高產(chǎn)納豆激酶的枯草芽孢桿菌優(yōu)選及發(fā)酵工藝條件優(yōu)化

張 杰，葛武鵬，*，張 靜，陳 瑛，吳曉勇

（1．西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西楊凌712100；2.陜西省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局，陜西西安710068；3.咸陽市食藥局檢測中心，陜西咸陽712000）

高產(chǎn)納豆激酶的枯草芽孢桿菌優(yōu)選及發(fā)酵工藝條件優(yōu)化

張 杰1，葛武鵬1，*，張 靜1，陳 瑛2，吳曉勇3

（1．西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西楊凌712100；2.陜西省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局，陜西西安710068；3.咸陽市食藥局檢測中心，陜西咸陽712000）

以黃豆為主料，添加不同輔料，采用不同處理方式，以產(chǎn)酶活力為指標研究三株枯草芽孢桿菌發(fā)酵性能，篩選優(yōu)勢菌株進行固態(tài)發(fā)酵，確定最優(yōu)工藝條件。結(jié)果表明：在三株受試菌種中BS21076發(fā)酵性能最優(yōu)，活菌數(shù)及納豆激酶活力均較高；最優(yōu)固態(tài)發(fā)酵條件為：大豆90℃下烘炒5min，破碎度為四瓣，魔芋精粉添加量3%，接種量為8%，37℃下發(fā)酵24h；在此條件下，酶活力可達（3582.48±83.13）U/g，較傳統(tǒng)發(fā)酵NK活力極顯著（p＜0.01）提高。

納豆激酶，枯草芽孢桿菌，工藝優(yōu)化

納豆（Natto）作為日本一種具有一千多年歷史的傳統(tǒng)食品，其營養(yǎng)與活性物質(zhì)使納豆在食用中具有多種醫(yī)療保健功能［1-3］，并被作為藥食兼用的健康食品，受到日本民間的厚愛［4］。經(jīng)常食用納豆可預(yù)防或治療多種亞健康體質(zhì)長期積累引起的疾病［5］。納豆激酶（Nattokinase，NK）為發(fā)酵食品納豆中提取出的一種單鏈多肽酶［6-7］，其功能特性已得到大量文獻證實，主要表現(xiàn)為溶栓作用［8-9］，同時兼具安全性好、成本低、作用迅速、經(jīng)口服后可迅速入血［10］及在胃腸的穩(wěn)定性好等優(yōu)點［11-13］。納豆激酶作為一種微生物代謝產(chǎn)物具有廣闊的開發(fā)應(yīng)用前景［14］，當(dāng)前已有較多關(guān)于固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)納豆激酶工藝條件研究的報道［15-18］，并且已有相關(guān)產(chǎn)品面世。

目前，對于納豆及其相關(guān)產(chǎn)品的研究日本處于領(lǐng)先地位，其既有富含枯草芽孢桿菌的納豆制品，又有納豆激酶富集純化的相關(guān)產(chǎn)品。而我國雖有大量相關(guān)研究，但在整體水平上仍有待提高，主要表現(xiàn)為枯草芽孢桿菌活菌數(shù)不高，納豆激酶活力偏低，至今未有突破性進展。本研究在傳統(tǒng)發(fā)酵技術(shù)上，結(jié)合前人研究成果，通過對大豆原料的優(yōu)化處理，并添加不同輔助材料，以高產(chǎn)納豆激酶為目標優(yōu)選高產(chǎn)菌株，同時對固態(tài)發(fā)酵條件進行優(yōu)化，以期得到工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)高活性的納豆激酶的工藝條件，為相關(guān)產(chǎn)品開發(fā)提供支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

三株受試菌 購自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，分別為BS10458（枯草芽孢桿菌）、BS20639（枯草芽孢桿菌枯草亞種）及BS21076（枯草芽孢桿菌枯草亞種）；尿激酶 購自北京雅安達生物技術(shù)有限公司；凝血酶（1000U/支）、牛纖維蛋白原 購自Sigma公司；其余試劑 均為分析純。

101-1型干燥箱 上海市實驗儀器總廠；DRP-9162電熱恒溫培養(yǎng)箱、DK-S26型電熱恒溫水浴鍋上海森信實驗儀器有限公司；BCD-200（KK20V51TI）冰箱 博西華家用電器有限公司；SW-CJ-2D型（實用垂直新穎）雙人凈化工作臺 蘇州凈化設(shè)備有限公司；ES-315高壓蒸汽殺菌鍋 上海博迅實業(yè)有限公司；FA2004型電子天平 長沙湘平科技發(fā)展有限公司；精密pH儀 德國賽多利斯股份公司；SPH-200B搖床 西安禾普生物科技有限公司；HC-3018高速離心機 安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司。

