基于ITS和IGS1序列分析對(duì)云南牛肝菌的分類鑒定

岳萬(wàn)松，熊 勇，王燕彩，陳毅堅(jiān)，2，*

（1.云南民族大學(xué)化學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院，云南昆明650500；2.國(guó)家民委-教育部共建民族藥資源化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南昆明650500；3.昆明理工大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，云南昆明650500）

基于ITS和IGS1序列分析對(duì)云南牛肝菌的分類鑒定

岳萬(wàn)松1，熊 勇1，王燕彩3，陳毅堅(jiān)1，2，*

（1.云南民族大學(xué)化學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院，云南昆明650500；2.國(guó)家民委-教育部共建民族藥資源化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南昆明650500；3.昆明理工大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，云南昆明650500）

以采自云南地區(qū)的5個(gè)牛肝菌（Boletus sp.）樣品為材料，根據(jù)樣品的形態(tài)特征，并結(jié)合rDNA ITS和IGS1序列分析對(duì)5個(gè)樣品進(jìn)行分類鑒定，通過(guò)與GenBank上已登錄的牛肝菌序列比對(duì)，采用鄰接法（neighbor-joining，N-J）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。結(jié)果表明，所有供試材料的ITS和IGS1全長(zhǎng)分別在739～787bp和537～583bp范圍內(nèi)，GC含量分別在48.31%～51.01%和48.42%～52.89%之間，遺傳距離在0.017～0.248和0.002～0.225之間，上述數(shù)據(jù)表明云南5個(gè)牛肝菌樣品之間存在一定的遺傳差異。5個(gè)牛肝菌樣品的ITS和IGS1序列聚類分析均表明，供試樣品被分為兩大類，其中樣品YX1-2和QJ3-4聚為一個(gè)類群，樣品CX2-10、QJ3-5和YX1-3聚為另一個(gè)大的類群，兩種分析手段相互印證，且ITS序列聚類分析能將云南不同地點(diǎn)的牛肝菌鑒定到屬甚至種的水平，上述分析結(jié)果表明ITS和IGS1序列分析相結(jié)合可作為牛肝菌親緣關(guān)系鑒定的有效分子標(biāo)記方法。

牛肝菌，ITS序列，IGS1序列，分子鑒定

野生牛肝菌（Natural Boletus sp.），又名大腳菇，隸屬于真菌門(mén)，擔(dān)子菌亞門(mén)，層菌綱，傘菌目，牛肝菌科，牛肝菌屬［1］，是世界珍貴的一類食藥兼用的食用菌。主要分布在我國(guó)西南和華南地區(qū)及東北和華東沿海各省，云南是全球野生食用菌最為豐富的地區(qū)之一，尤其是牛肝菌資源［2］。野生牛肝菌富含多種氨基酸、活性多糖、蛋白質(zhì)和維生素等多種營(yíng)養(yǎng)成分［3］，其子實(shí)體具有提高人體免疫力、降血脂、抗衰老、抗疲勞、抗腫瘤及抗氧化等藥理作用［4-8］。

由于牛肝菌物種多樣性豐富，種間形態(tài)相似性高，形態(tài)學(xué)鑒定相對(duì)較困難，各種牛肝菌所含成分有差異，有的甚至含有毒素，但普通民眾一般是“以貌擇食”的方式來(lái)選擇食用牛肝菌，因此常有食用牛肝菌中毒的事件發(fā)生。因此，探索新的方法來(lái)鑒定商品牛肝菌中的混淆毒菌很有必要。

隨著分子生物學(xué)的快速發(fā)展，基因序列分析對(duì)比成為了現(xiàn)實(shí)，對(duì)真核生物rDNA的研究中，基于ITS序列分析鑒定食用菌的技術(shù)已被廣泛應(yīng)用［9-11］，此外，由于IGS區(qū)變異相對(duì)較快，且各重復(fù)單位間具有同步進(jìn)化的特點(diǎn)，因此也常用于種間、種內(nèi)、近緣類群、雜交類群等關(guān)系的研究［12］。在食用菌的研究中，已有研究者對(duì)香菇（Lentinus edodes）和白靈側(cè)耳（Pleurotus nebrodensis）商業(yè)栽培菌株的IGS1和IGS2區(qū)域進(jìn)行研究，表明這些食用菌種內(nèi)菌株間IGS序列存在顯著的差異［13-14］。但是以IGS序列堿基差異分析牛肝菌種內(nèi)的遺傳多樣性及系統(tǒng)演化關(guān)系的報(bào)道較少見(jiàn)。

