應(yīng)用三種方法觀察副溶血性弧菌生物被膜

藍(lán) 英，郭卓然，付嬌嬌，潘迎捷，2，3，趙 勇，2，3，*

（1.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海201306；2.農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品貯藏保鮮質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評估實(shí)驗(yàn)室，上海201306；3.上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心，上海201306）

應(yīng)用三種方法觀察副溶血性弧菌生物被膜

藍(lán) 英1，郭卓然1，付嬌嬌1，潘迎捷1，2，3，趙 勇1，2，3，*

（1.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海201306；2.農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品貯藏保鮮質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評估實(shí)驗(yàn)室，上海201306；3.上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心，上海201306）

采用三種方法（結(jié)晶紫染色法、熒光顯微鏡法、掃描電鏡法）觀察了兩株分離自食品中的副溶血性弧菌Vp8和Vp32在4℃條件下的生物被膜形成情況，旨在為進(jìn)一步研究低溫條件下副溶血性弧菌生物被膜提供依據(jù)。結(jié)果表明：三種觀察方法所得結(jié)果基本一致，Vp8有大量生物被膜形成，而Vp32幾乎沒有生物被膜形成。結(jié)論：在副溶血性弧菌生物被膜的研究中，各種觀察方法各有利弊，可根據(jù)不同實(shí)驗(yàn)室條件或不同研究需求選擇合適的觀察方法。

副溶血性弧菌，生物被膜，結(jié)晶紫染色，熒光顯微鏡，掃描電鏡

細(xì)菌生物被膜（Bacterial biofilm）是指單一或多種細(xì)菌為適應(yīng)周圍環(huán)境，附著于載體（塑料、金屬、醫(yī)療植入材料和人體組織等）的表面，由細(xì)菌及其自身分泌的聚合性含水基質(zhì)包裹而形成的聚集物，其主要成分包括多糖基質(zhì)、纖維蛋白、脂蛋白、胞外DNA等。生物被膜中的細(xì)菌對各種物理、化學(xué)、生物學(xué)的應(yīng)激反應(yīng)均不敏感，尤其對抗菌類藥物的敏感性顯著降低［1-3］。由于生物被膜中的細(xì)菌可以抵抗宿主免疫應(yīng)答，較浮游態(tài)細(xì)菌對抗生素耐藥性更強(qiáng)（達(dá)到1000倍），這就使得常規(guī)的殺菌方法不能有效滅菌，并且從生物被膜中分離出來的細(xì)胞將進(jìn)一步轉(zhuǎn)變?yōu)槌掷m(xù)污染源，因而由細(xì)菌生物被膜引起的污染尤其難治［4-5］。副溶血性弧菌是一種廣泛存在于海水，海底沉積物以及魚、蝦、貝等海產(chǎn)品中的常見革蘭氏陰性嗜鹽細(xì)菌［6］，是海水養(yǎng)殖中的一種重要的條件致病菌，也是我國沿海地區(qū)食物中毒和夏季腹瀉的重要病原，已經(jīng)高居微生物性食物中毒首位［7-8］。選擇適宜觀察方法評估副溶血性弧菌生物被膜形成能力對有效控制和清除食品加工過程中的副溶血性生物被膜污染具有重要意義。目前生物被膜的常用觀察方法主要有剛果紅實(shí)驗(yàn)、結(jié)晶紫染色法、銀染法、熒光顯微鏡、掃描電鏡或激光共聚焦掃描顯微鏡法等，均為表性檢查方法［9］。

本文采用三種方法（結(jié)晶紫染色法、熒光顯微鏡法、掃描電鏡法）觀察了兩株副溶血性弧菌在4℃條件下的生物被膜形成情況，從準(zhǔn)確性、靈敏度、成本及檢測速度等方面比較了三種方法的優(yōu)缺點(diǎn)，以期為副溶血性弧菌生物被膜的研究提供一定的方法依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

副溶血性弧菌菌株來源及基因型見表1。

表1 副溶血性弧菌菌株來源及基因型Table 1 The source and genotype of vibrio parahaemolyticus

乙醇 上海展云化工有限公司，分析純；氯化鈉 上海生工生物工程有限公司，分析純；胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基 TSB，北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司。

