二次旋轉(zhuǎn)正交設(shè)計優(yōu)化鷹嘴豆蛋白酶解工藝的研究

張繼賢，程衛(wèi)東，田洪磊，詹 萍

（石河子大學(xué)食品學(xué)院，新疆石河子832000）

二次旋轉(zhuǎn)正交設(shè)計優(yōu)化鷹嘴豆蛋白酶解工藝的研究

張繼賢，程衛(wèi)東，田洪磊*，詹 萍

（石河子大學(xué)食品學(xué)院，新疆石河子832000）

實驗選用堿性蛋白酶（Alcalase）和風(fēng)味蛋白酶（Flavourzyme）分步依次酶解鷹嘴豆蛋白，采用二次旋轉(zhuǎn)正交組合實驗設(shè)計對其酶解工藝進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果顯示，在初始pH8.5，初始溫度55℃，鷹嘴豆蛋白酶解的最佳工藝條件為：底物濃度1%，堿性蛋白酶的添加量為2000U/g，作用時間為2.5h，風(fēng)味蛋白酶的添加量為4000U/g，作用時間為3h。在此條件下，其最大水解度可達(dá)29.17%。

二次旋轉(zhuǎn)正交組合實驗設(shè)計，鷹嘴豆，酶解

鷹嘴豆（Cicer arietium L.），一年生或多年生草本植物，適合在半干旱亞熱帶區(qū)域生長，據(jù)統(tǒng)計，鷹嘴豆是世界上的第二大消費豆類，其產(chǎn)量位居世界第三，是世界上栽培面積較大的食用豆類作物之一［1］。在我國新疆、甘肅、河北、山西等地均有栽培，其中以新疆鷹嘴豆種植面積最大、產(chǎn)量最高、質(zhì)量最好而著稱［2］。

在新疆維吾爾族地區(qū)，由于鷹嘴豆具有諸如強(qiáng)壯筋骨、健胃消脾、滋潤養(yǎng)顏、抗HIV、抗骨質(zhì)疏松等多種藥用功效，人們普遍將其視為一種營養(yǎng)價值較高的滋補(bǔ)品［3］。此外，由于鷹嘴豆蛋白的氨基酸組成均衡、生物利用率高、抗?fàn)I養(yǎng)因子低等，同時也被視為較為重要的植物蛋白資源。目前，國內(nèi)外對鷹嘴豆蛋白進(jìn)行了大量的研究，主要集中在鷹嘴豆蛋白的分離純化、營養(yǎng)價值、功能特性等方面［4-6］。薛朝輝等［7］對鷹嘴豆蛋白進(jìn)行了分類研究，發(fā)現(xiàn)鷹嘴豆蛋白具有較強(qiáng)的抗氧化活性，球蛋白活性更強(qiáng)，值得進(jìn)一步研究。張濤等［8］對鷹嘴豆的分離特性進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)用堿溶酸沉法提取的鷹嘴豆蛋白的純度高達(dá)91.53%，在兩個特殊點pH 5.0和離子強(qiáng)度0.2時，其溶解性和乳化能力都最小。馬文鵬等［9］利用堿性蛋白酶進(jìn)行酶解，采用響應(yīng)面法優(yōu)化酶解工藝，酶解所得的水解度僅為16.18%。然而對鷹嘴豆進(jìn)行雙酶酶解的研究及其酶解液進(jìn)一步開發(fā)利用，目前研究相對較少。本文利用堿性蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶對鷹嘴豆蛋白進(jìn)行酶解，以水解度（DH%）為指標(biāo)，采用二次旋轉(zhuǎn)正交組合實驗設(shè)計優(yōu)化鷹嘴豆蛋白的雙酶酶解工藝，以期最大限度提高鷹嘴豆蛋白的利用率，為鷹嘴豆蛋白的開發(fā)利用在理論上提供依據(jù)，并為后期對鷹嘴豆蛋白的深加工提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鷹嘴豆 購自新疆石河子農(nóng)貿(mào)市場，用高速粉碎機(jī)將其粉碎，過80目篩，收集后以石油醚：鷹嘴豆粉2∶1（v/m）的比例，在搖床中振蕩2h，按此重復(fù)操作3次，棄去有機(jī)溶劑，進(jìn)行脫脂，將脫脂后的鷹嘴豆粉置于通風(fēng)廚中干燥12h，將處理好的鷹嘴豆粉裝于中型廣口瓶中置于4℃的冰箱中，保存?zhèn)溆茫?0］；堿性蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶 諾維信（中國）生物技術(shù)有限公司；其他實驗試劑 均為國產(chǎn)分析級。