本研究用PCR方法擴(kuò)增云南5個(gè)牛肝菌樣品的rDNA ITS和IGS1序列分析序列并測(cè)序，利用生物信息技術(shù)對(duì)測(cè)序結(jié)果分析比較，揭示牛肝菌系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，旨在為研究牛肝菌的系統(tǒng)演化規(guī)律以及品種間親緣關(guān)系提供一些新的分子生物學(xué)資料。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

牛肝菌 實(shí)驗(yàn)用5個(gè)新鮮牛肝菌子實(shí)體樣品，均于2013年8～9月分別購(gòu)自云南省玉溪市、曲靖市和楚雄市集貿(mào)市場(chǎng)，新鮮子實(shí)體用保鮮袋包裝帶回實(shí)驗(yàn)室，根據(jù)形態(tài)特征進(jìn)行初步分類（表1），表1中5個(gè)樣品形態(tài)特征的初步分離鑒定參考《中國(guó)大型真菌》［15］和《云南牛肝菌圖志》［16］；引物L(fēng)R12R、M-1和DNA MarKer北京博邁德生物；2×Power Taq PCR Master Mix

表1 供試牛肝菌樣品及來(lái)源Table 1 Tested strains of Boletus and origins

北京百泰克；

Eppedorf 5331 PCR儀 德國(guó)；GENE GENIUS凝膠成像系統(tǒng) 美國(guó)；DYY-GB電泳儀、DYCP-31DN電泳槽 北京六一。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 DNA提取 牛肝菌總DNA提取方法參照CTAB-SDS法［17-18］并加以改良，即醇析DNA時(shí)，使用2倍上清液體積的異丙醇要先在-20℃預(yù)冷，并同時(shí)加入1/10倍上清液體積的3mol/L KAc（pH 8.0），然后在4℃冰箱放置15m in來(lái)加速絮狀DNA的沉淀。用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)樣品DNA質(zhì)量。

1.2.2 PCR擴(kuò)增、測(cè)序 IGS1通用引物（LR12R：5'-CTGAACGCCTCTAAGTCAGAA-3'；M-1：5'-AACC ACAGCACCCAGGATTCCC-3'）［19］，ITS通用引物（ITS4：5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'；ITS5：5' -GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3'）［20］，2個(gè)序列PCR擴(kuò)增共用同一個(gè)50μL反應(yīng)體系，體系包括：25μL 2×Power Taq PCR M ixture，引物各2μL，5μL DNA模板，16μL ddH2O；ITS反應(yīng)條件：預(yù)變性94℃ 5min，94℃30s，52℃30s，72℃30s，35次循環(huán)，72℃10m in，4℃保存；IGS1反應(yīng)條件：預(yù)變性94℃5m in，94℃30s，56℃30s，72℃30s，35次循環(huán)，72℃10m in，4℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離，采用Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果。

1.2.3 PCR產(chǎn)物的純化、測(cè)序及系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建PCR產(chǎn)物用多功能DNA純化回收試劑盒回收，送昆明碩陽(yáng)科技有限公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果DNAMAN進(jìn)行拼接，將得到的序列提交GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)，并通過(guò)在線Blast工具從NCBI下載GenBank等數(shù)據(jù)庫(kù)內(nèi)已知同源序列多條作為參考序列。用MEGA 5.1軟件包進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析和系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建。用MEGA 5.1中的Kimura-2-parameter模式計(jì)算遺傳距離，所有對(duì)位排列結(jié)果中的空位或缺失數(shù)據(jù)作完全刪除處理，采用鄰接法（neighbor-joining，N-J）構(gòu)建聚類圖，系統(tǒng)樹(shù)的每個(gè)分支的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性分析以Bootstrap方法進(jìn)行檢驗(yàn)，重復(fù)次數(shù)為1000次。

