直投式復合菌劑泡菜循環(huán)發(fā)酵中輔料配方的優(yōu)化及品質分析

黃道梅，孫 娟，劉書亮，2，*，胡欣潔，2，韓新鋒，2，何 利，2，周 康，2，顏正財

（1.四川農業(yè)大學食品學院，四川雅安625014；2.四川省農產品加工及貯藏工程重點實驗室，四川雅安625014；3.四川吉香居食品有限公司，四川眉山620039）

直投式復合菌劑泡菜循環(huán)發(fā)酵中輔料配方的優(yōu)化及品質分析

黃道梅1，孫 娟1，劉書亮1，2，*，胡欣潔1，2，韓新鋒1，2，何 利1，2，周 康1，2，顏正財3

（1.四川農業(yè)大學食品學院，四川雅安625014；2.四川省農產品加工及貯藏工程重點實驗室，四川雅安625014；3.四川吉香居食品有限公司，四川眉山620039）

以戊糖片球菌、植物乳桿菌為直投式復合菌劑，以蘿卜、萵筍等為原料。研究復合菌劑發(fā)酵泡菜、老鹽水發(fā)酵泡菜和自然發(fā)酵泡菜三種不同工藝發(fā)酵過程中感官、理化及微生物指標的變化規(guī)律，并對泡菜成熟時達到的平衡體系進行研究，通過取出成熟泡菜、再添加原、輔料來實現(xiàn)泡菜循環(huán)發(fā)酵。結果表明，復合菌劑發(fā)酵泡菜與其他兩種發(fā)酵方式泡菜相比，感官品質較優(yōu)、亞硝酸鹽含量更低（最高僅為1.51mg/kg）、乳酸菌數(shù)更高（約108CFU/g）。通過控制菜水比為1∶1，以及發(fā)酵過程中輔料（食鹽、冰糖、香料汁）的補加量實現(xiàn)泡菜的循環(huán)發(fā)酵，單因素和正交實驗確定了泡菜循環(huán)發(fā)酵過程中食鹽、冰糖、香料汁的補加量分別為3.50%、3.75%和3.75%，且每批次泡菜品質均無顯著差異。

直投式復合菌劑，循環(huán)發(fā)酵，泡菜，輔料配方，品質

泡菜富含以乳酸菌為主的益生菌群，風味獨特、營養(yǎng)豐富，具有助消化、抗氧化、預防腫瘤、降低膽固醇等特點，乃生津開胃之首選，享譽國內外［1-3］。以四川泡菜為代表的中國泡菜，已與韓國泡菜、日本泡菜齊名。四川泡菜在國內市場的占有率達50%以上，產品遠銷國外。然而，富含活性乳酸菌的傳統(tǒng)四川泡菜產量卻很小。同時日、韓兩國均在不斷擴大其泡菜市場，這對我國的泡菜產業(yè)產生了巨大的沖擊，中國傳統(tǒng)泡菜產業(yè)亟待現(xiàn)代化［4］。