DFT-100手提式高速粉碎機(jī) 溫嶺市林大機(jī)械有限公司；DK-8D數(shù)顯恒溫水浴鍋 金壇市醫(yī)療儀器廠；PHS-3C雷磁pH計 上海精科；Neofuge 15R臺式高速冷凍離心機(jī) 力康發(fā)展有限公司；ZHWY-111B落地普通型大容器恒溫培養(yǎng)振蕩器 上海智城分析儀器制造有限公司；Ultrospec 5300 pro紫外可見分光光度計 上海市浦東張江高科技園區(qū)。

1.2 蛋白酶的篩選

準(zhǔn)確稱取鷹嘴豆粉2.0g，加入蒸餾水100m L，選取堿性蛋白酶、中性蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶和木瓜蛋白酶在各自最適溫度和pH條件下，酶解2h，酶解完成后，在90～95℃條件下滅酶10min，冷卻至室溫，離心取其上清液，測定酶解產(chǎn)物的水解度和可溶性氮含量，確定最佳用酶。各種蛋白酶的酶解條件如表1所示。

表1 四種蛋白酶的酶解條件Table 1 The hydrolysis conditions of four protease

1.3 單因素實驗

1.3.1 堿性蛋白酶底物濃度 保持堿性蛋白酶的最適溫度和pH，加酶量3000U/g，反應(yīng)時間2h，設(shè)底物濃度（鷹嘴豆蛋白）0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%五個水平，考察可溶性氮含量和水解度的變化趨勢。

1.3.2 堿性蛋白酶的添加量 在堿性蛋白酶最適的溫度和pH條件下，底物濃度2.0%，反應(yīng)時間2h，設(shè)酶的添加量1000、1500、2000、2500、3000U/g五個水平，考察可溶性氮含量和水解度的變化趨勢。

1.3.3 堿性蛋白酶的反應(yīng)時間 以堿性蛋白酶的最適溫度和pH為前提，底物濃度2.0%，酶的添加量3000U/g，設(shè)置時間變量1、2、3、4、5h五個水平，分別考察可溶性氮含量和水解度的變化趨勢。

1.3.4 風(fēng)味蛋白酶的添加量 在風(fēng)味蛋白酶的最適溫度和pH的條件下，底物濃度2.0%，反應(yīng)時間2h，酶的添加量1000、1500、2000、2500、3000、3500U/g六個水平，考察可溶性氮和水解度的變化趨勢。

1.3.5 風(fēng)味蛋白酶的反應(yīng)時間 風(fēng)味蛋白酶的最適溫度和pH條件下，底物濃度2.0%，酶的添加量3000U/g，設(shè)反應(yīng)時間0.5、1.0、1.5、2.0、2.5h五個水平，考察可溶性氮含量和水解度的變化趨勢。

1.4 二次旋轉(zhuǎn)正交實驗設(shè)計優(yōu)化酶解條件

以單因素實驗為基礎(chǔ)，初始溫度55℃，初始pH 8.5，采用堿性蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶依次分步進(jìn)行酶解，以水解度為指標(biāo)，分別以堿性蛋白酶的添加量和作用時間、風(fēng)味蛋白酶的添加量和作用時間、底物濃度為變量進(jìn)行五因素二次旋轉(zhuǎn)組合實驗設(shè)計（1/2實施），共進(jìn)行36組實驗，每組實驗均進(jìn)行3組平行實驗進(jìn)行分析驗證。因素水平編碼見表2。

表2 二次旋轉(zhuǎn)回歸正交組合實驗設(shè)計因素水平編碼表Table 2 The factors and levels of quadratic regression orthogonal rotation design