24孔板、96孔板 上海生物工程有限公司；BioTek多功能酶標(biāo)儀 基因有限公司；搖床 江蘇環(huán)宇科學(xué)儀器廠；熒光顯微鏡 卡爾蔡司有限公司；掃描電鏡 日本株式會(huì)社日立制作所。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 種子液的獲得 將副溶血性弧菌接種于含5m L TSB［含3%（W/V）NaCl，下同］的試管中，37℃、180r/min搖床培養(yǎng)10h，連續(xù)活化2次，至OD600=0.6，作為種子液。

1.2.2 菌液制備 將所得種子液用TSB按1∶100的比例進(jìn)行稀釋，取1m L稀釋后的菌液置于24孔板中37℃培養(yǎng)24h，隨后移至4℃靜置貯藏24h。

1.2.3 結(jié)晶紫染色 將1.2.2中24孔板取出，移除菌液，加入1.5m L 0.1mol/L磷酸鹽緩沖液（pH=8.0）清洗兩次，去除浮游菌體。加入1m L 0.1%（W/V）的結(jié)晶紫染液在室溫下染色30min，吸水紙吸掉染料后，再用0.1mol/L磷酸鹽緩沖液清洗三次，將其置于60℃烘箱中干燥30min，然后加入1m L 95%乙醇，檢測其在570nm條件下的吸光值（OD570）［10-11］。以新鮮TSB培養(yǎng)基為陰性對照，每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。

1.2.4 熒光顯微鏡 將24孔板取出，移除菌液，加入0.1mol/L磷酸鹽緩沖液清洗三次，去除懸浮的菌體。用4%（v/v）戊二醛磷酸鹽緩沖液在4℃條件下固定2h，加入0.1mol/L磷酸鹽緩沖液清洗三次，用SYBR GreenⅠ（1∶100000）染色30m in。再用0.1mol/L磷酸鹽緩沖液清洗三次，制作成載玻片置于熒光顯微鏡下觀察細(xì)菌生物被膜形成情況［12］。

1.2.5 掃描電鏡 將24孔板取出，移除菌液，加入0.1mol/L磷酸鹽緩沖液清洗三次，去除浮游菌體。加入2.5%（v/v）戊二醛磷酸鹽緩沖液置于4℃靜置過夜，再用0.1mol/L磷酸鹽緩沖液清洗三次，每次10m in。然后樣品用1%鋨酸室溫下固定1h，固定完成后用0.1mol/L磷酸鹽緩沖液清洗三次，每次10m in。然后分別用30%、50%、70%和90%乙醇脫水10min，100%乙醇脫水三次，每次10m in，樣品用乙酸異戊酯處理兩次，每次15min。將脫水樣品在臨界點(diǎn)干燥器干燥5h后噴金，掃描電鏡下觀察副溶血性弧菌生物被膜形成情況［13］。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

結(jié)晶紫染色數(shù)據(jù)處理與分析：以新鮮TSB培養(yǎng)基所測得的OD值作為對照，以該值的兩倍（ODc）為臨界值，將菌株被膜的形成分為以下4類：強(qiáng)生物被膜形成OD＞4ODc，中等被膜形成2ODc＜OD≤4ODc，弱生物被膜形成ODc＜OD≤2ODc和無生物被膜形成OD≤ODc［8］。

2 結(jié)果與討論

2.1 結(jié)晶紫染色法觀察副溶血性弧菌生物被膜形成狀況

采用結(jié)晶紫染色方法檢測Vp8和Vp32在4℃靜置貯藏24h后的生物被膜形成情況，以570nm條件下吸光度值的高低表示被膜形成量的多少。結(jié)果如表2所示，以新鮮TSB培養(yǎng)基測得的OD570值0.09作為對照，ODc為0.18。由表2可知，Vp8的OD570是ODc的19.65倍，因而可以判定Vp8為強(qiáng)生物被膜形成；Vp32的OD570＜ODc，因而可以判定Vp32無生物被膜形成。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在相同條件下，不同的菌株有不同的生物被膜形成情況。李燕等［9］對臨床分離的45株表皮葡萄球菌采用結(jié)晶紫染色法進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)有18株有生物被膜形成，其余27株無生物被膜形成。生物被膜的形成是一個(gè)復(fù)雜耗時(shí)的多基因調(diào)控、多因子參與的過程，已有研究表明aphA對副溶血性弧菌生物被膜的形成有影響［14］。