近年來，研究者對發(fā)酵泡菜專用的直投式菌劑制備的研究較多［5-6］，并在直投式乳酸菌菌劑發(fā)酵泡菜的工藝、特性方面的研究也有一定進展［7-8］。相比于傳統(tǒng)發(fā)酵方式，直投式菌劑發(fā)酵泡菜可明顯縮短發(fā)酵周期，提高泡菜中各種有機酸、氨基酸和有機醇的總量，還能大幅度降低亞硝酸鹽含量［9-10］。而泡菜循環(huán)發(fā)酵是指按照泡菜的工藝發(fā)酵蔬菜，待其成熟后，將泡菜撈出，再添加一定量的蔬菜和相應的輔料，繼續(xù)發(fā)酵至成熟，然后再撈出、再補加原輔料，如此循環(huán)進行的一個發(fā)酵過程。實現(xiàn)泡菜的循環(huán)發(fā)酵可以最大限度地保持泡菜品質的穩(wěn)定性，縮短生產周期，減少鹽水排放，節(jié)約生產成本，推進泡菜產業(yè)發(fā)展。目前，對于泡菜循環(huán)發(fā)酵的研究少見報道，僅有顏正財?shù)龋?1］進行有關連續(xù)式泡菜發(fā)酵裝置的研究，于培星等［12］研究了乳酸菌循環(huán)發(fā)酵的動力學過程，葉仁禮等［13］關于速成泡菜及其循環(huán)工藝進行了探討，然而對于泡菜循環(huán)發(fā)酵過程中原輔料的變化鮮有報道。因此，本實驗選用具有優(yōu)良發(fā)酵性能的植物乳桿菌和戊糖片球菌作為復合菌劑，蘿卜、萵筍等為原料，對比三種泡菜（復合菌劑發(fā)酵泡菜、老鹽水發(fā)酵泡菜、自然發(fā)酵泡菜）品質變化，探討實現(xiàn)泡菜循環(huán)發(fā)酵的原輔料變化參數(shù)，為傳統(tǒng)四川泡菜的規(guī)模化生產提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

植物乳桿菌P158（以下簡稱P158）凍干菌劑（7.32× 1011CFU/g）、戊糖片球菌PP（以下簡稱PP）凍干菌劑（6.43×1010CFU/g） 使用時制成菌劑質量比（P158∶PP）為1∶11.4（菌含量約為1∶1）的復合菌劑（1.18×1011CFU/g），由四川農業(yè)大學食品學院食品微生物實驗室提供；改良MRS液體培養(yǎng)基［14］；泡菜原料（胡蘿卜、白蘿卜、萵筍、芹菜、辣椒、白酒、含碘食鹽等） 均為市售；泡菜老鹽水 取自四川農業(yè)大學老區(qū)食堂，置于4℃冰箱，備用；鉻酸鉀、亞鐵氰化鉀、乙酸鋅、四硼酸鈉、對氨基苯磺酸、鹽酸萘乙二胺、亞硝酸鈉等 均為分析純；鄰苯二甲酸氫鉀、氯化鈉 均為基準試劑。

UV-3200（PC）紫外可見分光光度計 上海美譜達儀器有限公司；PB-2B pH計 SARTORIUS；CJBQ磁力攪拌器 山西太華磁有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 泡菜的制作工藝 按復合菌劑接種發(fā)酵（以蔬菜質量的0.05%菌粉計）、老鹽水發(fā)酵（不接菌粉，老鹽水為蔬菜質量的25%）和自然發(fā)酵（不接菌粉和不使用老鹽水）3種方式制作泡菜，分析發(fā)酵過程中的品質變化，操作要點如下。

1.2.1.1 原料準備 挑選新鮮脆嫩、成熟適度，組織致密，無病蟲害及霉變的胡蘿卜、白蘿卜、萵筍、小紅椒、芹菜，去除衰老、壞死部分。用0.008g/kg次氯酸鈣溶液浸泡5min進行消毒，用無菌水沖洗至無氯味后瀝干。胡蘿卜、白蘿卜、萵筍切分為4cm長×1cm寬× 1cm厚的長條，小紅椒、芹菜切成2cm小段，其配比為16∶16∶16∶1∶1。

香料汁：稱取適量八角、香葉、桂皮、青花椒、冰糖、小紅椒、生姜、大蒜、芹菜于3000m L飲用水中，小火微沸熬制3h。用紗布過濾得1000m L香料汁。

補加用水：量取4000m L飲用水，煮沸并冷卻至室溫，備用。

1.2.1.2 裝壇發(fā)酵 將處理好的蔬菜條按1500g/壇分裝于3L泡菜壇（75%酒精消毒后）中，采用復合菌劑、老鹽水、自然方式發(fā)酵，并按1.2.3中實驗設計添加食鹽、冰糖、香料汁，按蔬菜與水質量比為1∶1補加涼開水，室溫（日均最高、低氣溫為25、14℃）密封發(fā)酵。每隔12h取泡菜樣品研磨，按1∶1加入蒸餾水，測定pH。當pH下降至3.6時，結合泡菜色澤、口感等確定發(fā)酵終點。

