澄清劑對(duì)黃酒混濁蛋白去除效果的研究

樊世英，孫軍勇，謝廣發(fā)，陸 健，5，*

（1.江南大學(xué)工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無錫214122；2.江南大學(xué)糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國家工程實(shí)驗(yàn)室，江蘇無錫214122；3.江南大學(xué)生物工程學(xué)院，江蘇無錫214122；4.中國紹興黃酒集團(tuán)有限公司國家黃酒工程技術(shù)研究中心，浙江紹興312000；5.宿遷市江南大學(xué)產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院，江蘇宿遷223800）

澄清劑對(duì)黃酒混濁蛋白去除效果的研究

樊世英1，2，3，孫軍勇1，2，3，謝廣發(fā)3，4，陸 健1，2，3，5，*

（1.江南大學(xué)工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無錫214122；2.江南大學(xué)糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國家工程實(shí)驗(yàn)室，江蘇無錫214122；3.江南大學(xué)生物工程學(xué)院，江蘇無錫214122；4.中國紹興黃酒集團(tuán)有限公司國家黃酒工程技術(shù)研究中心，浙江紹興312000；5.宿遷市江南大學(xué)產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院，江蘇宿遷223800）

研究了單寧、硅膠和PolyclarRBrewbrite等澄清劑對(duì)黃酒混濁蛋白特異性去除的效果，并通過采用N-三（羥甲基）甘氨酸-十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳、基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜，研究了黃酒混濁蛋白及不同澄清劑吸附蛋白的分子量、蛋白質(zhì)種類及來源，并比較了澄清劑處理前后酒樣隆丁區(qū)分和非生物穩(wěn)定性的變化。結(jié)果表明：黃酒混濁蛋白的主要成分為類燕麥蛋白和二聚α-淀粉酶抑制劑，主要來源于小麥，幾種澄清劑對(duì)二聚α-淀粉酶抑制劑都有一定的吸附作用，且處理后的酒樣穩(wěn)定性得到提高，其中以單寧效果最為明顯。

黃酒，澄清劑，混濁蛋白，基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜，蛋白穩(wěn)定性

黃酒是一種成分復(fù)雜、營養(yǎng)豐富的膠體溶液，含有蛋白質(zhì)、氨基酸、多酚、糖、金屬離子等物質(zhì)。在存儲(chǔ)的過程中，黃酒受到光照、振動(dòng)、氧氣的影響，膠體平衡被打破而出現(xiàn)失光、絮凝和沉淀［1］。在黃酒的沉淀物中，蛋白質(zhì)占有較大的比例，一般在30%～50%，并且在沉淀蛋白中高分子蛋白質(zhì)含量都高于50%［2-5］。因此，一些研究者認(rèn)為黃酒中高分子蛋白質(zhì)含量高是引起黃酒非生物穩(wěn)定性差的原因。然而，有的研究者認(rèn)為盡管高分子蛋白質(zhì)在沉淀中所占的比例大，但黃酒的穩(wěn)定性并不隨著黃酒中高分子蛋白質(zhì)含量增高而降低，而可能與黃酒中某類容易形成混濁的蛋白質(zhì)有關(guān)［6］。

提高黃酒穩(wěn)定性的研究早有報(bào)道，研究者通過物理法冷凍、微濾、超濾技術(shù)去除黃酒中的部分蛋白質(zhì)或使其凝聚析出，或者用化學(xué)的方法向黃酒中添加澄清劑，如單寧、植酸、PVPP、殼聚糖、膨潤土等［7-10］，減少黃酒中蛋白質(zhì)或多酚的含量，都取得了一些成果。目前，國內(nèi)的幾家大型黃酒生產(chǎn)企業(yè)都采用了冷凍過濾的工藝來解決黃酒的穩(wěn)定性問題，但是冷凍處理對(duì)混濁蛋白的選擇性并不是十分理想，且存在能耗高的問題。因此，對(duì)黃酒的混濁蛋白成分進(jìn)行分析，加強(qiáng)此類蛋白質(zhì)的研究并特異性的去除該類蛋白，將是提高黃酒蛋白穩(wěn)定性的最佳途徑。

