油茶籽殼提取物抗氧化及抗癌活性研究

淦永鑒，李 旭，楊莉琳，丁春邦，曾憲垠，張懷渝，陳志渝，杜小剛

（四川農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，四川雅安625014）

油茶籽殼提取物抗氧化及抗癌活性研究

淦永鑒，李 旭，楊莉琳，丁春邦，曾憲垠，張懷渝，陳志渝，杜小剛*

（四川農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，四川雅安625014）

目的：觀察油茶籽殼不同溶劑提取物（乙酸乙酯、正丁醇、氯仿、水）體外抗氧化和抗腫瘤活性。方法：采用Folin-Ciocalteu和三氯化鋁方法檢測(cè)總酚及總黃酮含量；采用DPPH法和鄰二氮菲-Fe2+氧化法測(cè)抗氧化活性；采用CCK-8法測(cè)細(xì)胞的活性。結(jié)果：油茶籽殼乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物、氯仿提取物、水提取物總酚含量分別為79.25±4.552、51.81±3.651、2.762±0.523、19.73±1.191mg/g；總黃酮含量分別為26.73±0.613、15.63±1.126、13.16±0.672、5.734±0.761mg/g；油茶籽殼乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物、氯仿提取物、水提取物在15.625～250μg/mL范圍內(nèi)體外抗氧化活性均具有劑量依賴(lài)性；對(duì)HepG2細(xì)胞增殖抑制作用在62.5～250μg/mL范圍內(nèi)均具有劑量依賴(lài)性。結(jié)論：體外抗氧化活性和抗腫瘤活性強(qiáng)弱均表現(xiàn)為乙酸乙酯提取物＞正丁醇提取物＞水提取物＞氯仿提取物，其中乙酸乙酯是油茶籽殼提取的有效溶劑。

油茶籽殼，提取物，抗氧化活性，抗腫瘤活性

油茶（Camellia oleifera Abel.）為山茶科（Theaceae）山茶屬（Camellia）植物，主要分布在我國(guó)的長(zhǎng)江流域及其以南地區(qū)，占地5500萬(wàn)畝，資源豐富［1-2］。茶籽（Camellia oleifera seed）為油茶的成熟種子，茶籽在民間藥用歷史悠久，為民間習(xí)慣用品。茶籽殼（Camellia oleifera shell）為茶籽榨油后的副產(chǎn)物，是茶籽榨油前除去的種皮，其利用率卻相對(duì)較低。現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，茶籽殼中富含茶皂素［3］、黃酮［4］、多糖［5］、多酚［6］等成分，具有減肥［7］、降血糖［8］、改良性前列腺增生癥［9］等功效。若能將茶籽殼加以有效利用，必將產(chǎn)生巨大的經(jīng)濟(jì)效益。

目前油茶的研究主要集中在茶籽上，關(guān)于茶籽殼研究報(bào)道還很少［5-6］，特別是茶籽殼抗氧化和抗腫瘤方面的研究。因此本研究觀察油茶籽殼不同溶劑提取物的體外抗氧化活性以及對(duì)人宮頸癌細(xì)胞株（HeLa）和人肝癌細(xì)胞株（HepG2）增殖的影響，從而為發(fā)掘油茶籽殼的新用途奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

油茶籽殼 采于四川雅安市雨城區(qū)，經(jīng)四川農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院丁春邦教授鑒定；沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品、蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品、Folin-Ciocalteu試劑、1，1-二苯基-2-苦基苯肼（DPPH、1，1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl）、鄰二氮菲（1，10-Phenanthriline）、二甲基亞砜（DMSO） 美國(guó)sigma公司；DMEM干粉培養(yǎng)基、胰蛋白酶 美國(guó)Gibco公司；胎牛血清 美國(guó)Hyclone公司；CCK-8試劑盒 武漢博士德生物工程有限公司；人宮頸癌細(xì)胞株（HeLa）、人肝癌細(xì)胞株（HepG2） 由四川大學(xué)生物材料技術(shù)中心贈(zèng)，在本實(shí)驗(yàn)室正常傳代三次；其余試劑 均為國(guó)產(chǎn)分析純。