1.5 鷹嘴豆酶解工藝的流程

鷹嘴豆粉→加入適量蒸餾水→滅酶（90℃，10～15min）→用3mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH至8.5→加入堿性蛋白酶進(jìn)行酶解（55℃）→加入風(fēng)味蛋白酶進(jìn)行酶解（50℃）→滅酶（90℃，10～15min）→離心，取上清液。

1.6 測定指標(biāo)及方法

可溶性氮含量：酶解產(chǎn)物上清液中總氮量與原料中總氮含量的百分比，采用微量凱氏定氮法；甲醛電位滴定法：水解度DH（%）［11］=水解液中總游離氨基酸含氮量/總氮量×100；蛋白質(zhì)［12］：微量凱氏定氮法；脂肪［12］：索氏抽提法；總糖［12］：直接滴定法；水分［12］：常壓干燥法。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)采用Origin 8.0和DPS 7.05數(shù)據(jù)處理軟件進(jìn)行分析處理，每組實驗的數(shù)據(jù)均進(jìn)行三次平行實驗進(jìn)行驗證。

2 數(shù)據(jù)處理與分析

2.1 鷹嘴豆粉成分分析

對鷹嘴豆的主要組成成分進(jìn)行分析，結(jié)果如表3所示。由表3可以看出，鷹嘴豆中的蛋白質(zhì)含量高達(dá)23.59%，蛋白質(zhì)含量比較豐富，可利用的蛋白質(zhì)較多，符合實驗用樣品的要求。

2.2 蛋白酶的篩選

根據(jù)各種蛋白酶對蛋白質(zhì)酶切位點的不同，分別選取堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶和中性蛋白酶四種蛋白酶，在添加相同酶活添加量（2000U/g）及其最適pH和溫度條件下對鷹嘴豆進(jìn)行酶解，以DH（%）和可溶性氮含量為指標(biāo)［13］，考察不同蛋白酶對鷹嘴豆蛋白酶解效果的影響，結(jié)果見圖1。

表3 鷹嘴豆粉的基本營養(yǎng)成分Table 3 Basic nutrition components in Chickpea flour

圖1 不同蛋白酶對鷹嘴豆粉酶解效果的影響Fig.1 Effect of different protease on enzymatic hydrolysis of Chickpea protein

由圖1可以看出，四種蛋白酶對鷹嘴豆酶解效果差異顯著（p＜0.05）。風(fēng)味蛋白酶的酶解效果最好，水解度可達(dá)22.05%，其次依次為堿性蛋白酶（16.25%）、木瓜蛋白酶酶（12.77%）和中性蛋白酶（11.59%）。酶解液中可溶性氮含量的變化與相應(yīng)酶酶解水解度變化趨勢大致相同，可溶性氮回收率均在53.3%～75.67%。這主要是由于不同蛋白酶對底物的酶切位點不同，所產(chǎn)生的酶解物中游離氨基酸種類和肽段的分子量存在較大差異，導(dǎo)致水解度呈現(xiàn)出較大的區(qū)別。本研究的目的是最大程度的利用鷹嘴豆的蛋白質(zhì)資源，由于單一酶對底物的作用范圍有限，故本實驗擬采用不同性質(zhì)、對鷹嘴豆蛋白有著不同切割位點的兩種酶進(jìn)行雙酶酶解，以最大程度提高鷹嘴豆蛋白的水解度。前人研究發(fā)現(xiàn)，堿性蛋白酶酶解完成后，pH基本穩(wěn)定在6.8～7.2范圍內(nèi)，與風(fēng)味蛋白酶的最佳酶解pH基本吻合［13］，避免了后續(xù)利用金屬鹽或緩沖溶液調(diào)節(jié)pH給產(chǎn)品開發(fā)帶來的安全隱患問題。因此，本實驗選用堿性蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶對鷹嘴豆粉進(jìn)行雙酶酶解。