為了解決這一問題，本文比較了幾種澄清劑對(duì)黃酒混濁蛋白的去除效果，研究了與混濁形成相關(guān)指標(biāo)的變化。并且通過SDS-PAGE確定黃酒沉淀中蛋白質(zhì)分子量的分布，利用基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜（MALDI-TOF/TOF MS）技術(shù)分析其成分及來源，為在工業(yè)化生產(chǎn)中控制黃酒的蛋白穩(wěn)定性提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黃酒 浙江古越龍山紹興酒股份有限公司提供的未經(jīng)穩(wěn)定處理的花雕酒；硅膠1 美國PQ公司；硅膠2 Stabiquick系列硅膠，德國Stabifix公司；五倍子單寧 鄭州隴海啤酒物資專營店；PolyclarRBrewbrite 美國國際特品公司；丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、三羥甲基氨基甲烷（Tris）、十二烷基磺酸鈉（SDS）、N，N，N'，N'-四甲基乙二胺（TEMED）、過硫酸銨（APS）、牛血清蛋白、考馬斯亮藍(lán)G-250、考馬斯亮藍(lán)R-250 上海生工進(jìn)口分裝產(chǎn)品；Tricine和蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品（分子量4.1～45.0ku） 上海生工生物工程公司；NH4HCO3、二硫蘇糖醇（DTT）、碘乙酰胺（IAA）、三氟乙酸（TFA） 美國Sigma公司；其他試劑 均為分析純。

蛋白電泳系統(tǒng)（M ini-Protein 3 Cell） 美國Bio-Rad公司；高速冷凍離心機(jī) 美國Sigma公司；Ultraflextreme串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜儀 德國Bruker公司；UV-2100紫外可見分光光度計(jì) 尤尼克上海儀器公司；WGZ-2-PJ濁度計(jì) 上海昕瑞儀器儀表有限公司；K2300凱氏定氮儀 丹麥Foss有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 黃酒混濁蛋白樣品制備 取500m L酒樣，自然存放一段時(shí)間，直至出現(xiàn)混濁沉淀，離心收集沉淀物，再將沉淀物懸浮于超純水，離心（12000r/m in，30m in），重復(fù)上述過程，收集沉淀，超純水洗滌2次，用2%氨水溶解，用80%飽和硫酸銨鹽析，然后用3000u的透析袋于4℃下脫鹽48h，冷凍干燥，即得到混濁蛋白樣品［11］。

1.2.2 澄清劑吸附蛋白質(zhì)樣品制取［11］向澄清酒樣中分別添加單寧（70mg/L）、硅膠1、2（500mg/L）、PolyclarRBrewbrite（200mg/L），離心收集沉淀，用2%氨水溶解后，離心除去硅膠和PolyclarRBrewbrite，回收上清液，向上清液中緩慢添加硫酸銨使其相對(duì)飽和度達(dá)到80%，混合攪拌形成沉淀，離心收集沉淀后，透析脫鹽，冷凍干燥得到澄清劑吸附蛋白樣品。

1.2.3 Tricine-SDS-PAGE電泳 將混濁蛋白和澄清劑吸附蛋白溶于0.05mol/L Tris中，考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白濃度。凝膠配制參考曹佐武的實(shí)驗(yàn)方法［12］。電泳結(jié)束后將凝膠在含有50%乙醇和10%冰醋酸的固定液中固定0.5h后，在考馬斯亮藍(lán)R-250染色液中染色3h，然后用含10%甲醇和10%冰醋酸的脫色液脫色至背景清晰，電泳圖譜用JD-801凝膠成像儀記錄，通過捷達(dá)801圖像分析軟件3.3分析。