UV-1750紫外分光光度計(jì) 日本Shimadzu；Synergy HT酶標(biāo)儀 美國(guó)BIO-TEK；Sorvall ST 16R離心機(jī)、二氧化碳培養(yǎng)箱 美國(guó)Thermo；MLS-3780高壓滅菌鍋 日本Sanyo；RE-2000B旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器；DZF型真空干燥箱 北京市永光明醫(yī)療器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 油茶籽殼不同提取物的制備 油茶籽殼經(jīng)烘干，粉碎，過(guò)100目篩，備用。油茶殼粉末以1∶20（w/v）料液比用70%乙醇于50℃浸提2h，浸提3次，浸提液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀50℃濃縮為浸膏，真空干燥。干燥的乙醇提取物溶于100m L雙蒸水中，用100m L丙酮沉淀部分皂苷后，濃縮、干燥；再溶于250m L雙蒸水中；按浸提液與萃取溶劑1∶1（v/v）依次經(jīng)氯仿、乙酸乙酯、正丁醇室溫萃取過(guò)夜，再50℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮為浸膏、真空干燥。最終獲得氯仿萃取物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物和水相提取物。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng) 人宮頸癌細(xì)胞株（HeLa）、人肝癌細(xì)胞株（HepG2）由四川大學(xué)生物材料技術(shù)中心贈(zèng)，在本實(shí)驗(yàn)室正常傳代三次。HeLa和HepG2細(xì)胞株用10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，同時(shí)加入100U/m L鏈霉素和100U/m L青霉素，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中飽和濕培養(yǎng)，每2～3d換液1次。

1.2.3 油茶籽殼不同提取物總多酚和總黃酮含量測(cè)定 總多酚類(lèi)物質(zhì)測(cè)定采用Yang等［10］所描述的Folin-Ciocalteu試劑法。依次加入0.5m L 250μg/m L提取物，2.5m L 0.2NFolin-Ciocalteu試劑，室溫反應(yīng)5m in，再加入2m L 7.5%Na2CO3溶液，混勻，室溫反應(yīng)1h，于765nm測(cè)定吸光度。沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)Y=6.412x+0.009（R2= 0.998），根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算總酚含量。

總黃酮物質(zhì)的測(cè)定采用Barreira JCM等［11］所描述的三氯化鋁法。將0.4m L 1mg/m L提取物溶于2m L 30%乙醇中，再加入1.6m L 1%三氯化鋁溶液，搖勻放置10min，于415nm測(cè)定吸光度。蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)Y= 3.824x-0.003（R2=0.999），根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算總黃酮含量。

1.2.4 油茶籽殼不同提取物體外抗氧化分析

1.2.4.1 油茶籽殼不同提取物對(duì)DPPH自由基的清除能力 采用Yang等［12］描述的方法，依次加入2m L的2×10-4mol/L的DPPH無(wú)水乙醇液，2m L各組提取物（31.25、62.5、125、250μg/m L），混勻，室溫下放置30m in后，于517nm處測(cè)得吸光值A(chǔ)i，同時(shí)測(cè)定DPPH無(wú)水乙醇液與2m L無(wú)水乙醇混合液的吸光值A(chǔ)o，以及2m L提取物與2m L無(wú)水乙醇混合液的吸光值A(chǔ)j，DPPH自由基清除率（Y1）的計(jì)算公式：

1.2.4.2 油茶籽殼不同提取物對(duì)羥基自由基的清除能力 采用Su等［13］所描述的鄰二氮菲-Fe2+氧化法，依次加入0.75mmol/L鄰二氮菲無(wú)水乙醇溶液2m L于試管中，再加入PBS緩沖液（pH=7.4 0.1mol/L）4m L和蒸餾水2m L，充分搖勻后，加0.75mmol/L FeSO4溶液2m L，混勻，加0.01%H2O2溶液2m L，在37℃水浴中放置60min，于536nm處測(cè)得吸光度Ap。蒸餾水代替0.01% H2O2溶液，測(cè)得吸光值A(chǔ)b。蒸餾水用各組提取物（15.625、31.25、62.5、125μg/m L）代替，測(cè)得吸光值A(chǔ)s。羥基自由基清除率（Y2）的計(jì)算公式：

