疏花水柏枝內(nèi)生真菌對三峽地區(qū)柑橘致腐菌的拮抗作用研究

孔玉珊，秦田明，薛艷紅，劉士平

（三峽大學生物與制藥學院，湖北宜昌443002）

疏花水柏枝內(nèi)生真菌對三峽地區(qū)柑橘致腐菌的拮抗作用研究

孔玉珊，秦田明，薛艷紅，劉士平*

（三峽大學生物與制藥學院，湖北宜昌443002）

從三峽地區(qū)自然腐爛的柑橘果實上分離出一株優(yōu)勢致腐菌，經(jīng)rDNA-ITS序列分析，發(fā)現(xiàn)該菌最近源的屬系鐮刀菌屬（Fusarium）和赤霉菌屬（Gibberella）。同時采用了抑菌圈法分析了三峽地區(qū)本地物種疏花水柏枝（Myricaria laxiflora）內(nèi)生真菌對柑橘致腐菌的拮抗作用，結果表明在12株高抗氧化活性的內(nèi)生菌中，有6株內(nèi)生真菌具有較好的拮抗效果，其中QY1顯示出較好的抗氧化性和抑菌活性，對三峽地區(qū)柑橘的生物保鮮和防腐有著積極的作用。

疏花水柏枝，內(nèi)生菌，柑橘，抑菌，抗氧化

三峽地區(qū)是我國優(yōu)質(zhì)柑橘的主產(chǎn)區(qū)之一［1］。但是柑橘采后迅速發(fā)生后熟，導致大量的柑橘腐爛，造成巨大的經(jīng)濟損失。柑橘腐爛主要是由于表面的青霉、綠霉等病原真菌導致的霉變，其營養(yǎng)物質(zhì)將會發(fā)生氧化而變質(zhì)［2-3］。因此抑制這些病原微生物的生長，有助于柑橘的抗氧化、防腐及保鮮。傳統(tǒng)上使用冷藏、氣調(diào)、打蠟等工藝進行防腐保鮮，但這些方法因成本高或者效果不太好逐漸遭到淘汰［4］?；瘜W保鮮法可用來控制柑橘的采后病害，但處理后果品容易變味，糖分降低，同時誘發(fā)病原菌的抗藥性，還面臨食品安全問題［4］。

生物保鮮法為解決上述問題提供了新的契機。一些細菌、酵母或絲狀真菌配合一些植物次生代謝產(chǎn)物（主要作為抗氧化劑）能有效控制果實的采后病害，能保持原有風味和營養(yǎng)，是果品貯運保鮮的新潮流［5-7］。由于植物的內(nèi)生菌不會對植物造成不利影響，近年來也成為生物保鮮劑的一大熱點。

疏花水柏枝（Myricaria laxiflora）分布于三峽庫區(qū)長江兩岸消落帶中，每年要經(jīng)受4個月以上的淹水脅迫（氧化脅迫的一種）［8］。在前期研究中本實驗室在淹水脅迫前后的疏花水柏枝中分離出26屬163株內(nèi)生真菌，發(fā)現(xiàn)其內(nèi)生菌具有極強的抗氧化能力（另文發(fā)表）。本實驗在分離鑒定三峽地區(qū)柑橘優(yōu)勢致腐菌的基礎上，篩選了對其具有拮抗作用的疏花水柏枝高抗氧化內(nèi)生菌，以期將抗氧化作用和柑橘致腐拮抗菌的篩選結合，為適合三峽地區(qū)柑橘生物保鮮劑的開發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

疏花水柏枝內(nèi)生真菌 為本實驗室篩選和保藏；馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）（g/L） 馬鈴薯200、葡萄糖20、瓊脂15～20，自然pH；次氯酸鈉溶液 天津市天力化學試劑有限公司；液氮 宜昌藍天氣體有限公司；總抗氧化能力（T-AOC）試劑盒 南京建成生物工程研究所；真菌Ezup柱式基因組DNA抽提試劑盒、引物ITS1、ITS4 上海生工生物工程股份有限公司；dNTP、10×PCR buffer、ExTaq酶 寶生物工程（大連）有限公司。

潔凈工作臺 蘇凈集團蘇州安泰空氣技術有限公司；PH-030A型培養(yǎng)箱 上海一恒科學儀器有限公司；MyCycler PCR儀 美國BIO-RAD公司；GDS-8000凝膠成像系統(tǒng) 美國UVP公司；DYCP-31DN型水平電泳儀 北京市六一儀器廠。