1.2.4 MALDI-TOF/TOF MS 切取凝膠上可見的蛋白條帶，加入200μL的100mmol/L碳酸氫銨/30%乙腈（V/V），振蕩脫至無色，加入50μL無水乙腈脫水2次，得白色膠粒。每管加入5μL胰蛋白酶液，置于4℃冰箱中30～60min，使膠粒完全吸收酶液，吸出多余酶液，加入20μL 25mmol/L碳酸氫銨溶液，37℃水浴20h。將酶解液吸出加入到新離心管中，將酶解液和萃取液旋轉(zhuǎn)真空濃縮，加入TA60溶液3μL振蕩復(fù)溶。吸取0.7μL樣品點(diǎn)樣，晾干后加0.7μL基質(zhì)，干燥后運(yùn)用質(zhì)譜儀對(duì)樣品進(jìn)行肽質(zhì)量指紋圖譜分析。一級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集模式采用正離子反射模式與自動(dòng)獲取數(shù)據(jù)模式，掃描范圍為700～3500u。選取5～10個(gè)信號(hào)強(qiáng)度較好的一級(jí)質(zhì)譜峰進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜分析，使用BioTools軟件進(jìn)行整合，Mascot軟件用于質(zhì)譜數(shù)據(jù)搜索，搜索數(shù)據(jù)庫為NCBI，物種屬為全物種，切割酶為胰酶［13］。

1.2.5 總氮及隆丁區(qū)分的測(cè)定 參照文獻(xiàn)［14］測(cè)定。

1.2.6 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

1.2.6.1 熱處理實(shí)驗(yàn) 根據(jù)Juinn-Chin Hsu［15］的方法稍作修改，取澄清劑處理前與處理后的酒樣各50m L，90℃水浴6h，冷卻至室溫，分別測(cè)定熱處理前后的濁度，計(jì)算濁度增加量。

1.2.6.2 乙醇-濁度實(shí)驗(yàn) 取澄清劑處理前與處理后的酒樣各50m L，加入25m L無水乙醇，振蕩混勻，2h后測(cè)濁度，計(jì)算酒精添加前后濁度增加量［16］。

1.2.6.3 強(qiáng)制老化實(shí)驗(yàn) 取澄清劑處理前與處理后的酒樣各50m L，0℃放置12h；80℃，12h為一個(gè)循環(huán)，三個(gè)循環(huán)后冷卻至室溫測(cè)濁度并計(jì)算濁度變化量［13］。

1.2.7 氨基酸態(tài)氮、酒精度、pH、總酸、總糖含量測(cè)定 參照文獻(xiàn)［17］測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 SDS-PAGE及質(zhì)譜鑒定結(jié)果與分析

采用Tricine-SDS-PAGE凝膠方法來分離混濁蛋白，將混濁蛋白及澄清劑吸附的蛋白按照1.2.3的方法進(jìn)行電泳，結(jié)果見圖1。

通過凝膠分析軟件計(jì)算圖1中各條帶的積分光密度及分子量，可知混濁蛋白主要分布在大約14.9ku和32.5ku處，而各種澄清劑吸附蛋白也位于這兩處，由此可見，幾種澄清劑對(duì)混濁蛋白都有一定的吸附作用。對(duì)明顯的條帶取點(diǎn)進(jìn)行質(zhì)譜鑒定，鑒定結(jié)果見表1。條帶a1～a5為類燕麥蛋白，主要來源于小麥，條帶b1～b5鑒定結(jié)果為二聚α-淀粉酶抑制劑，同樣來源于小麥，而這兩種蛋白也存在于啤酒的混濁蛋白中［18］。類燕麥蛋白是小麥中的儲(chǔ)藏蛋白，主要存在于小麥胚乳中，屬于低分子量谷蛋白，含有一定數(shù)量的半胱氨酸，分子內(nèi)和分子間存在的二硫鍵可以形成高分子聚合體［19］，影響混濁物的形成。α-淀粉酶抑制劑是普遍存在于植物種子中的一種酶抑制劑，在小麥種子中主要存在12、24、60ku 3種形式，單體的α-淀粉酶抑制劑分子量為12、24、60ku分別為二聚體和四聚體，分解后單體的分子量在13ku左右［20-21］。α-淀粉酶抑制劑可以抑制內(nèi)生性淀粉酶的活性，使攝入體內(nèi)的淀粉不能水解，阻斷主要的能量來源，從而可以防御昆蟲的侵害，并且在治療糖尿病和高血糖方面有重要作用［22-23］。研究發(fā)現(xiàn)［21］，α-淀粉酶抑制劑具有較好的酸堿耐受性，在pH4～11時(shí)蛋白性質(zhì)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，在70℃作用30m in后酶活基本沒有變化，80℃作用10min活性僅降低10%左右。據(jù)此分析，在黃酒煎酒的過程中，其熱穩(wěn)定性好，只有少部分的α-淀粉酶抑制劑失活變性凝固析出，大部分還存在于酒液中，經(jīng)過長時(shí)間的貯存，外界環(huán)境發(fā)生變化，導(dǎo)致其逐漸析出形成混濁。除此之外，α-淀粉酶抑制劑可以與α-淀粉酶形成可溶性的復(fù)合體，從而使淀粉酶失去活性，降低對(duì)淀粉的分解能力，導(dǎo)致淀粉分解不徹底，部分糊精［5］會(huì)殘留在酒液中，隨著環(huán)境變化糊精會(huì)析出，加重黃酒的非生物混濁。