1.2.2 泡菜品質分析

1.2.2.1 感官評價 參照文獻［15］中泡菜感官評定評分標準略改動，10人評價小組對產品的形態(tài)、色澤、氣味、口感和脆度進行感官評價，對應的評價得分集=［很差（2），較差（4），一般（6），較好（8），很好（10）］，評價結果用SPSS軟件進行分析。

1.2.2.2 部分理化指標測定 pH：精密pH計測定，參照GB/T 10468-1989。總酸：酸堿中和法測定，參照GB/T 5009.51-2003。鹽度：AgNO3標準溶液滴定法測定，參照GB/T 5009.51-2003。亞硝酸鹽：鹽酸萘乙二胺法測定，參照GB 5009.33－2010。

1.2.2.3 乳酸菌數(shù)測定 采用平板菌落計數(shù)法，參照GB 4789.36-2010。

1.2.3 泡菜循環(huán)發(fā)酵工藝中輔料配方的優(yōu)化

1.2.3.1 單因素實驗 復合菌劑發(fā)酵泡菜成熟后，將泡菜全部撈出并舀出少量發(fā)酵液，使撈出菜和水與裝壇時添加的蔬菜等重。參考文獻［16］并根據(jù)預實驗情況，按菜與液體的比為1∶1補加蔬菜，設計以下單因素實驗確定食鹽、冰糖、香料汁適宜添加量。

a.補加食鹽用量的確定 在菌劑發(fā)酵泡菜成熟后的泡菜水中補加冰糖3%、香料汁4%，再分別補加食鹽2%、2.5%、3%、3.5%、4%，攪拌溶解后，加入蔬菜，密封發(fā)酵至成熟，通過測定pH、總酸、鹽度比較泡菜成品品質，確定食鹽的適宜用量X。

b.補加冰糖用量的確定 在菌劑發(fā)酵泡菜成熟后的泡菜水中補加香料汁4%、食鹽3%，再分別補加冰糖2%、2.5%、3%、3.5%、4%，攪拌溶解后，加入蔬菜，密封發(fā)酵至成熟，通過測定pH、總酸、鹽度比較泡菜成品品質，確定冰糖的適宜用量Y。

c.補加香料汁用量的確定 在菌劑發(fā)酵泡菜成熟后的泡菜水中補加冰糖3%、食鹽3%，再分別補加香料汁3%、3.5%、4%、4.5%、5%，密封發(fā)酵至成熟，通過測定pH、總酸、鹽度比較泡菜成品品質，確定香料汁的適宜用量Z。

1.2.3.2 正交實驗 根據(jù)a～c各補加原料的最佳水平設計正交實驗，正交因素水平表見表1，以總酸、鹽度與第1次發(fā)酵成品的偏差最小來確定各輔料的適宜補加量。偏差是指各實驗組與第1次復合菌劑發(fā)酵泡菜總酸、鹽度的差值，其中總酸、鹽度各占50%的權重，其表達式為：偏差=｜總酸實驗組－總酸第一次發(fā)酵｜×50% +｜鹽度實驗組－鹽度第一次發(fā)酵｜×50%。

按正交實驗優(yōu)化所得的適宜用量，進行第2～5次循環(huán)發(fā)酵，并考察泡菜成品的品質，分析同1.2.2。

表1 補加輔料正交實驗因素水平表Table 1 Orthogonal test factors level table of adding auxiliarymaterials

