煮制時間與二次煮制對紫娟普洱茶抗氧化性的影響

湯 曉，倪翠陽，王麗英，王 珊，王 云，華佳甜

（寧波職業(yè)技術學院化工學院，浙江寧波315800）

煮制時間與二次煮制對紫娟普洱茶抗氧化性的影響

湯 曉，倪翠陽，王麗英，王 珊，王 云，華佳甜

（寧波職業(yè)技術學院化工學院，浙江寧波315800）

分析不同煮制時間以及二次煮制對紫娟普洱茶中主要活性成分浸出情況的影響。測定茶湯的總花青素、總酚及總黃酮等抗氧化成分含量，分析茶湯的·OH清除能力、DPPH自由基清除能力、總抗氧化性、還原能力與這些抗氧化成分的相關性。結果表明，紫娟普洱茶湯中的抗氧化成分隨煮制時間延長而增加，第一次煮制7min后，各活性成分總含量的增加大多趨于平緩；第二次煮制后，各類活性成分總含量下降顯著（p＜0.05）。紫娟普洱茶湯的·OH清除能力、總抗氧化性與其活性成分含量呈線性正相關，且與總花青素、總酚含量的相關性更加明顯（R2＞0.8）。

煮制，紫娟普洱茶，抗氧化

紫娟普洱茶是云南大葉種茶中的一種特異品種，屬于普洱茶變種，其芽、葉、莖均為紫色，茶湯呈淡紫色，香氣醇正。研究表明，紫娟普洱茶含有豐富的花青素、茶多酚、總黃酮、氨基酸、總兒茶素、茶褐素、茶紅素、茶黃素等活性成分［1-2］，且紫娟普洱茶中的花青素、總黃酮等成分含量高于一般的大葉種茶［3］，長期飲用紫娟普洱茶具有較好的保健功效，能起到延緩衰老、預防心血管疾病等作用［4］。

紫娟普洱茶中的活性成分含量，隨茶樹生長年齡、生長條件，及茶葉加工方式、發(fā)酵時間、儲藏條件等因素而變化，而不同的煮制方式則會影響這些活性成分的浸出。本文以產自云南省普洱市的紫娟普洱茶生茶為對象，研究不同煮制時間對花青素、多酚、總黃酮、兒茶素類等活性成分的浸出以及茶湯抗氧化能力的影響，為紫娟普洱茶的科學飲用提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紫娟普洱茶生茶餅 購于云南省普洱市寧洱興隆茶廠，生產時間為2013年10月；飛燕草素、矢車菊素、天竺葵素、芍藥花青素、錦葵色素、矢車菊素-3-O-半乳糖苷、矢車菊素-3-O-葡萄糖苷、兒茶素、表兒茶素、表沒食子兒茶素、表兒茶素沒食子酸酯、表沒食子兒茶素沒食子酸酯、槲皮素-3-O-β-半乳糖苷、槲皮素-3-O-β-葡萄糖苷、槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖苷、山萘酚-3-O-β-半乳糖苷、山萘酚-3-O-β-葡萄糖苷、蘆丁、槲皮素、楊梅素、山奈酚、金絲桃苷、芹菜素 上述標準品為色譜純，純度＞98%，由上海源葉生物科技有限公司提供；乙腈、甲酸 為色譜純；其余試劑 分析純。

高效液相色譜儀（LC-20AT） 島津中國上海分公司；UV759紫外可見分光光度計 上海精密科學儀器有限公司；超純水器 重慶摩爾水處理設備有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品處理 取6g紫娟普洱茶，按料液比（1∶30）加入沸水，密閉后煮制2、5、7、10m in，不同時間下各煮制兩次，第一次煮制成品為第一道茶湯，第二次煮制成品為第二道茶湯，過濾后分別保存。

1.2.2 總花青素含量的測定 取200μL普洱茶湯，分別加入1.8m L氯化鉀緩沖液（pH 1.0）、乙酸鈉緩沖液（pH 4.5），于暗處反應1h后，再分別測定2個pH條件下，520nm與700nm的吸光度值，根據(jù)下式計算pH示差：