圖1 混濁蛋白及澄清劑吸附蛋白Tricine-SDS-PAGE電泳圖Fig.1 Tricine-SDS-PAGE electrophoresis of the proteins in haze and absorbed by fining agents

表1 蛋白質(zhì)質(zhì)譜鑒定結(jié)果Table 1 Results of proteins identification by MALDI-TOF/TOFMS

2.2 澄清劑處理對(duì)黃酒蛋白穩(wěn)定性的影響

2.2.1 澄清劑處理前后總氮及隆丁區(qū)分的變化 隆丁區(qū)分可以反映黃酒中不同分子量段的蛋白質(zhì)的組成比例。從表2分析出，未經(jīng)澄清劑處理的酒樣中，總氮含量最高。經(jīng)過澄清劑處理后，一部分蛋白被吸附，酒體中總氮含量有所下降，但下降幅度不大，保留了原酒樣中97%以上的蛋白。然而，酒樣中高、中、低分子蛋白質(zhì)的組成比例變化較大。其中，經(jīng)過單寧和PolyclarRBrewbrite處理后，酒樣的中分子蛋白分別減少了12.1%和19.6%，而低分子氮的含量變化并不明顯，這說明澄清劑對(duì)酒體中的蛋白質(zhì)是具有選擇性的吸附，對(duì)高、中分子蛋白質(zhì)具有一定的吸附效果，并且PolyclarRBrewbrite對(duì)中分子氮的吸附量大于對(duì)高分子氮的吸附量。由圖1可知，處于中分子氮范圍內(nèi)的13ku左右的α-淀粉酶抑制劑和32.4ku左右的類燕麥蛋白是混濁蛋白的主要成分，因此，中分子蛋白質(zhì)含量的減少有利于黃酒穩(wěn)定性的提高。

表2 澄清劑處理前后總氮及隆丁區(qū)分變化Table 2 Total nitrogen and Lundin fraction of the rice wine before and after fining

2.2.2 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 采用熱處理法、乙醇-濁度法和強(qiáng)制老化法綜合評(píng)價(jià)澄清劑處理前后的蛋白穩(wěn)定性，結(jié)果如表3所示。澄清劑處理后，黃酒的非生物穩(wěn)定性得到提高，其中以單寧處理過的酒樣效果尤為明顯，90℃水浴6h后濁度僅增加了1.92NTU，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于未進(jìn)行穩(wěn)定處理酒樣增加的濁度（9.72NTU），而兩種硅膠和PolyclarRBrewbrite處理過的酒樣熱穩(wěn)定性提高幅度不大。乙醇-濁度法是通過加入乙醇，破壞黃酒中的蛋白質(zhì)與多酚結(jié)合形成的動(dòng)態(tài)平衡，使酒體的濁度產(chǎn)生變化，加入相同量的乙醇時(shí)，濁度變化大則穩(wěn)定性差，反之亦然，是一種快速預(yù)測(cè)黃酒穩(wěn)定性的新方法。向澄清劑處理前后的酒樣中添加50%的乙醇，測(cè)其濁度變化，澄清劑處理后的酒樣濁度增加量都低于原酒樣，其中，單寧和硅膠2處理過的酒樣濁度增加量較小。強(qiáng)制老化則是通過高低溫交替存放，促進(jìn)黃酒中混濁的形成，相當(dāng)于快速的自然存放。強(qiáng)制老化3個(gè)循環(huán)后，酒樣的濁度增加，單寧處理過的酒樣濁度增加量最小。