1.2.4 數(shù)據(jù)處理 實驗數(shù)據(jù)及其圖表繪制采用EXCEL、Origin 7.5、SPSS 19.0軟件進行處理。

2 結果與分析

2.1 三種方式發(fā)酵泡菜感官評價結果

對三種方式發(fā)酵泡菜到達各自發(fā)酵終點時分別進行了感官評價，并對不同發(fā)酵方式之間采用SPSS 19.0軟件進行了顯著性分析。從評價結果（表2）看，復合菌劑發(fā)酵的泡菜得分最高，老鹽水發(fā)酵泡菜居中，自然發(fā)酵泡菜最低。復合菌劑發(fā)酵泡菜在色澤方面與老鹽水發(fā)酵泡菜差異不顯著（p＞0.05），但在形態(tài)、氣味、口感、脆度方面均優(yōu)于老鹽水發(fā)酵泡菜（p＜0.05）。

2.2 三種方式發(fā)酵泡菜pH及總酸含量的變化

三種方式發(fā)酵泡菜發(fā)酵過程中pH及總酸含量的變化如圖1所示。由圖1可知，復合菌劑發(fā)酵泡菜約48h后，泡菜pH降至3.51＜3.6，總酸含量為0.33g/100g，泡菜成熟。老鹽水發(fā)酵泡菜約48h，泡菜pH降至3.54＜ 3.6，總酸含量為0.34g/100g，泡菜成熟。自然發(fā)酵泡菜84h后，泡菜pH降至3.59＜3.6，總酸含量為0.32g/100g，泡菜成熟。泡菜發(fā)酵過程中，三種發(fā)酵泡菜汁液的pH均不斷降低、總酸含量不斷增加。然而，相比于復合菌劑發(fā)酵而言，自然發(fā)酵的酸度增加速度相對緩慢，增長幅度較小，兩者之間的差異明顯，這與熊濤［17］、壽禹亮等［18］的研究報道一致，其原因可能是發(fā)酵體系中含有許多雜菌如霉菌、酵母菌、細菌等，在發(fā)酵初期它們均能生長，與乳酸菌競爭營養(yǎng)，一定程度上抑制了乳酸菌的生長繁殖和產酸。由此分析可知，復合菌劑和老鹽水發(fā)酵泡菜可明顯縮短發(fā)酵周期，可提高生產效率。

圖1 三種方式泡菜發(fā)酵過程中pH和總酸的變化Fig.1 Changes of pH and acid concentration during fermenting process of 3 kinds pickles

2.3 三種方式發(fā)酵泡菜鹽度及亞硝酸鹽含量的變化

由圖2可知，三種發(fā)酵方式制成的泡菜在整個發(fā)酵過程中的鹽度總體呈上升趨勢。老鹽水發(fā)酵鹽度高于復合菌劑和自然發(fā)酵；復合菌劑發(fā)酵泡菜最終鹽度為2.9%左右，與自然發(fā)酵泡菜的鹽度相當。三種方式發(fā)酵的鹽度均低于四川低鹽泡菜的標準（食鹽含量≤6%）［19］，老鹽水發(fā)酵的鹽度明顯高于復合菌劑發(fā)酵和自然發(fā)酵，而復合菌劑和自然發(fā)酵兩者鹽度相當，鹽度均低于超低鹽泡菜的標準（食鹽含量≤3%）［19］。腌、泡菜的低鹽化，是當今食品發(fā)展的總趨勢［20-21］?；诎踩?、營養(yǎng)方面，復合菌劑發(fā)酵明顯優(yōu)于老鹽水發(fā)酵。

圖2 三種方式泡菜發(fā)酵過程中鹽度和亞硝酸鹽含量的變化Fig.2 Changes of saltand nitrite concentration during fermenting process of 3 kinds pickles

表2 三種方式發(fā)酵泡菜感官評價結果Table 2 Results of sensory evaluation for 3 kinds of pickles