利用生物被膜內(nèi)物質(zhì)可以與結(jié)晶紫染料結(jié)合的特點(diǎn)，可以通過染色的方法對生物被膜進(jìn)行定性或定量的分析。如果過程中著色較深說明生物被膜形成比較成熟，如果著色較淺則說明生物被膜基本沒有形成或牢固度不夠。結(jié)晶紫染色法簡單、快捷、價(jià)格低廉、對實(shí)驗(yàn)條件要求較低，可用于實(shí)驗(yàn)室對生物被膜形成能力的半定量研究。但結(jié)晶紫染色法操作費(fèi)力，難于標(biāo)準(zhǔn)化，此外，該方法只測量了細(xì)菌生物量而不是生物被膜的細(xì)胞活力［15］。已有不同的研究表明清洗條件（步驟、自動(dòng)化、水、磷酸緩沖液等），結(jié)晶紫的持續(xù)時(shí)間，結(jié)晶紫濃度等都會(huì)對結(jié)果造成顯著影響［16-17］。

表2 副溶血性弧菌Vp8和Vp32在4℃靜置貯藏24h后OD570Table 2 The OD570of Vp8 and Vp32 under 4℃for 24h

2.2 熒光顯微鏡法觀察副溶血性弧菌生物被膜形成狀況

熒光顯微鏡法用SYBR GreenⅠ對生物被膜進(jìn)行染色，觀察Vp8和Vp32在4℃靜置貯藏24h后的生物被膜形成情況。由圖1可知，Vp8形成了典型的多細(xì)胞聚集的生物被膜結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)覆蓋了材料表面的大部分，熒光強(qiáng)度較強(qiáng)。而Vp32則呈單細(xì)胞分布，并沒有形成明顯的細(xì)菌聚集，熒光強(qiáng)度也較弱。由熒光顯微鏡觀察結(jié)果可知：Vp8有大量生物被膜形成，而Vp32則無生物被膜形成。此方法觀察結(jié)果與結(jié)晶紫染色法所得結(jié)果一致。SYBR GreenⅠ會(huì)與生物被膜內(nèi)物質(zhì)結(jié)合，結(jié)合后其熒光信號會(huì)大大增強(qiáng)，可判斷物體的形狀及其所在位置。

熒光顯微鏡法對實(shí)驗(yàn)條件要求較低，價(jià)格較低廉，耗時(shí)較短，可觀察到細(xì)菌大量聚集在一起，但不能進(jìn)行定量檢測，可用于實(shí)驗(yàn)室對生物被膜形態(tài)的初步觀察。在染色的過程中生物被膜會(huì)受到染色試劑的影響，其結(jié)構(gòu)形態(tài)可能會(huì)發(fā)生不同程度的改變。另外熒光顯微鏡法只能初步觀察細(xì)菌生物被膜的表層現(xiàn)象，無法對被膜內(nèi)層結(jié)構(gòu)和生理學(xué)現(xiàn)象進(jìn)行觀察［18］

圖1 Vp8和Vp32生物被膜熒光顯微鏡圖片（×400）Fig.1 The fluorescencemicroscope images of biofilms of Vp8 and Vp32（×400）

2.3 掃描電鏡法觀察副溶血性弧菌生物被膜形成狀況

圖2為采用掃描電鏡法觀察Vp8和Vp32在4℃靜置貯藏24h后的被膜形成情況。由圖2可知，Vp8大量聚集在一起且被胞外聚合物包圍，細(xì)菌嵌入生物被膜內(nèi)部，菌體表面有隆起和凹陷，形成明顯的皺褶，在微菌落中，細(xì)菌與細(xì)菌間有絲狀連接；Vp32在相同條件下幾乎無細(xì)菌聚集體及胞外聚合物的形成。由掃描電鏡結(jié)果可知：Vp8有大量生物被膜形成，Vp32無生物被膜形成。該方法所得結(jié)果與前兩種方法結(jié)果相一致。