1.2 菌種培養(yǎng)基

液體培養(yǎng)基：蛋白胨5.0g，牛肉膏3.0g，NaCl 5.0g，蒸餾水1.0L，pH 7.0。

斜面培養(yǎng)基：蛋白胨5.0g，牛肉膏3.0g，NaCl 5.0g，瓊脂15.0g，蒸餾水1.0L，pH7.0。

1.3 實驗方法

1.3.1 斜面培養(yǎng) 將保藏的菌種轉(zhuǎn)接至斜面培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24h。

1.3.2 種子液的制備 用接種環(huán)挑取斜面菌種兩環(huán)，接種于裝有100m L液體種子培養(yǎng)基的250m L三角瓶中，37℃、150r/m in搖床培養(yǎng)15h。

1.3.3 納豆傳統(tǒng)發(fā)酵工藝流程 大豆→篩選、清洗→浸泡→分裝入三角瓶→高壓蒸汽蒸煮→冷卻→接菌→37℃恒溫培養(yǎng)24h→放入冰箱中后熟→成熟納豆［19］。

1.3.4 納豆固態(tài)發(fā)酵酶液的提取 納豆固態(tài)發(fā)酵結(jié)束后，將納豆制品以1∶5加入0.85%生理鹽水，4℃浸提24h，4500r/m in離心20m in，取上清液測定酶活。

1.3.5 納豆激酶活性測定方法 納豆激酶活性測定參照Astrup法［20］，制備纖維蛋白平板并進行改進。取3m L配制好的纖維蛋白原溶液放入長試管中于37℃保存?zhèn)溆?。在直?cm培養(yǎng)皿中，用1000μL的移液槍加入1m L 20U/m L凝血酶，再加入2m L工作液，搖勻。再將配制好的瓊脂糖溶液取10m L加入放有纖維蛋白原溶液的試管中，搖晃幾下倒入培養(yǎng)皿中，按逆時針方向勻速轉(zhuǎn)圈搖晃培養(yǎng)皿，以確保溶液充分混合均勻，并保持無氣泡。將尿激酶標準品用生理鹽水配制成200、400、600、800、1000U/m L 5個濃度梯度，分別取5μL加入已制備好的瓊脂糖-纖維蛋白原平板中，放入恒溫培養(yǎng)箱中37℃孵育18h，測量溶解圈垂直直徑，計算溶解圈面積。以溶解圈面積為縱坐標，酶活力為橫坐標做標準曲線。取樣品5μL加入纖維蛋白平板中，37℃孵育18h，測量溶解圈垂直直徑，根據(jù)標準曲線測定樣品酶活。

1.3.6 三株菌生長特性及其納豆激酶活力比較

1.3.6.1 生長曲線的繪制 將三株活化后的菌種以4%的接種量接入液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)不同時間后進行梯度稀釋測定活菌數(shù)［21］，重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。

1.3.6.2 三株菌產(chǎn)納豆激酶活力測定 稱取100g黃豆，洗凈、浸泡過夜；將其瀝干后的黃豆于121℃高壓滅菌蒸煮20m in，自然冷卻后，接入8%種子液，然后37℃培養(yǎng)，分別測定培養(yǎng)16、20、24、36、48h后，再經(jīng)4℃冰箱后熟納豆激酶的酶活力值。

1.3.7 固態(tài)前處理最佳條件確定

1.3.7.1 不同處理方法對酶活的影響 稱取100g黃豆，洗凈、浸泡過夜，將瀝干后的黃豆采取不同的處理方式：微波處理、蒸處理、煮處理、烘炒處理，按8%的接種量接入種子液，放置培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)20h，然后4℃冰箱后熟24h，分別測定其酶活。

1.3.7.2 破碎度確定 稱取100g黃豆，洗凈、浸泡過夜，將瀝干后的黃豆分別切成0、2、4、8瓣及細碎狀態(tài)，90℃下烘炒5m in，自然冷卻后，接8%種子液，37℃培養(yǎng)20h，然后4℃冰箱后熟24h，分別測定其酶活。

1.3.8 固態(tài)發(fā)酵最佳條件確定 在固態(tài)前處理最佳條件的基礎(chǔ)上選擇接種量、魔芋精粉添加量、發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度作為實驗四因素，設(shè)計四因素三水平的正交實驗，參照上述1.3.5納豆激酶活性測定方法，按L9（34）正交表進行實驗，研究得到固態(tài)發(fā)酵最佳條件。正交實驗的各因素水平見表1。