2 結(jié)果與分析

2.1 5個(gè)牛肝菌樣品IGS1和ITS序列PCR擴(kuò)增結(jié)果

從圖1和圖2可見(jiàn)，5個(gè)牛肝菌樣品IGS1序列長(zhǎng)度約在500～700bp之間，ITS序列長(zhǎng)度約在700～900bp之間，PCR產(chǎn)物均出現(xiàn)清晰明顯的條帶，說(shuō)明實(shí)驗(yàn)所提的DNA質(zhì)量較好。

2.2 5個(gè)牛肝菌樣品IGS1和ITS序列的差異性分析

通過(guò)DNAMAN和MEGA 5.1對(duì)不同牛肝菌樣品測(cè)序結(jié)果分析，5個(gè)牛肝菌樣品YX1-2（白牛肝，玉溪易門(mén)）、YX1-3（紅見(jiàn)手青，玉溪易門(mén)）、QJ3-4（白牛肝，曲靖瀟湘）、QJ3-5（紅見(jiàn)手青，曲靖馬龍）和CX2-10（風(fēng)手青，楚雄紫溪山）的IGS1序列長(zhǎng)度為537～583bp，兩端切平后長(zhǎng)度為537bp，GC含量為48.42%～52.89%，ITS序列長(zhǎng)度為739～787bp，兩端切平后長(zhǎng)度739bp，GC含量為48.31%～51.01%（見(jiàn)表2）。

圖1 5個(gè)牛肝菌IGS1-PCR擴(kuò)增電泳圖Fig.1 Amplification profile of electrophoretogram IGS1-PCR of 5 boletus

圖2 5個(gè)牛肝菌ITS-PCR擴(kuò)增電泳圖Fig.2 Amplification profile of electrophoretogram ITS-PCR of 5 boletus

表2 牛肝菌rDNA IGS1和ITS序列的長(zhǎng)度和GC含量Table 2 Length and GC contents of Boletus rDNA IGS1 and ITS sequences

分析5個(gè)牛肝菌IGS1序列長(zhǎng)度，結(jié)果表明，YX1-2和CX2-10的IGS1序列長(zhǎng)度差異最大（46bp），YX1-2和CX2-10的GC含量差異也最大（4.47%），表明牛肝菌屬不同種的IGS1序列的長(zhǎng)度和GC含量存在較大差異，而樣品YX1-3和QJ3-5的IGS1序列不僅長(zhǎng)度相同（均為541bp），而且GC含量也相同（均為51.21%），說(shuō)明二者是屬內(nèi)親緣關(guān)系很近的種，YX1-2和QJ3-4的GC含量差異也較?。?.56%），二者親緣關(guān)系也較近。

分析5個(gè)牛肝菌ITS序列長(zhǎng)度，結(jié)果表明，YX1-2和CX2-10序列長(zhǎng)度差異最大（48bp）。YX1-2和QJ3-5的GC含量差異最大（2.7%），YX1-3和QJ3-5的GC含量差異最?。?.13%），說(shuō)明二者是牛肝菌屬內(nèi)親緣關(guān)系較近的種，YX1-2和QJ3-4的GC含量差異也是0.13%，二者同樣是親緣關(guān)系較近的種。這樣也與牛肝菌不同種IGS1序列的分析結(jié)果基本吻合，說(shuō)明采用IGS1和ITS序列分析相結(jié)合的分析手段對(duì)食用牛肝菌分類鑒定是可行的，而且可以相互印證，分析結(jié)果更加準(zhǔn)確有效。

2.3 5個(gè)牛肝菌樣品的遺傳多樣性分析

不同牛肝菌樣品間rDNA ITS和IGS1序列的遺傳距離及序列距離矩陣構(gòu)建采用MEGA5.1軟件中的Kimura-2-parameter模型進(jìn)行計(jì)算（見(jiàn)表3和表4）。