三種泡菜發(fā)酵過程中，復合菌劑發(fā)酵與老鹽水發(fā)酵制得的泡菜亞硝酸鹽含量很低，復合菌劑發(fā)酵泡菜略低于老鹽水發(fā)酵泡菜；自然發(fā)酵泡菜在發(fā)酵24h后，亞硝酸鹽含量迅速升高，發(fā)酵60h，其含量為12.11mg/kg，是復合菌劑發(fā)酵泡菜亞硝酸鹽含量的8倍；復合菌劑發(fā)酵泡菜在發(fā)酵過程中亞硝酸鹽含量最高為1.51mg/kg，老鹽水發(fā)酵泡菜最高為2.80mg/kg，說明復合菌劑發(fā)酵泡菜能降低產品亞硝酸鹽含量。很多實驗表明，直投式菌劑或乳酸菌發(fā)酵泡菜可以降低泡菜中亞硝酸鹽的殘留量［22-23］。由于復合菌劑和老鹽水發(fā)酵液中的乳酸菌含量遠高于自然發(fā)酵中的乳酸菌含量，因此，前兩者發(fā)酵過程中能快速生成大量有機酸或降解酶，加快了亞硝酸鹽的降解［24］。亞硝酸鹽含量高低直接影響泡菜品質及食用安全性。從亞硝酸鹽的變化來看，相對于自然發(fā)酵泡菜來講，復合菌劑發(fā)酵泡菜食用更為安全。

2.4 三種方式發(fā)酵泡菜中乳酸菌數(shù)量的變化

如圖3所示，三種方式泡菜發(fā)酵過程中的乳酸菌數(shù)總體趨勢為上升后趨于穩(wěn)定。復合菌劑與老鹽水發(fā)酵泡菜中的乳酸菌活菌數(shù)初始值為106.5CFU/g左右，且明顯高于自然發(fā)酵泡菜。三種發(fā)酵方式發(fā)酵的泡菜中的乳酸菌數(shù)量在24h達到一定量，并趨于平衡。復合菌劑發(fā)酵泡菜中乳酸菌活菌數(shù)（108CFU/g）與老鹽水發(fā)酵相當，自然發(fā)酵的乳酸菌活菌數(shù)（107.5CFU/g）低于另外兩種發(fā)酵方式。在整個發(fā)酵過程中，復合菌劑和老鹽水發(fā)酵液中乳酸菌的數(shù)量一直高于自然發(fā)酵，也體現(xiàn)了其縮短泡菜發(fā)酵周期的作用。

圖3 三種方式泡菜發(fā)酵過程中乳酸菌數(shù)量變化Fig.3 Variation of LAB counts during fermenting process of 3 kinds pickles

2.5 泡菜循環(huán)發(fā)酵工藝中輔料配方的優(yōu)化結果

2.5.1 單因素實驗確定輔料的補加量 補加不同用量的食鹽、冰糖、香料汁制作的成熟泡菜的總酸、鹽度與第一次復合菌劑發(fā)酵泡菜的偏差結果見表3，并對不同因素各水平之間采用SPSS 19.0軟件進行了顯著性分析。由表3可知，食鹽、冰糖、香料汁的適宜補加量分別為3.5%、3.5%、3.5%。

表3 泡菜循環(huán)發(fā)酵中輔料補加量的單因素實驗結果Table 3 Single factor experiment result of adding auxiliarymaterials during cycle fermentation

2.5.2 泡菜循環(huán)發(fā)酵中輔料補加量的正交實驗結果

對泡菜循環(huán)發(fā)酵中輔料（食鹽、冰糖、香料汁）補加量的正交實驗及方差分析結果見表4、表5。由表5可知，原料補加量對泡菜總酸、鹽度影響的主次順序依次為香料汁、冰糖、食鹽，且影響為極顯著（p＜0.01），其最佳配方為食鹽3.5%，冰糖3.75%，香料汁3.75%。

表4 補加輔料用量正交優(yōu)化結果Table 4 Results of orthogonal optimization adding auxiliarymaterials

