沸水浴滅活5m in，測(cè)定吸光值，計(jì)算葡萄糖當(dāng)量值（DE）。

DE（%）=葡萄糖量（mg）×100/淀粉（mg）。

式中：m為葡萄糖質(zhì)量（mg）；V為酶解液測(cè)定體積（m L）；t為反應(yīng)時(shí)間（min）。

1.2.2.1 時(shí)間對(duì)DE的影響 在pH 6.0、E/S=0.02U/mg、溫度50℃條件下，分別測(cè)定時(shí)間為10、20、40、60、80、100、120、150、180m in時(shí)DE，探討時(shí)間對(duì)其影響。

1.2.2.2 溫度對(duì)DE的影響 在pH 6.0、E/S=0.02U/mg、時(shí)間100m in條件下，分別測(cè)定溫度為30、40、50、60、70℃時(shí)DE，探討溫度對(duì)其影響。

1.2.2.3 E/S對(duì)DE的影響 在pH 6.0、時(shí)間100m in、溫度60℃條件下，分別測(cè)定E/S為0.005、0.01、0.02、0.04、0.08、0.16U/mg時(shí)DE，探討E/S對(duì)其影響。

1.2.2.4 pH對(duì)DE的影響 在時(shí)間100m in、溫度60℃、E/S=0.08U/mg條件下，分別測(cè)定pH為4、5、6、7、8時(shí)DE，探討pH對(duì)其影響。

1.2.3 響應(yīng)面法優(yōu)化酶解工藝 在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，參考李艷紅［9］，以時(shí)間、溫度、E/S及pH為因子，單因素實(shí)驗(yàn)各因子最優(yōu)點(diǎn)為基準(zhǔn)點(diǎn)，確定適度步長(zhǎng)，DE為響應(yīng)值，利用Design-Expert 8.06中Box-Behnken法設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，見表1。

表1 Box-Benhnken實(shí)驗(yàn)因素水平及編碼Table 1 Level and code of variables for Box-Benhnken design

1.2.4 酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)模型 Michaelis和Menten根據(jù)快速平衡學(xué)說建立米氏方程，Briggs和Haldane用穩(wěn)態(tài)代替快速平衡態(tài)，對(duì)米氏方程做了修正，得到更合理的酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)過程［10］。在30～50℃范圍內(nèi)，以lnv對(duì)1/T（×103）擬合：lnK3=式（2）

式中：R為氣體常數(shù)8.31J（/mol·K）；Ea為活化能（kJ·mol）；B為積分常數(shù)。

將公式（2）寫成指數(shù)形式，K3=A×exp（-Ea/RT），A為前指因子［mg（/m L·m in）］。求得Ea。

平衡常數(shù)Ks與溫度T服從范特柯夫方程：lnKs=-△H/RT+lnC式（3），當(dāng)K3≥K2時(shí)，Ks≈Km，在30～45℃范圍內(nèi)，以不同溫度下Km與1/T回歸［11］，求得△H。

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用Origin 7.5作圖，Design-Expert 8.06進(jìn)行響應(yīng)面分析，單因素方差分析采用Excel 2003（p＜0.01），數(shù)據(jù)重復(fù)3次，以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 時(shí)間對(duì)DE的影響 由圖1可知，在0～100m in范圍內(nèi)，DE隨時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，隨后趨于平穩(wěn)，甚至緩慢下降，原因可能是開始時(shí)淀粉被水解釋放大量葡萄糖，但當(dāng)DE達(dá)到28%以上時(shí)，葡萄糖重新結(jié)合生成異麥芽糖等復(fù)合糖，復(fù)合糖生成速率逐漸超過淀粉水解速率，出現(xiàn)較弱的復(fù)合反應(yīng)［12］。同時(shí)，淀粉濃度降低、產(chǎn)物濃度增加加速了逆反應(yīng)的進(jìn)行、產(chǎn)物還原糖對(duì)酶促反應(yīng)的抑制作用和隨時(shí)間的延長(zhǎng)酶分子失活［13-14］等因素，使DE不斷減少，因此，時(shí)間選擇100min。

圖1 時(shí)間對(duì)DE的影響Fig.1 Effect of time on DE

2.1.2 溫度對(duì)DE的影響 由圖2可知，在30～50℃范圍內(nèi)，DE先急劇增加，隨后趨于平緩；在50～70℃范圍內(nèi)，DE先增大，并在60～70℃范圍內(nèi)接近最大值。因此，溫度選擇60～70℃。