1.2.5 CCK-8法測(cè)定油茶籽殼不同提取物對(duì)人腫瘤細(xì)胞的影響 取處于指數(shù)生長(zhǎng)期的HeLa細(xì)胞株和HepG2細(xì)胞株各一瓶，制成細(xì)胞懸液，分別以細(xì)胞密度1×104個(gè)/孔和0.5×104個(gè)/孔100μL接種在96孔培養(yǎng)板中，同時(shí)加入用含0.25%二甲基亞砜（DMSO）的DMEM完全培養(yǎng)基配制各組提取物（62.5、125、250和500μg/m L）100μL，空白對(duì)照組和0.25%DMSO對(duì)照組加入不含樣品的培養(yǎng)液100μL。在5%CO2、37℃飽和濕度下孵育24h后，每孔加入20μL CCK-8溶液，繼續(xù)孵育4h，于450nm測(cè)定吸光度。實(shí)驗(yàn)組，記A1；空白對(duì)照組，記A2；計(jì)算抑制率和IC50值。抑制率計(jì)算公式：

抑制率（%）=（1－A2/A1）×100

1.3 統(tǒng)計(jì)方法

2 結(jié)果與分析

2.1 油茶籽殼不同提取物中總酚和總黃酮的含量

油茶殼提取物中總酚的含量，見(jiàn)表1，結(jié)果顯示各組分總酚含量?jī)蓛芍g差異顯著（p＜0.05），總酚含量高低依次為：乙酸乙酯提取物＞正丁醇提取物＞水提取物＞氯仿提取物。

油茶殼提取物中總黃酮的含量，見(jiàn)表1，結(jié)果顯示各組分兩兩之間差異顯著（p＜0.05），總黃酮含量高低依次為：乙酸乙酯提取物＞正丁醇提取物＞氯仿提取物＞水提取物?？梢?jiàn)，黃酮類(lèi)化合物主要集中在極性較弱的乙酸乙酯提取物中，含量比水提物提高了近5倍。Mir Z Gul等［14］對(duì)相思豆（Abrus precatorius）提取物進(jìn)行體外抗氧化和抗腫瘤研究，乙酸乙酯提取物表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗氧化活性和抗腫瘤活性，且乙酸乙酯提取物中的總酚和總黃酮含量也較其他組高。

表1 油茶籽殼不同提取物中化學(xué)成分含量分析Table 1 Analysis of the phytochemicals component of different extracts of Camellia oleifera shell

2.2 油茶籽殼不同提取物對(duì)DPPH自由基的清除能力

DPPH自由基是一種穩(wěn)定的自由基，其孤對(duì)電子在715nm處有特征強(qiáng)吸收（深紫色）?？寡趸瘎┛芍苯优c孤對(duì)電子配對(duì)，使DPPH自由基吸收減弱，顏色從紫色逐漸變?yōu)辄S色，因此可以通過(guò)測(cè)定吸收減弱的程度，間接評(píng)價(jià)該抗氧化劑的活性［15］。各組提取物對(duì)DPPH自由基清除率的實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。各組提取物對(duì)DPPH自由基的清除作用在31.25～250μg/m L具有濃度依賴(lài)性。乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物、水提取物、氯仿提取物對(duì)DPPH自由基的半清除率IC50值見(jiàn)表2。對(duì)比IC50，清除作用最強(qiáng)的是乙酸乙酯提取物，其對(duì)DPPH自由基的清除率較正丁醇提取物無(wú)顯著差異（p＞0.05），較水提取物差異顯著（p＜0.05），較氯仿提取物差異極顯著（p＜0.01）。

表2 油茶籽殼不同提取物不同濃度對(duì)DPPH自由基的影響Table 2 Scavenging effects of the various extractions from Camellia oleifera shell on DPPH radical at the different concentrations

2.3 油茶籽殼不同提取物對(duì)羥基自由基的清除能力

鄰二氮菲-Fe2+氧化法是一種羥基自由基清除能力的測(cè)定方法，它以鄰二氮菲-Fe2+為氧化還原指示劑，因其呈色的變化而反映出溶液中氧化還原狀態(tài)的改變。體系中通過(guò)Fenton反應(yīng)產(chǎn)生的HO-可使鄰二氮菲-Fe2+水溶液氧化為鄰二氮菲-Fe3+從而使鄰二氮菲-Fe2+在536nm處的最大吸收峰消失［16］。各組提取物對(duì)羥基自由基清除率的實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。其中乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物、水提取物對(duì)羥基自由基的清除作用在15.625～125μg/m L具有濃度依賴(lài)性；求出乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物、水提取物對(duì)羥基自由基的半清除率IC50值見(jiàn)表3；氯仿提取物對(duì)羥基自由基的清除作用在15.625～125μg/m L不具有濃度依賴(lài)性，IC50值不能求出。