1.2 柑橘采后腐爛優(yōu)勢菌的分離與檢測

從宜昌地區(qū)自然發(fā)病、完全腐爛的柑橘果實挑取孢子接種于PDA培養(yǎng)基中，28℃培養(yǎng)7d，經(jīng)多次劃線分離得純種菌株。將純化培養(yǎng)的菌株用無菌水配制成菌懸液，調(diào)至105cfu/m L。柑橘果實用2%次氯酸鈉溶液浸泡2min，無菌水洗凈，用接種針在柑橘果實赤道處對稱刺4個直徑3mm、深3mm的傷口，在傷口處分別接種20μL孢子懸浮液，晾干，于28℃培養(yǎng)觀察果實發(fā)病情況［9］。

1.3 致腐菌的分子鑒定

將純化菌株接種于PDA液體培養(yǎng)基，28℃，120r/m in培養(yǎng)4d后，10000r/m in離心10m in，將菌絲液氮研磨至粉碎，用真菌Ezup柱式基因組DNA抽提試劑盒提取DNA。采用引物ITS1（5'-TCCGTAGGTGA ACCTGCGG-3'）與ITS4（5'-TCCTCCGCTTATTGATA TGC-3'）進行PCR擴增。PCR反應體系：模板DNA 1.0μL，dNTP 2.0μL，10×PCR Buffer 2.0μL，引物各1.0μL，ExTaq酶0.2μL，用ddH2O補至20μL。反應條件：94℃預變性5min，94℃變性1min，56℃退火30s，72℃延伸1m in，共33個循環(huán)，72℃終延伸10m in。將PCR擴增的ITS片段回收后送往上海生工武漢測序部進行雙向測序，測序結果在Genbank進行BLAST比對和同源性分析［10］。

1.4 疏花水柏枝內(nèi)生菌對致病菌的抑菌作用分析

將淹水脅迫前后有氧或無氧條件下疏花水柏枝的根、莖、葉中分離的內(nèi)生真菌進行拮抗菌的篩選，用總抗氧化能力（T-AOC）試劑盒測定，選擇12株有高抗氧化活性（＞15U/m L）的內(nèi)生真菌，經(jīng)過18S ITS序列比對后確定到屬，具體菌株信息見表1。

將純化的致病菌接種在PDA斜面培養(yǎng)基上，28℃下培養(yǎng)3d，加入9m L無菌水，刮下孢子，將500μL孢子懸液涂布均勻在PDA固體培養(yǎng)基上。用直徑8mm的無菌打孔器在生長4d的疏花水柏枝內(nèi)生真菌菌落邊緣切取菌餅，接種至涂布致腐菌的平板上以篩選拮抗真菌，于25℃恒溫培養(yǎng)2d，測量抑菌圈直徑。

2 結果與分析

2.1 致腐菌的分離及驗證

從自然狀態(tài)下完全腐爛的宜昌本地柑橘上分離出一株致腐菌，該菌生長迅速，自然狀態(tài)下呈優(yōu)勢生長。經(jīng)過反復純化獲得單菌落，由圖1可見在PDA培養(yǎng)基上菌落呈絨狀，圓形，疏松，扁平，生長較快；菌絲體為白色，后形成灰綠色霉層，邊緣菌絲帶白色，較寬，基質(zhì)顏色為白色。顯微鏡檢觀察其分生孢子串生，呈橢圓形，菌絲分枝且有具橫隔（圖1）。

圖1 致腐菌的形態(tài)觀察Fig.1 Morphologic character of the rot-causing pathogen

新鮮的柑橘果實在接種菌株致腐菌的孢子懸浮液后，1d后開始發(fā)病。2d后在傷口周圍形成約2cm的病斑，果皮變軟，之后病斑快速擴大，全果變軟，表皮開始長出白色菌體，然后其生長出大量的孢子，最后形成灰綠色霉層，果皮變?yōu)楹稚?，相比之下，對照卻依舊呈健康的橘黃色。根據(jù)柯赫氏法則［11］，判定所分離得到的菌株為柑橘采后腐爛的優(yōu)勢致腐菌。

2.2 致腐菌的分子鑒定

將獲得的致腐菌的ITS片段利用特異引物雙向測序后，經(jīng)過DNASTAR軟件的拼接，將測序結果（該致腐菌的序列號為KM 496478）在GenBank上進行比對分析，發(fā)現(xiàn)三峽地區(qū)柑橘采后腐爛的優(yōu)勢致病菌最近源的是鐮刀菌屬，但是序列同源性不高，與Fusarium culmorum、Fusarium gram inearum、Fusarium cortaderiae、Fusarium acum inatum的同源性只有88%，此外，與赤霉菌屬中的Gibberella zeae的同源性也達88%。因此對于三峽地區(qū)柑橘的致腐菌還不能確定其種屬，但是與前人報到的青霉和綠霉相差甚遠。