1.3.9 數(shù)據(jù)處理 采用Excel對數(shù)據(jù)進行處理，實驗結(jié)果計算標準差。采用M initab 16.0軟件對實驗數(shù)據(jù)進行分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 尿激酶標準曲線的繪制

圖1為尿激酶的標準曲線圖，所得到的標準曲線方程為y=0.003x+0.3937，相關(guān)系數(shù)R2=0.9976。

2.2 菌株生長特性及納豆激酶活力比較

2.2.1 生長曲線 三株枯草芽孢桿菌生長曲線見圖2。由圖2可見，BS10458在0～6h時，處于生長延滯期；在6～12h時，處于對數(shù)生長期；在12～30h時，處于生長穩(wěn)定期；30h后即進入生長衰亡期，活菌數(shù)最高達1.04× 107cfu/m L。BS21076在0～9h時，處于生長延滯期；在9～18h時，處于對數(shù)生長期；在18h后進入生長穩(wěn)定期，最高活菌數(shù)達4.57×108cfu/m L。BS20639在0～12h時，處于生長延滯期；在12～18h時，處于對數(shù)生長期；在18～33h時，處于生長穩(wěn)定期；33h后進入生長衰亡期，最高活菌數(shù)達2.70×108cfu/m L。

根據(jù)以上結(jié)論，BS21076與BS20639這兩株菌的活菌數(shù)最高達到108cfu/m L，且都在12h左右進入對數(shù)期。而BS10458達到對數(shù)期時間相對短，但活菌數(shù)最高卻僅達到107cfu/m L。

圖1 尿激酶標準曲線Fig.1 Standard curve of urokinase

圖2 三株枯草芽孢桿菌的生長曲線Fig.2 Growth curve of three Bacillus Subtilis

2.2.2 納豆激酶活力比較 三株枯草芽孢桿菌不同發(fā)酵時間的酶活變化見圖3。由圖3可知，三株枯草芽孢桿菌均隨發(fā)酵時間的延長，其酶活變化呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢，在20h時，三株菌（BS10458、BS21076及BS20639）的納豆激酶的酶活力達到最大值，其分別為1470.47、1668.76、1545.97U/g。其中，BS21076發(fā)酵得到的納豆激酶酶活力值明顯高于BS20639與BS10458。

圖3 不同發(fā)酵時間下對酶活力影響Fig.3 Effect of different fermentation time on the activity of nattokinase

綜合而言，BS21076在不同發(fā)酵時間下所產(chǎn)生的酶活力高于其他兩株菌，表明該菌種具有較好的產(chǎn)酶活性。圖3看出，三株菌隨發(fā)酵時間的延長，酶活力均呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢，并且在20h時達到峰值。原因可能是起始階段至16h內(nèi)，菌種處于長菌階段，16～20h間處于產(chǎn)酶階段，20h時酶活力達到最大值。

綜合比較三株菌的活菌數(shù)及納豆激酶酶活力兩項指標，可以得出，BS21076在固態(tài)發(fā)酵中其發(fā)酵性能優(yōu)于其他兩株菌，后續(xù)研究中以BS21076作為發(fā)酵生產(chǎn)菌株。

圖4 不同蒸制處理時間對納豆激酶活力的影響Fig.4 Effect of steming time on the activity of nattokinase

圖5 不同煮制處理時間對納豆激酶活力的影響Fig.5 Effect of boiling time on the activity of nattokinase

圖6 90℃時不同烘炒時間對納豆激酶活力的影響Fig.6 Effect of baking time on the activity of nattokinase on 90℃

2.3 固態(tài)發(fā)酵前處理最佳條件優(yōu)化

2.3.1 不同處理方式對酶活的影響 對浸泡瀝干后的豆子進行蒸制處理、煮制處理、烘炒處理、微波處理，然后接種8%的種子液進行發(fā)酵，不同處理方式下發(fā)酵產(chǎn)生的納豆激酶的酶活力隨處理時間變化見圖4～圖7。隨著處理時間的延長，豆子中的蛋白質(zhì)變性越來越嚴重，而當(dāng)其營養(yǎng)成分受到很大影響時，往往不利于微生物的發(fā)酵，選擇合適的處理時間對于不同處理方式下發(fā)酵納豆顯得尤為重要。表2中納豆激酶的酶活力值為優(yōu)化處理條件后得到最優(yōu)值。通過比較四種處理方法，對納豆激酶的酶活值與活菌數(shù)的影響，最終確定烘炒處理為最佳處理方式，烘炒條件為90℃烘炒5m in。