表3 不同牛肝菌IGS1序列的遺傳距離Table 3 Genetic distance among different kinds of Boletus IGS1 Sequence

分析表3結(jié)果表明，5個(gè)牛肝菌樣品YX1-2（白牛肝，玉溪易門(mén)）、YX1-3（紅見(jiàn)手青，玉溪易門(mén)）、QJ3-4（白牛肝，曲靖瀟湘）、QJ3-5（紅見(jiàn)手青，曲靖馬龍）和CX2-10（風(fēng)手青，楚雄紫溪山）的IGS1序列間的遺傳距離為0.002～0.225，平均0.145。其中，CX2-10與QJ3-4遺傳距離最大為0.225，二者親緣關(guān)系最遠(yuǎn)；其次，QJ3-5與QJ3-4，遺傳距離為0.212；YX1-3和QJ3-5遺傳距離最小為0.002，二者親緣關(guān)系最近；另外，YX1-2與QJ3-4的遺傳距離也較?。?.029），說(shuō)明二者也是牛肝菌屬內(nèi)親緣關(guān)系較近的兩個(gè)種。

表4 不同牛肝菌ITS序列的遺傳距離Table 4 Genetic distance among different strains of Boletus ITSSequence

分析表4結(jié)果表明，5個(gè)牛肝菌樣品YX1-2（白牛肝，玉溪易門(mén)）、YX1-3（紅見(jiàn)手青，玉溪易門(mén)）、QJ3-4（白牛肝，曲靖瀟湘）、QJ3-5（紅見(jiàn)手青，曲靖馬龍）和CX2-10（風(fēng)手青，楚雄紫溪山）的ITS序列間的遺傳距離為0.017～0.248，平均0.180。其中，CX2-10與YX1-2遺傳距離最大為0.248，二者親緣關(guān)系最遠(yuǎn)；其次，CX2-10與QJ3-4的遺傳距離為0.236；YX1-3和QJ3-5遺傳距離最小為0.017，二者親緣關(guān)系最近；另外，YX1-2與QJ3-4的遺傳距離也較小（0.033），說(shuō)明二者也是牛肝菌屬中親緣關(guān)系較近的種。采用ITS標(biāo)記對(duì)云南不同牛肝菌樣品遺傳距離和親緣關(guān)系的分析結(jié)果與IGS1標(biāo)記的分析結(jié)果基本吻合，上述結(jié)果表明IGS1和ITS序列分析相結(jié)合可以更準(zhǔn)確有效的分析牛肝菌屬內(nèi)不同種的親緣關(guān)系。

2.4 5個(gè)牛肝菌樣品的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析

通過(guò)在線Blast工具從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)內(nèi)下載已知的多條相似序列作為參考序列，比較它們的相似性，以NCBI中香菇的IGS1序列和ITS序列為聚類外群，用MEGA 5.1中的Kimura-2-parameter（K2P）模型，采用N-J法對(duì)不同牛肝菌進(jìn)行分析并構(gòu)建遺傳關(guān)系樹(shù)，自舉檢測(cè)1000次（見(jiàn)圖3和圖4）。

圖3 基于IGS1序列構(gòu)建的NJ系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.3 NJPhylogenetic tree based on IGS1 sequences

IGS1序列聚類分析結(jié)果表明，云南不同地點(diǎn)的5個(gè)牛肝菌樣品YX1-2（白牛肝，玉溪易門(mén)）、YX1-3（紅見(jiàn)手青，玉溪易門(mén)）、QJ3-4（白牛肝，曲靖瀟湘）、QJ3-5（紅見(jiàn)手青，曲靖馬龍）和CX2-10（風(fēng)手青，楚雄紫溪山）分為2個(gè)類群。YX1-2和QJ3-4聚為一個(gè)類群，自檢支持率為100%，雖然兩者生長(zhǎng)環(huán)境不同但親緣關(guān)系很近，Blast比對(duì)結(jié)果表明，二者與NCBI庫(kù)里的Boletus edulis、Boletus pinetorum和Boletus pinophlis菌株聚在一個(gè)大支上，但是YX1-2和QJ3-4與它們的相似性都低于95%，不能鑒定為屬內(nèi)同一品種。CX2-10、QJ3-5和YX1-3聚為另一個(gè)大的類群，自檢支持率為99%，且QJ3-5和YX1-3聚在一個(gè)小的分支上，兩者生長(zhǎng)環(huán)境的不同但親緣關(guān)系也很近，但是在NCBI庫(kù)里沒(méi)有找到與3個(gè)云南牛肝菌相似性比較高的菌株，不能確定三個(gè)樣品的種屬歸類。