2.3 酶解單因素實驗

2.3.1 堿性蛋白酶對不同濃度的鷹嘴豆蛋白的酶解效果 在不同的底物濃度下，堿性蛋白酶對鷹嘴豆蛋白酶解水解度和可溶性氮含量的測定結(jié)果如圖2所示。

由圖2可知，不同底物濃度對鷹嘴豆蛋白水解度的影響存在顯著差異（p＜0.05）。隨著底物濃度的升高，水解度呈現(xiàn)先增高后降低的趨勢，當(dāng)?shù)孜餄舛葹?%時達(dá)到最大值。當(dāng)?shù)孜餄舛仍僭黾?，水解度下降，這是由于底物濃度過高時，酶與底物接觸不充分［14］，不利于酶解反應(yīng)的進(jìn)行。底物濃度過低時，水解度過低，不利于后續(xù)產(chǎn)品的開發(fā)［15］?？扇苄缘看嬖诘娘@著差異（p＜0.05），當(dāng)?shù)孜餄舛葹?%時，可溶性氮含量較高，可能生成了許多小肽。因此，堿性蛋白酶對鷹嘴豆粉酶解的最佳底物濃度為1%～2%。

圖2 不同堿性蛋白酶底物濃度對酶解效果的影響Fig.2 Effect of substrate concentration on enzymatic hydrolysis of Chickpea flour

2.3.2 堿性蛋白酶添加量對鷹嘴豆酶解效果的影響

堿性蛋白酶不同添加量對鷹嘴豆蛋白酶解效果的影響，如圖3所示。

圖3 堿性蛋白酶加酶量對鷹嘴豆酶解效果影響Fig.3 Effect of amounts of enzyme on enzymatic hydrolysis of Chickpea flour

由圖3可以看出，隨著酶的添加量不斷增加，水解度和可溶性氮含量均有遞增的趨勢，當(dāng)增加到1500～2500U/g時，水解度呈現(xiàn)平緩趨勢，差異不明顯；當(dāng)添加量增加到3000U/g時，水解度又有所提升，但是可溶性氮含量則呈現(xiàn)明顯下降趨勢。綜合考慮到成本和后續(xù)反應(yīng)的進(jìn)行，將堿性蛋白酶的添加量確定為1500～2500U/g。

2.3.3 堿性蛋白酶的作用時間對酶解效果的影響 堿性蛋白酶不同酶解時間對鷹嘴豆蛋白酶解效果的影響，如圖4所示。

通過圖4可知，隨著酶解時間的增加，水解度和可溶性氮含量開始均呈現(xiàn)上升的趨勢，不同的是，當(dāng)酶解至2h之后，水解度基本處于平穩(wěn)狀態(tài)，而可溶性氮含量在酶解3h之后，有下降的趨勢。綜合考慮水解度和可溶性氮含量兩個指標(biāo)，最佳的酶解時間應(yīng)該選擇2～3h。

圖4 酶解時間對鷹嘴豆粉酶解效果的影響Fig.4 Effect of time on enzymatic hydrolysis of Chickpea flour

2.3.4 風(fēng)味蛋白酶的添加量對酶解效果的影響 風(fēng)味蛋白酶的不同添加量對鷹嘴豆蛋白酶解效果的影響，結(jié)果如圖5所示。

圖5 風(fēng)味蛋白酶的添加量對鷹嘴豆粉酶解效果的影響Fig.5 Effect of amounts of enzyme on enzymatic hydrolysis of Chickpea flour

由圖5可知，當(dāng)風(fēng)味蛋白酶不斷增加時，水解度呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢，當(dāng)加酶量為3000U/g時，水解度達(dá)到最大值為18.57%。雖然當(dāng)加酶量達(dá)到3000U/g時，可溶性氮含量仍然處于上升的趨勢，但這時的酶解液中可能含有大量的寡肽和氨基酸，產(chǎn)生了一些苦味肽，不利于后續(xù)利用酶解液進(jìn)行美拉德反應(yīng)。因此綜合考慮，確定3000U/g為風(fēng)味蛋白酶的最佳添加量。