表3 油茶籽殼不同提取物不同濃度對(duì)羥基自由基的影響Table 3 Scavenging effects of the various extracts from Camellia oleifera shell on hydroxyl radical at the different concentrations

陳亞琪等［17］對(duì)油茶浦提取物的抗氧化活性研究發(fā)現(xiàn)，總酚含量與抗氧化能力間存在較好的相關(guān)性。本研究油茶籽殼不同提取物總酚含量與其清除DPPH自由基IC50的相關(guān)系數(shù)為0.983，對(duì)羥基自由基IC50的相關(guān)系數(shù)也達(dá)到0.885?？梢哉J(rèn)為，多酚類(lèi)物質(zhì)是油茶籽殼提取物清除自由基及抗氧化的主要成分，在生物體系中相關(guān)性明顯。

2.4 油茶籽殼不同提取物對(duì)人宮頸癌細(xì)胞株（HeLa）增殖的影響

CCK-8試劑中含有WST-8［2-（2-甲氧基-4-硝基苯基）-3-（4-硝基苯基）-5-（2，4-二磺酸苯）-2H-四唑單鈉鹽］，它在電子載體1-甲氧基-5-甲基吩嗪硫酸二甲酯（1-Methoxy PMS）的作用下被細(xì)胞線(xiàn)粒體中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲臜產(chǎn)物（Formazan）。生成的甲臜產(chǎn)物的數(shù)量與活細(xì)胞的數(shù)量成正比。用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在450nm波長(zhǎng)處測(cè)定其光吸收值，可間接反映活細(xì)胞數(shù)量。

不同提取物對(duì)人宮頸癌細(xì)胞株（HeLa）增殖的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖1，0.25%DMSO對(duì)HeLa細(xì)胞株不會(huì)產(chǎn)生傷害作用。氯仿提取物62.5～125μg/m L和水提取物62.5μg/m L劑量組與空白對(duì)照組比，未見(jiàn)顯著性差異（p＞0.05），而氯仿250～500μg/m L劑量組與空白對(duì)照組相比差異顯著（p＜0.05），水提取物125～500μg/m L各劑量組與空白對(duì)照組相比差異顯著（p＜0.05）。乙酸乙酯提取物和正丁醇提取物在62.5～250μg/m L劑量范圍內(nèi)對(duì)HeLa細(xì)胞增殖的抑制呈劑量依賴(lài)性，其中250μg/m L的抑制率最高分別為81.99%和91.53%。

圖1 油茶籽殼不同提取物不同濃度對(duì)HeLa細(xì)胞生長(zhǎng)的影響Fig.1 Effect of the various extracts from Camellia oleifera shell at the different concentrations on HeLa cells after the cells were cultured

2.5 油茶籽殼不同提取物對(duì)人肝癌細(xì)胞株（HepG2）增殖的影響

不同提取物對(duì)人肝癌細(xì)胞株（HepG2）增殖的影響結(jié)果見(jiàn)圖2，0.25%DMSO對(duì)HepG2細(xì)胞株未產(chǎn)生傷害作用。乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物和氯仿提取物在62.5～500μg/m L劑量范圍內(nèi)對(duì)HepG2細(xì)胞增殖的抑制呈劑量依賴(lài)性，其中500μg/m L的抑制率均最高，分別為92.56%、95.67%和94.47%。水提取物在62.5～ 250μg/m L劑量范圍內(nèi)對(duì)HepG2細(xì)胞增殖的抑制呈劑量依賴(lài)性，在250μg/m L時(shí)抑制率最高為93.19%。

圖2 油茶籽殼不同提取物不同濃度對(duì)HepG2細(xì)胞生長(zhǎng)的影響Fig.2 Effect of the various extracts from Camellia oleifera shell at the different concentration on HepG2 cells after the cells were cultured