圖2 Vp8和Vp32生物被膜掃描電鏡圖片F(xiàn)ig.2 The scanning electronmicroscope images of biofilms of Vp8 and Vp32

掃描電鏡是一種定性觀察微生物的方法，由于掃描倍數(shù)高，成像清晰，立體感強(qiáng)，可以清晰地觀察到生物被膜內(nèi)存在細(xì)菌聚集成團(tuán)的現(xiàn)象，且細(xì)胞間有纖維樣連結(jié)。因此，該法可很好的用于生物被膜形態(tài)學(xué)方面的鑒定，其結(jié)果更準(zhǔn)確、可靠，被認(rèn)為是檢測生物膜形成能力的“金標(biāo)準(zhǔn)”，適用于高靈敏度觀察的實(shí)驗(yàn)［19］。但掃描電鏡法耗時(shí)長，對實(shí)驗(yàn)條件要求高，也不能進(jìn)行定量檢測，且在操作中需要固定及脫水處理，容易破壞生物被膜的結(jié)構(gòu)引起實(shí)驗(yàn)假象，且價(jià)格昂貴，難以滿足實(shí)驗(yàn)室對生物膜形成能力的評估要求，不宜做常規(guī)檢測。

3 結(jié)論

生物被膜的形成是細(xì)菌為適應(yīng)自然環(huán)境而采取的策略，任何細(xì)菌在成熟條件下都可以形成生物被膜［20］。本文分別比較研究了結(jié)晶紫染色法、熒光顯微鏡法和掃描電鏡法三種不同的方法觀察副溶血性弧菌生物被膜形成情況。三種觀察方法所得結(jié)果一致：Vp8有大量生物被膜形成，Vp32幾乎無生物被膜形成。

總之，副溶血性弧菌生物被膜形成能力的觀察對有效控制和清除食品加工過程中的副溶血性生物被膜污染具有重要意義。隨著對生物被膜研究的不斷深入，用于細(xì)菌生物被膜形成能力的檢測方法種類會(huì)越來越多，但如何提高細(xì)菌生物被膜的檢測水平，建立快速、靈敏、準(zhǔn)確的檢測方法，并且研制出簡便、特異的檢測試劑盒應(yīng)用于生產(chǎn)，將會(huì)是今后研究的重要內(nèi)容。

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Applied three methods to observe biofilms of Vibrio parahaemolyticus

LAN Ying1，GUO Zhuo-ran1，F(xiàn)U Jiao-jiao1，PAN Ying-jie1，2，3，ZHAO Yong1，2，3，*
（1.College of Food Science and Technology，ShanghaiOcean University，Shanghai201306，China；2.Shanghai Engineering Research Center of Aquatic-Product Processing&Preservation，Shanghai201306，China；3.Laboratory of Quality＆Safety Risk Assessment for Aquatic Products on Storage and Preservation（Shanghai），Ministry of Agriculture，Shanghai201306，China）

Methods（crystalviolet staining，fluorescence microscope，scanning electron microscope）were app lied to observe biofilms of Vibrio parahae molyticus（Vp8 and Vp32）at4℃，in order to lay a foundation for the further study of Vibrio parahaemolyticus under the condition of low temperature.The results showed that Vp8 could be considered as strong biofilm producers while Vp32 was negative.Conclusion:Each method had its advantages and disadvantages，thus an appropriate method could be selected depending on the condition of laboratory or the study demanding.

vibrio parahaemolyticu；biofilm；crystal violet staining；fluorescence microscope；scanning electron microscope

TS201.3

A

1002-0306（2015）08-0183-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.08.029

2014－07－15

藍(lán)英（1990-），女，碩士研究生，研究方向：食品安全。

*通訊作者：趙勇（1975-），男，博士，教授，研究方向：食品安全。

國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（31271870）；上海市科委計(jì)劃項(xiàng)目（14DZ1205100，14320502100，12391901300）；上海市科技興農(nóng)重點(diǎn)攻關(guān)項(xiàng)目（滬農(nóng)科攻字2014第3-5號）。