2.3.5 風(fēng)味蛋白酶酶解時間對酶解效果的影響 風(fēng)味蛋白酶的不同酶解時間對鷹嘴豆蛋白酶解效果的影響，結(jié)果如圖6所示。

由圖6可以看出，隨著時間的增加，水解度和可溶性氮含量均呈現(xiàn)先下降后上升再下降的趨勢。當(dāng)酶解時間為2h時，水解度和可溶性氮含量均達(dá)到了最大值，分別為13.93%和66.42%。所以通過兩個指標(biāo)的變化趨勢，初步確定風(fēng)味蛋白酶酶解鷹嘴豆蛋白較佳酶解時間為2h。

2.4 二次旋轉(zhuǎn)正交組合實驗設(shè)計結(jié)果分析

2.4.1 二次旋轉(zhuǎn)正交組合回歸方程的建立 在單因素實驗的基礎(chǔ)上，采用五因素二次旋轉(zhuǎn)正交組合實驗設(shè)計（1/2實施），實驗設(shè)計結(jié)果和方差分析見表4～表6。

圖6 風(fēng)味蛋白酶的酶解時間對鷹嘴豆粉酶解效果的影響Fig.6 Effect of time on enzymatic hydrolysis of Chickpea flour

表4 二次旋轉(zhuǎn)正交組合實驗設(shè)計實驗結(jié)果Table 4 The results of Quadratic regression orthogonal rotation design

表5 回歸系數(shù)方差檢驗表Table 5 Regression coefficientof variance test results

表6 方差分析Table 6 The square－difference analysis

由表6方差分析結(jié)果可知，回歸方程的失擬性檢驗p=0.235＞0.05不顯著，從而可以認(rèn)為方程合理，所選的回歸模型是適當(dāng)?shù)?；回歸顯著性檢驗p=0.0001＜0.01極其顯著，說明建立的回歸模型與現(xiàn)實情況吻合的較好，模型成立［16］。

對回歸系數(shù)的顯著性檢驗，以下是α=0.05顯著水平剔除不顯著項后，化簡后的回歸方程：

經(jīng)計算數(shù)學(xué)模型的相關(guān)系數(shù)R2=0.9334，說明在酶解實驗中的各種酶解條件下，對水解度的影響93.34%的可變性可以用此數(shù)學(xué)模型來解釋。

2.4.2 二次回歸模型單因子效應(yīng)分析 采用降維分析法［17］，得出單因子變化時對水解度的影響，結(jié)果如圖7所示。

圖7 單因子效應(yīng)Fig.7 The relationship of single factors to hydrolysis degree

由圖7可看出，堿性蛋白酶的添加量在-2～+2的水平上水解度先升高后降低；堿性蛋白酶的作用時間在-2～+2的水平上，先下降后升高；風(fēng)味蛋白酶的添加量和酶解時間在-2～+2的水平上，水解度均呈現(xiàn)遞增的趨勢；而底物濃度在-2～+2的水平上，水解度呈現(xiàn)先降低后略微增加的趨勢。單因子的變化趨勢，與單因素實驗的變化趨勢進(jìn)本吻合，說明本實驗采用二次旋轉(zhuǎn)正交組合實驗設(shè)計是合理的。