A=（A520－A700）pH 1.0－（A520－A700）pH 4.5

總花青素含量計算公式為：

總花青素含量（mg/L）=（A×MW×DF×1000）/（ε×1）

式中，A為pH差值；MW為花青素分子量（449.2）；DF為稀釋倍數(shù)；ε為矢車菊素3-葡萄糖苷的分子吸收（26900）［5］。

1.2.3 總酚含量的測定 取0.2m L茶湯，加入1m L福林-酚試劑、0.8m L 7.5%碳酸鈉，室溫下輕輕振蕩30m in，測定765nm吸光度值。以沒食子酸溶液做標準曲線（50～250μg/m L）［6］。

1.2.4 總黃酮含量的測定 取5m L樣品，與等體積2%AlCl3的甲醇溶液混合，反應10min后測定415nm處吸光度值，以5m L樣品與等體積不加A lCl3的甲醇混合液為空白對照。以槲皮素標準品溶液做標準曲線（20～100μg/m L）［7］。

1.2.5 紫娟普洱茶湯成分的分析 采用ODSC18色譜柱（150mm×6.0mm，5μm）；柱溫30℃；流速1.0m L/m in；流動相A為水/乙腈/甲酸（87/3/10），流動相B為乙腈；進樣量20μL。

采用梯度洗脫：0～45min，3%～25%B相；46min，30%B相；47m in，3%B相［6］。

花青素類檢測波長為520nm，兒茶素類檢測波長為280nm，其他黃酮類檢測波長為360nm［8］。

1.2.6·OH清除能力的測定 試管內依次加入1m L 1.5mmol/L FeSO4溶液，0.7m L 6mmol/L H2O2，0.3m L 20mmol/L水楊酸鈉溶液，再加入1m L茶湯。37℃水浴反應1h后，測定562nm處吸光度值［9］。根據(jù)下式計算·OH清除能力：

·OH清除能力（%）=［A0-（A1-A2）］/A0×100

式中，A0為空白對照的吸光度值，A1為樣品的吸光度值，A2為不加水楊酸鈉的吸光度值。

1.2.7 DPPH自由基清除能力的測定 取0.1m L茶湯，加入1m L 0.2mmol/L DPPH的甲醇溶液，置于暗處，28℃反應20m in，測定517nm處吸光度值，以不加茶湯為空白對照［10］。

DPPH自由基清除率（%）=（1-A茶湯/A空白）×100

1.2.8 總抗氧化性的測定 取0.1m L茶湯，加入1m L反應試劑（0.6mol/L硫酸，28mmol/L磷酸鈉以及4mmol/L鉬酸銨），95℃水浴90m in。冷卻至25℃，測定695nm處吸光度值，以不加茶湯為空白對照［11］。

1.2.9 還原能力的測定 取0.1m L茶湯，加入2.5m L 0.2mol/L磷酸緩沖液（pH6.6）以及2.5m L 1%鐵氰化鉀，充分混勻。50℃水浴20m in后，加入2.5m L 10%三氯乙酸，2.5m L去離子水以及0.5m L 0.1%三氯化鐵，測定700nm處吸光度值，以不加茶湯為空白對照［12］。

1.3 數(shù)據(jù)分析

所有測試均重復三次，采用單因素方差分析（ANOVA），結果以±s表示。

2 結果與分析

2.1 紫娟普洱茶湯的總花青素含量變化

紫娟普洱茶中的總花青素含量隨煮制時間的變化如圖1所示。隨煮制時間延長，茶湯的總花青素含量增加。但是，煮制兩次后，第二道茶湯的總花青素含量下降較多（p＞0.05），不同煮制時間下，第二道茶湯的總花青素含量均比第一道下降55%以上。這表明，紫娟普洱茶中的總花青素含量，在煮制10min內并未受加熱對花青素結構破壞的影響，且時間越長，總花青素浸出量越多；而煮制兩次后，不同煮制時間茶湯的總花青素含量都有較多下降，可能是因為花青素經多次加熱后，結構受到較多破壞。

圖1 不同煮制時間對總花青素浸出量的影響Fig.1 The effect of tea cooking time on total monomeric anthocyanin content