圖7 不同微波處理時間對納豆激酶活力的影響Fig.7 Effect of microwave processing time on the activity of nattokinase

表2 不同處理方式對納豆激酶活力的影響Table 2 Effect of different treatments on the activity of nattokinase

2.3.2 破碎度對酶活的影響 不同破碎度對納豆激酶的酶活力的影響見圖8。從圖8可知，當(dāng)豆子被切成四瓣時，其酶活力達到最高，其值為1730.52U/g。這是因為當(dāng)豆子被切碎后，增加了微生物與黃豆的接觸面積使之更好的被利用，但是過于細碎會使微生物利用的氧氣降低，酶活值下降。最終確定黃豆破碎度為四瓣。

圖8 不同破碎度對納豆激酶活力的影響Fig.8 Effect of soybean fragmentation on the activity of nattokinase

2.4 固態(tài)發(fā)酵最佳工藝優(yōu)化

本實驗在單因素實驗的基礎(chǔ)上，選擇接種量、魔芋精粉添加量、發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度因素，使用正交設(shè)計對產(chǎn)酶工藝條件進行優(yōu)化，結(jié)果分析見表3與表4。

表3 正交實驗結(jié)果及分析Table 3 Results and analysis of orthogonal experiment

表4 正交實驗方差分析表Table 4 Variance analysis of orthogonal test

由正交實驗結(jié)果和方差分析表可以看出，接種量（A）、魔芋精粉添加量（B）、發(fā)酵時間（C）與發(fā)酵溫度（D）此四個因素對納豆激酶活力的影響主次順序為發(fā)酵溫度＞接種量＞發(fā)酵時間＞魔芋精粉添加量。即發(fā)酵溫度對發(fā)酵產(chǎn)生的納豆激酶活力影響最大，達到極顯著水平，為決定性因素。其次為接種量、發(fā)酵時間，而魔芋精粉添加量的影響最小。固態(tài)發(fā)酵工藝最佳條件為A3B2C3D2，即破碎度為四瓣，90℃烘炒5m in，魔芋精粉添加量為3%，接種量為8%，37℃下發(fā)酵24h。

2.5 正交實驗驗證

根據(jù)正交實驗結(jié)果其最優(yōu)組合為A3B2C3D2，進行多次重復(fù)性（n＝3）驗證實驗，測得NK活力為（3582.48± 83.13）U/g，與傳統(tǒng)發(fā)酵NK活力（2060.12±59.45）U/g相比極顯著（p＜0.01）提高。所得到的正交實驗結(jié)果合理，在工業(yè)生產(chǎn)中具有一定的應(yīng)用價值。

3 結(jié)論

3.1 通過生長曲線、活菌數(shù)及不同發(fā)酵時間下產(chǎn)生納豆激酶的酶活力指標研究，由三株枯草芽孢桿菌中篩選出了一株較為優(yōu)良的枯草芽孢桿菌BS21076。其在9h左右進入對數(shù)期，最高活菌數(shù)為4.57×108cfu/m L，用于固態(tài)發(fā)酵20h后產(chǎn)生納豆激酶的酶活力最高，其值為1668.76U/g。

3.2 通過正交實驗，最后得到了固態(tài)發(fā)酵條件的最佳工藝參數(shù)：破碎度為四瓣，90℃烘炒5m in，魔芋精粉添加量為3%，接種量為8%，37℃下發(fā)酵24h。在此條件，發(fā)酵得到的酶活值為3582.48±83.13U/g。

［1］張曉敏，徐寶才.納豆—一種值得開發(fā)的功能性食品［J］.中國食品添加劑，2007，2：187-192.

［2］史延茂，田智斌，張聰莎，等.傳統(tǒng)發(fā)酵大豆制品功能成分的研究進展［J］.中國調(diào)味品，2012，37（12）：13-20.

［3］Xie Q L，Guo Y，Lin J.Research on themethod of nattokinase activity detection［J］.Guangdong Med.J，2000，10（6）：8-10.

［4］高瑞萍，劉輝，劉嘉，等.納豆的研究進展［J］.食品與發(fā)酵科技，2011，47（1）：23-26.

［5］代增英，馮建嶺，李迎秋，等.納豆及納豆激酶的研究進展［J］.山東食品發(fā)酵，2013，1：46-50.