圖2 溫度對(duì)DE的影響Fig.2 Effect of temperature on DE

2.1.3 E/S對(duì)DE的影響 由圖3可知，反應(yīng)初期，隨E/S的增大，DE迅速增加，原因是開始時(shí)底物過量，酶促反應(yīng)速率與酶量成正比，隨反應(yīng)的進(jìn)行，底物成為限制因子，因而反應(yīng)速率不再增加，甚至出現(xiàn)下降趨勢(shì)［15］，故DE下降，E/S選擇0.08U/mg。

圖3 E/S對(duì)DE的影響Fig.3 Effect of E/Son DE

2.1.4 pH對(duì)DE的影響 由圖4可知，pH可影響酶分子活性中心上必需基團(tuán)的離子化程度，也可影響底物的解離程度，從而影響酶與底物的結(jié)合［16］。在pH 6.0～7.0范圍內(nèi)，DE接近最大值，因此pH選擇6.0～7.0。

圖4 pH對(duì)DE的影響Fig.4 Effect of pH on DE

2.2 響應(yīng)面分析

Box-Benhnken設(shè)計(jì)和結(jié)果及方差分析見表2和表3。模型（p＜0.0001），極顯著，失擬項(xiàng)p=0.2042＞ 0.05，不顯著，說明殘差由隨機(jī)誤差引起，該模型穩(wěn)定。R2=0.949＞90%，該模型與實(shí)驗(yàn)擬合良好，自變量與響應(yīng)值線性顯著，可用于該工藝的分析和預(yù)測(cè)［17］。

表2 Box-Benhnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)表及結(jié)果Table 2 Box-Benhnken designmatrix and experimental results

表3 回歸模型系數(shù)顯著性檢驗(yàn)及其方差分析Table 3 Significance test of regression coefficientand its variance analysis

溫度（X2）的p＜0.0001，表明其對(duì)DE影響極顯著；時(shí)間（X1）及pH（X4）的p＜0.05，影響顯著；E/S（X3）的p＞ 0.05，影響不顯著。二次項(xiàng)影響極顯著，其余均影響不顯著。交互項(xiàng)X2X4影響顯著，其余均不顯著。去掉不顯著項(xiàng)，得到的優(yōu)化方程為Y=49.26+2.44X1-

最優(yōu)工藝為：時(shí)間88m in、溫度53℃、E/S=0.12U/mg和pH7.7，預(yù)測(cè)DE可達(dá)56.518%。驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)平均值為（53.393%±0.899%，n=6），RSD=1.684%，可用于荸薺淀粉酶解工藝的優(yōu)化。

2.3 Lineweaver-Buck法求酶解參數(shù)

以葡萄糖濃度（mg/m L）為縱坐標(biāo)，時(shí)間（min）為橫坐標(biāo)［18］，在1～25min內(nèi)，Y=0.059X+0.109，r=0.999，故酶解動(dòng)力學(xué)測(cè)定選擇25m in。以1/V-1/S作圖，1/V= 2.985+141.181/S，r=0.996，求得Vmax=0.335mg/（m L·m in），Km=47.298mg/m L。

2.4 Ea及△H計(jì)算

在30～50℃范圍內(nèi)，以lnv對(duì)1/T（×103）作圖，見圖5，lnK3=0.91-1.443/T，r=0.975，求得Ea=11.995kJ/moL，A=2.483mg/（m L·m in）。在30～45℃范圍內(nèi)，以不同溫度下Km與1/T回歸，見圖6，lnKs=28.684-8.65/T，r=0.929，△H=71.882k J/mol。

Enzymolysis technologies and kinetics of Chinese water chestnut（Eleocharis tuberosa）with response surface method

GAO Yi-xia，LU Xing-wang，WU Ya-nan
（College of Life Science and Chemistry，Tianshui Normal University，Tianshui741001，China）

With dextrose equivalent value（DE）as an index，response surface method was used to investigate the optimum enzymolysis technologies of Chinese water chestnut（Eleocharis tuberosa）starch by alpha-am ylase based on single experiment，and its corresponding kinetics parameters were also established.The results indicated that the optimal technologies were time 88m in，temperature 53℃，E/S=0.12U/mg and pH7.7.The verification results of DE reached（53.393%±0.899%）under above conditions.Under pH7.0 and temperature 60℃，Kmand Vmaxwere 47.298mg/m L and 0.335mg/（m L·m in），respec tively，Eaand△H were 11.995kJ/moland 71.882kJ/mol，respectively.

Chinese water chestunt；enzymolysis；kinetics；response surface method

TS201.1

A

1002-0306（2015）08-0215-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.08.036

2014－08－12

高義霞（1982-），女，碩士研究生，講師，主要從事食品化學(xué)方面的研究。

天水師范學(xué)院“青藍(lán)人才”資助（TS201406）。