表5 方差分析結果Table 5 Results of variance analysis

2.5.3 循環(huán)發(fā)酵泡菜品質的比較

a.感官評價 第2～5次發(fā)酵的泡菜，在感官上均優(yōu)于第1次復合菌劑發(fā)酵的泡菜，其得分均在8.9以上（p＞0.05）。泡菜色澤好、清香撲鼻、咸淡適中、咀嚼有脆性、口感好。

b.理化指標 第1～5次發(fā)酵泡菜在發(fā)酵過程中總酸、鹽度和亞硝酸鹽的變化如圖4所示。循環(huán)發(fā)酵過程中，總酸基本維持在0.30g/100g左右（p＞0.05），鹽度略有上升趨勢，介于2.8g/100g到3.0g/100g之間。在第2次發(fā)酵時，亞硝酸鹽有明顯下降，2～5次發(fā)酵過程中一直維持一個低水平，小于0.37mg/kg，遠小于NY/T 437-2012綠色食品醬腌菜（≤4mg/kg）標準。

圖4 泡菜循環(huán)發(fā)酵中總酸、鹽度和亞硝酸鹽的變化Fig.4 Changes of acid concentration，salinity and nitrite during cycle fermentation

c.乳酸菌數(shù) 5次循環(huán)發(fā)酵過程中，乳酸菌活菌數(shù)大體維持穩(wěn)定，略有下降，基本維持在108CFU/g左右（p＞0.05）。

3 結論

通過比較復合菌劑發(fā)酵、老鹽水發(fā)酵、自然發(fā)酵三種泡菜在感官及理化指標、乳酸菌數(shù)的差異，表明復合菌劑發(fā)酵泡菜工藝可快速提高產酸速度，明顯縮短發(fā)酵時間，在泡菜品質以及食用安全性方面均優(yōu)于其他兩種發(fā)酵方式。通過控制發(fā)酵過程中輔料（食鹽、冰糖、香料汁）的補加量可實現(xiàn)泡菜的循環(huán)發(fā)酵，單因素實驗和正交優(yōu)化實驗確定了泡菜循環(huán)發(fā)酵過程中，菜水比1∶1，食鹽、冰糖、香料汁的補加量分別為3.50%、3.75%和3.75%，按此循環(huán)工藝生產的泡菜質量穩(wěn)定，可縮短泡菜生產周期，減少鹽水排放，為推進泡菜的產業(yè)化發(fā)展提供了參考。

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Optimization of auxiliary recipe and quality analysis of
pickles cycle fermentation by direct vat set com pound starters

HUANG Dao-mei1，SUN Juan1，LIU Shu-liang1，2，*，HU Xin-jie1，2，HAN Xin-feng1，2，HE Li1，2，ZHOU Kang1，2，YAN Zheng-cai3
（1.College of Food Science，Sichuan Agricultural University，Ya'an 625014，China；2.Key Laboratory of Agricultural Products Processing and Preservation Engineering of Sichuan Province，Ya'an 625014，China；3.Sichuan Jixiangju Food Co.，Ltd.，Meishan 620039，China）

Pediococcus pentosaceus and Lactobacillus plantarum were direct vat set（DVS）compound starters and the materials were radish，lettuce and so on.Studying dynamic changes fermenting process of 3 kinds pickles by DVS compound starters，bisk fermentation and natural fermentation in sensory indexes，physical and chemical indexes，microbiology indicators.And studying balance system with matured pickles，taking out matured pickles and adding material to realize the cycle of pickle fermentation.Results showed that pickles with compound starters had better sensory evaluation，lower concentration nitrite（the highestwas 1.51mg/kg），more lactic acid bacteria（about 108CFU/g）than other two fermentation manners.Control vegetable and water was 1∶1 and the adding quantity of sugar，salt and the juice of sp ices in the fermentation process could realized the cycle of pickles fermentation，single factor experiment and orthogonal experiment determined the adding quantity of salt，sugar and juice of sp ices were 3.50%，3.75%and 3.75%，respectively，and quality of each batch pickles was no obvious difference.

direct vat set com pound starters；cycle fermentation；pickles；auxiliary recipe；quality

TS201.1

A

1002-0306（2015）08-0191-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.08.031

2014－06－05

黃道梅（1989-），女，碩士研究生，研究方向：食品微生物。

*通訊作者：劉書亮（1968-），男，博士，教授，研究方向：食品微生物。

四川省科技廳科技支撐計劃（2013NZ0055）。