2.4.3 二次回歸模型交互作用效應(yīng)分析 對上述回歸模型中具有顯著性的交互項影響可通過圖8（a～g）所示的響應(yīng)面圖反映。

從圖8（a）中可以看出，提高堿性蛋白酶的添加量，水解度先呈下降后呈上升的趨勢，延長堿性蛋白酶的酶解時間則呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，兩者的交互作用變現(xiàn)為水解度的提高；（b）增加堿性蛋白酶的量，水解度呈上升的趨勢。隨著風(fēng)味蛋白酶酶解時間的增加，水解度呈現(xiàn)上升后又小幅下降的趨勢，兩者的交互作用變現(xiàn)為水解度的下降；（c）為堿性蛋白酶的酶解時間和風(fēng)味蛋白酶添加量的交互影響，增加堿性蛋白酶的酶解時間同時減少風(fēng)味蛋白酶的添加量變現(xiàn)為提高水解度，同時減小堿性蛋白酶的作用時間同時提高風(fēng)味蛋白酶的添加量也變現(xiàn)為水解度的提高，兩者的交互作用變現(xiàn)為水解度的提高；（d）為堿性蛋白酶的酶解時間和風(fēng)味蛋白酶的作用時間的交互影響，在大部分范圍內(nèi)，增加堿性蛋白酶的酶解時間和增加風(fēng)味蛋白酶的作用時間，可以增加水解度。但兩者交互的影響為鷹嘴豆粉酶解液水解度的降低；（e）為堿性蛋白酶的酶解時間和底物濃度的交互作用，由等高線和響應(yīng)面可以看出，在大部分范圍內(nèi)同時減小堿性蛋白酶的酶解時間和底物濃度，可以增加水解度。兩者的交互作用影響為鷹嘴豆酶解液水解度的減?。唬╢）風(fēng)味蛋白酶的添加量和酶解時間的交互作用，隨著酶添加量的增加，水解度有增加的趨勢，而隨著酶解時間的增加，水解度有小幅度下降的趨勢。在增加風(fēng)味蛋白酶的添加量的同時，減小風(fēng)味蛋白酶的作用時間，可以增大水解度。兩者的交互作用影響為水解度的提高；（g）風(fēng)味蛋白酶的酶解時間和底物濃度的交互作用，隨著酶解時間和底物濃度的增加，水解度具有明顯下降的趨勢。風(fēng)味蛋白酶的酶解時間和底物濃度的交互影響為水解度的降低。

2.4.4 雙酶酶解鷹嘴豆粉最佳條件的確定 用DPS軟件對五元二次旋轉(zhuǎn)正交組合實驗的結(jié)果進(jìn)行分析優(yōu)化，最終得出最佳的雙酶酶解條件為：堿性蛋白酶酶的添加量為2000U/g，酶解時間為2.5h；風(fēng)味蛋白酶酶的添加量為4000U/g，酶解時間為3h，堿性蛋白酶的底物濃度為1%，在此條件下對鷹嘴豆粉的水解度可達(dá)到29.17%。驗證實驗所測值為（28.65%）與理論值基本一致，所以該實驗的重復(fù)性較好。

3 結(jié)論

通過二次旋轉(zhuǎn)正交組合實驗設(shè)計，建立了底物濃度和兩種酶的作用時間和酶添加量的回歸模型，選擇出雙酶酶解鷹嘴豆粉的最佳條件為：底物濃度1%，堿性蛋白酶的酶添加量2000U/g，反應(yīng)時間2.5h；風(fēng)味蛋白酶的酶添加量4000U/g，反應(yīng)時間3h，最大水解度可達(dá)29.17%，與實驗驗證值（28.65%）基本一致，實驗的重復(fù)性良好。

圖8 雙因子交互作用的影響Fig.8 The interaction effectanalysis of two－factors to hydrolysis degree

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Optimizing enzymatic hydrolysis conditions of Chickpea flour through quadratic orthogonal rotation combination design

ZHANG Ji-xian，CHENG Wei-dong，TIAN Hong-lei*，ZHAN Ping
（College of Food Science，Shihezi University，Shihezi832000，China）

The Chickpea flour was hydrolyzed with Alacalase and Flavourzyme，and the quadratic regression orthogonal rotary combination design was used to improve the op timization of hydrolysis conditions of Chickpea protein.The results showed that when the initial pH was 8.5 and the temperature was 55℃，the best processing conditions of Chickpea protein enzymolysis were as follows:the substrate concentration 1%，the Alcalase dosage 2000U/g with 2.5h，the adding content of flavourzyme was 4000U/g with 3h.Based on these conditions，the maximum deg ree of hydrolysis could reach 29.17%.

quadratic orthogonaldesign；Chickpea flour；enzymolysis

TS255

A

1002-0306（2015）08-0196-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.08.032

2014－07－07

張繼賢（1989－），男，在讀碩士研究生，研究方向：食品風(fēng)味化學(xué)。

*通訊作者：田洪磊（1979－），男，博士，副教授，研究方向：功能食品與配料。

兵團(tuán)興邊富民科技專項（2012BA068）。