表3 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)Table 3 Stabilization treatment

2.2.3 總酸、總糖、氨基酸態(tài)氮及酒精度的變化 由2.2.2的穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)可知，單寧對(duì)于提高黃酒的穩(wěn)定性有相當(dāng)明顯的效果。對(duì)單寧處理前后的酒樣按照國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 13662-2008進(jìn)行常規(guī)指標(biāo)測(cè)定。結(jié)果如表4所示，單寧處理后，酒體中氨基酸態(tài)氮含量有顯著（p＜0.05）差異，而總糖、酒精度、總酸及pH等基本不變，且以上指標(biāo)均符合國家標(biāo)準(zhǔn)。

表4 單寧處理對(duì)黃酒常規(guī)理化指標(biāo)的影響Table 4 Specifications of Chinese rice wine before and after tannin treatment

3 結(jié)論

通過對(duì)黃酒混濁的蛋白質(zhì)成分進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)黃酒混濁蛋白主要分布于13ku和32.4ku，這與先前研究者認(rèn)為混濁蛋白主要是高分子蛋白的結(jié)果不同［2，5］。應(yīng)用MALDI-TOF/TOF MS技術(shù)鑒定出這兩個(gè)條帶的蛋白質(zhì)分別為類燕麥蛋白和二聚α-淀粉酶抑制劑，理論等電點(diǎn)處于5.58～8.03之間，均來源于小麥。

各種澄清劑對(duì)黃酒的這兩種混濁蛋白都有一定的吸附能力，經(jīng)過澄清劑處理后的黃酒穩(wěn)定性得到了不同程度的提高，其中，單寧的效果優(yōu)于其他幾種澄清劑，且保持了酒樣原有的品質(zhì)。

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Study on fining agents on removing the haze protein in Chinese rice wine

FAN Shi-ying1，2，3，SUN Jun-yong1，2，3，XIE Guang-fa3，4，LU Jian1，2，3，5，*
（1.The Key Laboratory of Industrial Biotechnology，Ministry of Education，School of Biotechnology，Jiangnan University，Wuxi214122，China；2.National Engineering Laboratory for Cereal Fermentation Technology，Jiangnan University，Wuxi214122，China；3.School of Biotechnology，Jiangnan University，Wuxi214122，China；4.National Engineering Research Center for Chinese RiceWine，China Shaoxing Rice Wine Group Co.，Ltd，Shaoxing 312000，China；5.Industrial Technology Research Institute of Jiangnan University in Suqian，Suqian 223800，China）

The tannin，silica and PolyclarR Brewbrite were used to remove haze protein in Chinese rice wine. Themolecular weight of protein in the haze was investigated by Tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gelelectrophoresis（Tricine-SDS-PAGE）. The proteins in the haze of Chinese rice wine and absorbed by finingagent were identified by matrix - assisted laser desorption ionisation - time of flight / time of flight massspectrometry（MALDI-TOF/TOF MS）. Lundin fraction and colloidal stability of Chinese rice wines before andafter fining were analyzed. The results showed that the main components of haze protein in Chinese rice winewere avenin-like protein and dimer α-amylase inhibitor，deriving from the Triticum aestivum. All of the finingagents were able to absorb the haze protein and improve the colloidal stability of Chinese rice wine，especiallythe tannin.

Chinese rice wine；fining agent；haze protein；MALDI-TOF/TOFMS；colloidal stability

TS201.1

A

1002-0306（2015）08-0167-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.08.025

2014－07－01

樊世英（1990-），女，碩士研究生，主要從事釀酒方面的研究。

*通訊作者：陸?。?968-），男，教授，研究方向：釀酒科學(xué)與工程。

973項(xiàng)目（2012CB720802）；973項(xiàng)目（2013CB733602）；安全食品精深加工科技創(chuàng)新平臺(tái)建設(shè)（2012B091400030）；國家自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目（31130043）；江蘇高校優(yōu)勢(shì)學(xué)科建設(shè)工程資助項(xiàng)目；高等學(xué)校學(xué)科創(chuàng)新引智計(jì)劃（111計(jì)劃）資助項(xiàng)目（111-2-06）。