圖4 基于ITS序列構(gòu)建的NJ系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.4 NJPhylogenetic tree based on ITSsequences

ITS序列聚類分析結(jié)果表明，云南不同地點(diǎn)的5個(gè)牛肝菌樣品YX1-2（白牛肝，玉溪易門(mén)）、YX1-3（紅見(jiàn)手青，玉溪易門(mén)）、QJ3-4（白牛肝，曲靖瀟湘）、QJ3-5（紅見(jiàn)手青，曲靖馬龍）和CX2-10（風(fēng)手青，楚雄紫溪山）分為2個(gè)類群。YX1-2和QJ3-4與NCBI庫(kù)里的Boletus edulis（美味牛肝菌）、Boletus aestivalis（夏牛肝菌）和Boletus reticulatus（網(wǎng)柄牛肝菌）等菌株聚在同一分支，形成自檢支持率為100%的廣義美味牛肝菌復(fù)合群，且Blast比對(duì)結(jié)果表明，QJ3-4與庫(kù)里的Boletus edulis GQ984158、Boletus aestivalis DQ131611和Boletus reticulatus AB821462等廣義美味牛肝菌的序列相似度都為99%，可以將QJ3-4與上述菌株同歸為廣義美味牛肝菌，YX1-2與庫(kù)里相似性最高的菌株是Boletus edulis EF646278，為97%，表明二者是牛肝菌屬內(nèi)親緣較近的種。CX2-10、QJ3-5和YX1-3聚為另一個(gè)大的類群，其中YX1-3和QJ3-5與NCBI庫(kù)里的Boletus magnificus DQ407260聚在一個(gè)小支上，自檢支持率為100%，且Blast比對(duì)結(jié)果表明，YX1-3和Boletus magnificus DQ407260的相似性高達(dá)99%，鑒定為Boletus magnificus（華麗牛肝菌），QJ3-5與它的相似性為98%，可以確定QJ3-5菌株是牛肝菌屬內(nèi)與Boletus magnificus親緣關(guān)系很相近的種，CX2-10與NCBI庫(kù)里的Boletus speciosus JN903703和Boletus speciosus JN903701相似性分別為98%和97%，三者聚在大類群中是一個(gè)小分支上，自檢支持率為100%，表明CX2-10是牛肝菌屬中與Boletus speciosus（小美牛肝菌）親緣關(guān)系很近的種。

3 結(jié)論與討論

通過(guò)傳統(tǒng)的分類學(xué)手段，對(duì)云南不同地點(diǎn)的5個(gè)牛肝菌樣品進(jìn)行了初步分類鑒定（見(jiàn)表1），并結(jié)合ITS和IGS1序列分析對(duì)不同菌株進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，結(jié)果表明，將QJ3-4鑒定為廣義美味牛肝菌，YX1-3鑒定為Boletusmagnificus（華麗牛肝菌）。此外，YX1-2和Boletus edulis EF646278（美味牛肝菌）相似性為97%，QJ3-5和Boletus magnificus DQ407260（華麗牛肝菌）相似性為98%，CX2-10和Boletus speciosus JN903703（小美牛肝菌）的相似性分為98%，雖然不能將它們與NCBI庫(kù)里的菌種歸為同一個(gè)種，但是可以確定它們是牛肝菌屬內(nèi)親緣關(guān)系較近的種。