2.3 疏花水柏枝內(nèi)生真菌對致病菌的抑菌作用

12株高抗氧化活性的疏花水柏枝內(nèi)生真菌中有6株對致腐菌有明顯抑制效果，分別是QY1、HY1、HG2、SG4、SG5和SG17。其中QY1和SG4的抑菌效果最明顯，抑菌圈直徑分別達到23.30mm和22.12mm。其抑菌效果的強弱排序為：QY1＞SG4＞HY1＞SG17＞SG5＞HG2（表2）。其中QY1的抗氧化性和抑菌活性都是最強的，但是分析表明，抗氧化性和抑菌活性之間并沒有顯著的相關性，有些具有較高抗氧化活性的菌株卻沒有抑菌活性。根據(jù)6株具有抑菌效果的內(nèi)生菌的抗氧化值，兩者之間的相關系數(shù)只有0.51，因此菌株QY1的篩選綜合考慮了抗氧化作用和抑菌作用，對于柑橘的生物保鮮和防腐具有積極的意義。

根據(jù)內(nèi)生菌的來源和三峽地區(qū)柑橘致腐菌的抑菌效果，結果表明從疏花水柏枝分離的內(nèi)生真菌中，共有6株具有抑菌效果，其中4株來自于根，2株來自于葉。淹水前分離的內(nèi)生菌中，根部有3株、葉部有1株對柑橘致腐菌具有抑菌效應；淹水后分離的內(nèi)生菌中，根和葉各有1株對柑橘致腐菌具有抑菌效應。說明在具有抑菌效果的疏花水柏枝內(nèi)生真菌中，淹水前的多于淹水后的；根部的多于葉片的。

表1 供試的12株疏花水柏枝高抗氧化活性內(nèi)生真菌Table 1 12 endophytes from Myricaria laxiflora and their antioxidant capacity

表2 具高抗氧化能力疏花水柏枝內(nèi)生真菌對柑橘致病菌的抑制效果Table 2 Antimicrobial activity of endophytic fungi from Myricaria laxiflorawith high antioxidant capacity

3 結論

3.1 從三峽本地自然腐爛的柑橘果實上分離出一株致腐菌，經(jīng)rDNA-ITS序列分析表明該菌與以往報道的柑橘致腐菌橘青霉和綠霉的差異較大，而和鐮刀菌、赤霉菌顯示出較近的親緣關系。

3.2 采用抑菌圈法分析了三峽地區(qū)本地物種疏花水柏枝內(nèi)生真菌對柑橘致腐菌的拮抗作用，結果表明在12株高抗氧化活性的內(nèi)生菌中，有6株內(nèi)生真菌具有較好的拮抗效果。對疏花水柏枝淹水前、后內(nèi)生菌抑菌效果的比較分析表明，淹水前菌株多于淹水后菌株，根部的有效菌多于葉部，其中QY 1顯示出較好的抗氧化性和抑菌活性，是一株用在生物保鮮和防腐上很有潛力的菌株。

［1］吳婷，張艷妮.柑橘產(chǎn)業(yè)十年變化與未來——專訪國家柑橘產(chǎn)業(yè)技術體系首席專家鄧秀新院士［J］.湖南農(nóng)業(yè)科學，2013（11）：1-4.

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Antimicrobial effect of endophytes from Myricaria laxiflora on thefungus causing citrus rot in Three Gorges area

KONG Yu-shan，QIN Tian-m ing，XUE Yan-hong，LIU Shi-ping*
（College of Life Science and Pharmacy，Three Gorges University，Yichang 443002，China）

A dominant fungus was isolated from completely rotten citrus in Three Gorges area. Based on rDNAInternaltranscribed spacer（ITS） analysis，the closest homology of this strain were Fusarium and Gibberella.Meanwhile，the antimicrobial effect of 12 endophytes with high antioxidant capacity from locally Myricarialaxiflora plants was screened by inhibition zone method. Six endophytes showed obvious antimicrobial effect.Particularly，the strain QY1 exhibited the strongest antioxidant and antifungal activity ，indicating that theendophytes from Myricaria laxiflora had a positive effect on biological preservation and anti-corrosion of theThree Gorges citrus.

Myricaria laxiflora；endophytes；citrus；antifungal；antioxidant

TS201.3

A

1002-0306（2015）08-0175-03

10.13386/j.issn1002-0306.2015.08.027

2014－08－14

孔玉珊（1990-），女，碩士研究生，主要從事微生物的開發(fā)與應用方面的研究。

*通訊作者：劉士平（1974-），男，博士，副教授，研究方向：生物防治。

國家自然科學基金（31270389）。