2.6 油茶籽殼不同提取物對(duì)不同腫瘤細(xì)胞增殖影響的差異性分析

油茶籽殼氯仿提取物和水提取物在125μg/m L濃度以下對(duì)HeLa和HepG2腫瘤細(xì)胞增殖的抑制作用均較弱，在250μg/m L以上時(shí)各提取物組分均表現(xiàn)出對(duì)腫瘤細(xì)胞較強(qiáng)的抑制作用。對(duì)2種腫瘤細(xì)胞的IC50值大小順序均為：油茶籽殼氯仿提取物＞水提取物＞正丁醇提取物＞乙酸乙酯提取物，見(jiàn)表4。這與唐玲等［18］對(duì)油茶籽提取物的體外抗癌活性體外增殖抑制作用的強(qiáng)弱為油茶籽乙醇提取物＞水提取物研究結(jié)果一致。

表4 油茶籽殼不同提取物對(duì)HeLa和HepG2細(xì)胞株IC50的比較Table 4 Comparison of IC50of different extracts from Camellia oleifera shell on HeLa and HepG2 cell lines

3 結(jié)論

本文對(duì)油茶籽殼提取物進(jìn)行了主要活性成分、抗氧化和抗腫瘤分析，結(jié)果表明乙酸乙酯提取物中多酚含量為（79.25±4.552）mg/g，黃酮含量為（26.73± 0.613）mg/g，高于其他提取物；體外抗氧化活性和抗腫瘤活性強(qiáng)弱均表現(xiàn)為乙酸乙酯提取物＞正丁醇提取物＞水提取物＞氯仿提取物。油茶籽殼乙酸乙酯提取物有明顯的抗氧化活性和抗腫瘤活性，這為繼續(xù)開(kāi)發(fā)高效低毒的新型天然抗氧化和抗腫瘤藥物奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

［1］國(guó)家林業(yè)局.全國(guó)油茶產(chǎn)業(yè)發(fā)展規(guī)劃（2009-2020）.2009．

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In vitro antioxidant and antiproliferative activities of the different extracts from shell of Camellia oleifera Abel.

GAN Yong-jian，LIXu，YANG Li-lin，DING Chun-bang，ZENG Xian-yin，ZHANG Huai-yu，CHEN Zhi-yu，DU Xiao-gang*
（College of Life Science，Sichuan Agricultural University，Ya'an 625014，China）

Objective:The paper investigated antioxidant and antiproliferative properties of various extracts （EthylAcetate，N-butanol，Chloroforms，Aqueous） from the shells of Camellia Oleifera Abel. with in vitro. Methods:Total phenolics and total flavonoids were measured by Folin-Ciocalteu reagent and aluminium chloridereagent，respectively. And，the antioxidant activity was tested by DPPH and hydroxyl assays in vitro. Besides，the proliferative activity of the different human cancer cell lines was detected by CCK-8 assay. Results:Totalphenolic contents of extracts （Ethyl Acetate，N-butanol，Chloroforms，Aqueous） were （79.25±4.552）mg/g，（51.81±3.651）mg/g，（2.762±0.523）mg/g，（19.73±1.191）mg/g respectively，and total flavonoid contents were（26.73±0.613）mg/g，（15.63±1.126）mg/g，（13.16±0.672）mg/g，（5.734±0.761mg/g，respectively. The antioxidantactivities of these extracts in a range of concentrations from 15.625 to 250μg/mL increased in dose-dependentmanner. More over，the antiproliferative activities of these extract in a range of concentrations from 62.5 to250μg/mL increased in dose-dependent manner. Conclusion:Antioxidant and antiproliferative activities strengthof Ethyl acetate extracts＞N-butanol extracts＞Aqueous extracts＞Chloroform extracts in vitro，Ethyl acetate wasan effective solvent to extract shell of Camellia oleifera Abel.

Camellia oleifera shell；extracts；antioxidant；antiproliferative

TS201.4

A

1002-0306（2015）08-0171-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.08.026

2014－06－09

淦永鑒（1986-），男，碩士研究生，研究方向：分子生物物理學(xué)。

*通訊作者：杜小剛（1977-），男，博士，副教授，研究方向：細(xì)胞免疫學(xué)。

四川省肉類(lèi)加工實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放基金（13-R04）。