［6］李淑英，趙仲麟，聶瑩，等.納豆激酶研究進展［J］.中國農(nóng)業(yè)科技導(dǎo)報，2013，4：139-143.

［7］Sumi H，Hamada H，Tsushima H，et al.A novel fibrinolytic enzyme（nattokinase）in the vegetable cheese natto：a typical and popular soybean food in the Japanese diet［J］.Experientia，1987，43（10）：1110-1111.

［8］FujitaM，Hong K，Ito Y，etal.Thrombolytic effect of nattokinase on a chemically induced thrombosis model in rat［J］.Biol Pharm Bull，1995，18（10）：1387-1391．

［9］平谷一，中西晃一朗，須見洋行.血栓溶解劑［P］.日本公開特許89180834，1989.

［10］Essam Kotb.Fibrinolytic Bacterial Enzymes with Thrombolytic Activity［M］.Springer Briefs in Microbiology，2012：35-43.

［11］王常蘇，孫曉彤，余潔，等.納豆激酶高活性菌株BN-05鑒定及發(fā)酵工藝優(yōu)化［J］.中國釀造，2014，33（1）：91-95.

［12］董超，史延茂，田智斌，等.納豆發(fā)酵及后處理生產(chǎn)工藝對納豆激酶活性的影響［J］.中國釀造，2013，32（5）：38-41.

［13］李妍，吳慶紅，陳義倫，等.一株納豆芽孢桿菌的產(chǎn)酶條件優(yōu)化［J］.食品科學(xué)，2013，3：179-183.

［14］郭穎，孔繁東，祖國仁，等.納豆激酶溶栓功效及開發(fā)應(yīng)用前景［J］.食品工業(yè)科技，2007，3：225-228.

［15］鮑艷霞，陳鈞，錢之玉，等.固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)納豆激酶的工藝優(yōu)化［J］.沈陽藥科大學(xué)學(xué)報，2004，11（6）：468-471.

［16］倉義鵬，張宏志，董明盛.蘋果渣固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)納豆激酶的工藝優(yōu)化［J］.生物工程，2010，31（15）：181-185.

［17］孫巖，王海寬，王建玲，等.以豆粕為原料固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)納豆激酶工藝的優(yōu)化［J］.天津科技大學(xué)學(xué)報，2011，26（6）：7-11.

［18］周伏忠，陳曉飛，陳國參，等.納豆激酶固態(tài)發(fā)酵的參數(shù)優(yōu)化［J］.生物技術(shù)，2011，21（1）：91-94.

［19］甘露，崔松松，倪敬田，等.納豆固態(tài)發(fā)酵條件優(yōu)化［J］.食品工業(yè)科技，2013，17：210-213.

［20］Astrup T，Muller S.The fibrin plate method for estimating fibrinolytic activity［J］.Arch Biochemical Biopys，1995，40：346-351.

［21］周建平，郭華.納豆黏液成分分析［J］.食品工業(yè)科技，2003，24（4）：32-34.

Screening of nattokinase high-yielded in different Bacillus Subtilis and optimization of fermentation conditions

ZHANG Jie1，GEW u-peng1，*，ZHANG Jing1，CHEN Ying2，WU Xiao-yong3
（1.College of Food Science and Engineering，Northwest A&FUniversity，Yangling 712100，China；2.Shaanxi Bureau of Quality and Technical Supervision，Xi'an 710068，China；3.Center of Inspection of Food and Drug Administration，Xianyang 712000，China）

This study was based on soybeans as main material，added different auxiliary material and hand led with different treatments.Three Bacillus Subtilis fermentation characteristics were com pared and the optimal strain was sele ted with the index of enzyme activity.The optimal process conditions were determined by solid-state fermentation experiments with the optimal strain.The result showed as follows:among three testing strains，BS21076 had the optimal fermentation characteristics，higher viable count and nattokinase activity.The op timal conditions of solid fermentation were baked at 90℃for 5m in，crushed deg ree four，3%konjac power，the inoculation of 8%and fermented at 37℃ for 24h.Under these conditions，the enzyme activity reached（3582.48±83.13）U/g，which com pared with traditional fermentation NK activity increased significantly（p＜0.01）.

nattokinase；Bacillus Subtilis；process op tim ization

TS201.3

A

1002-0306（2015）08-0202-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.08.033

2014－07－15

張杰（1989-），女，碩士研究生，研究方向：生物技術(shù)。

*通訊作者：葛武鵬（1965-），男，博士，副教授，研究方向：乳品科學(xué)及生物技術(shù)。

西北農(nóng)林科技大學(xué)人才基金項目（Z111020923）。