云南特殊的生境資源，孕育了豐富的大型真菌資源，生態(tài)復(fù)雜使得云南牛肝菌生物多樣性豐富，種間形態(tài)相似性較高，通過(guò)傳統(tǒng)的生物學(xué)手段難以鑒定大型真菌，因此需要采用形態(tài)學(xué)并結(jié)合分子生物學(xué)手段對(duì)其進(jìn)行鑒定，近年來(lái)，ITS標(biāo)記都具有快速、準(zhǔn)確、標(biāo)準(zhǔn)化、引物通用性強(qiáng)、擴(kuò)增成功率高、便于高通量測(cè)序與分析等優(yōu)點(diǎn)，因此被廣泛應(yīng)于真菌系統(tǒng)發(fā)育、種間和種內(nèi)遺傳多樣性的研究［21-23］，由于IGS區(qū)變異相對(duì)較快，且各重復(fù)單位間具有同步進(jìn)化的特點(diǎn)，因此也常用于種間、種內(nèi)、近緣類群、雜交類群等關(guān)系的研究，但是相關(guān)報(bào)道較少，目前，只見(jiàn)IGS標(biāo)記應(yīng)用于香菇和白靈側(cè)耳等少數(shù)食用真菌的遺傳多樣性研究中［13-14］。

本文的研究結(jié)果表明，ITS序列聚類分析能將云南不同產(chǎn)地的牛肝菌鑒定到屬甚至種的水平，表明ITS序列分析是牛肝菌分離鑒定的有效分子手段之一，且本研究采用的IGS1序列聚類分析與ITS序列聚類分析結(jié)果基本一致，二個(gè)聚類發(fā)育樹(shù)都將云南不同地點(diǎn)的5個(gè)牛肝菌樣品分為兩個(gè)類群。兩種分析手段相互印證，使分析結(jié)果更加準(zhǔn)確有效，所以ITS和IGS1序列分析相結(jié)合可作為牛肝菌親緣關(guān)系鑒定的有效分子標(biāo)記方法。

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Molecular identification of different Boletus in Yunnan based on ITS and IGS1 sequence analysis

YUEW an-song1，XIONG Yong1，WANG Yan-cai3，CHEN Yi-jian1，2，*
（1.School of Chemistry and Bio-technology，Yunnan Minzu University，Kunming 650500，China；2.Key Lab of National Medicine Supported Jointly by State Ethnic Affairs Commission and Ministry of Education，Kunming 650500，China；3.School of Environmental Sciences and Engineering，Kunming University of Science and Technology，Kunming 650500，China）

The morphyological characters of five kinds of Boletus in Yunnan were observed，and their rDNA ITSand IGS1 sequences of were measured，analysed and contrasted with the sequences of Boletus having beenlogged in GenBank. Phylogenetic tree was constructed by the obtained molecular data. The results showedthat the total length of all the tested material ITS and IGS1 was respectively within the scope of 739～787bp and537～538bp. the content of GC was respectively within the scope of 48.31％～51.01％ and 48.42％～52.89％，therange of genetic distances was respectively between 0.017～0.248 and 0.002～0.225. The datas showed thatthere was certain genetic differences between five kinds of Boletus. The five kinds of Boletus could be dividedinto two groups by their ITS and IGS1 sequence clustering analysis，YX1-2 and QJ3-4 formed in one group，CX2-10，QJ3-5 and YX1-3 formed into another group，two analytical methods confirm each other，and fivesamples from different regions of Yunnan were identified to genus level and even species based on the ITSsequence clustering analysis，it showed that combining the ITS with IGS1 sequences could effectively identifythe genetic relationship of Boletus.

Boletus；Internal transcribed spacer；Intergenic spacer 1；molecular identification

TS201.1

A

1002-0306（2015）08-0186-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.08.030

2014－07－07

岳萬(wàn)松（1990-），男，碩士研究生，研究方向：食用菌資源開(kāi)發(fā)和利用。

*通訊作者：陳毅堅(jiān)（1966-），女，博士，教授，研究方向：民族藥資源開(kāi)發(fā)和利用。

云南民族大學(xué)教育部民委共建重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放基金項(xiàng)目（MZY1104）；云南省生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)示范中心建設(shè)項(xiàng)目（0205-2001015209）；云南民族大學(xué)生物技術(shù)核心教學(xué)團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目（0205-02010008）。