2.2 紫娟普洱茶湯的總酚含量變化

圖2 不同煮制時間對總酚浸出量的影響Fig.2 The effect of tea cooking time on total phenols content

總酚含量隨煮制時間的變化如圖2所示。隨煮制時間延長，茶湯的總酚含量增加，但7m in后增幅減緩。煮制兩次后，第二道茶湯的總酚含量顯著下降（p＜0.05），其中，煮制2m in的茶湯，第二道的總酚含量比第一道下降約57%，而煮制5～10m in的茶湯，第二道的總酚含量比第一道下降70%以上。由此推測，紫鵑普洱茶中的酚類物質可能有較多水溶性組分，因此，煮制一次后，總酚已能在短時間內較快被浸出，而煮制二次后，總酚含量下降率隨時間延長而增加。

2.3 紫娟普洱茶湯的總黃酮含量變化

總黃酮含量隨煮制時間的變化如圖3所示。隨煮制時間延長，茶湯的總黃酮含量增加；煮制兩次后，第二道茶湯的總黃酮含量下降（p＞0.05）。與總花青素、總酚不同的是，煮制2、5m in的茶湯，經二次煮制后，其總黃酮含量下降率（60%以上）高于煮制7、10m in的茶湯，這可能是由于紫娟普洱茶中的黃酮類物質水溶性成分更多，因此較短時間煮制兩次后，總黃酮含量已明顯下降。而10m in煮制兩次后的茶湯，其總黃酮含量下降率又上升（約50%），同時第一次煮制10m in的茶湯的總黃酮增幅也最高，這表明紫娟普洱茶經一定時間煮制后，可能有更多對熱穩(wěn)定的黃酮類組分被浸出。

圖3 不同煮制時間對總黃酮浸出量的影響Fig.3 The effect of tea cooking time on total flavonoids content

2.4 紫娟普洱茶湯中花青素成分的變化

經HPLC分析，紫娟普洱茶湯中含7種花青素，按洗脫先后順序分別為：矢車菊素-半乳糖苷、矢車菊素-葡萄糖苷、飛燕草素、矢車菊素、天竺葵色素、芍藥素、錦葵色素（圖4）。不同煮制時間的花青素含量如表1所示。除煮制5m in的第一道茶湯外，其他茶湯均含7種花青素，且它們的總含量隨煮制時間及二次煮制的變化趨勢與pH示差法結果相近（圖1）。隨煮制時間延長，7種花青素的含量大多呈增加趨勢，但是，增幅隨煮制時間延長而減小。煮制5m in的第一道茶湯的花青素總含量比2m in第一道的增加28.24%，10min的第一道茶湯的花青素總含量僅比7m in第一道增加9.79%；而第二道茶湯的花青素總含量，在煮制7m in后，也并無明顯增加（表1）。經二次煮制后，各花青素組分的含量均下降較多，其中，矢車菊素-半乳糖苷、矢車菊素-葡萄糖苷的含量下降更明顯。這可能是由于其他花青素缺乏糖苷，水溶性下降，因此，經過二次煮制后，它們的含量下降率不及兩種花色苷類。與pH示差法結果不同的是，煮制10m in內，第二道茶湯的花青素總含量顯著下降（p＜0.05）。

圖4 紫娟普洱茶湯的花青素類HPLC圖（10min第一道茶湯）Fig.4 The HPLC analysis of the anthocyanidin in Zijuan puer tea extraction（the firstextraction of 10min cooking sample）

表1 紫娟普洱茶湯的花青素類定量分析（μg/mL）Table 1 The anthocyanidin concentrations（μg/mL）in Zijuan puer tea extraction

2.5 紫娟普洱茶湯中兒茶素類成分的變化

經HPLC分析，紫娟普洱茶湯中含5種兒茶素類活性成分，按洗脫先后順序分別為：兒茶素、表沒食子兒茶素沒食子酸酯、表沒食子兒茶素、表兒茶素、表兒茶素沒食子酸酯（圖5）。不同煮制時間的兒茶素類含量如表2所示。除2min的煮制兩次的茶湯外，其他茶湯均含5種兒茶素類。表沒食子兒茶素的含量高于其他兒茶素類。隨煮制時間延長，紫娟普洱茶第一道茶湯的兒茶素類含量較穩(wěn)定，煮制2～7m in的第一道茶湯，其兒茶素類總含量幾乎沒有變化，而煮制10m in第一道茶湯的兒茶素類總含量也僅比7m in第一道的增加11.04%。第二道茶湯的兒茶素類總含量，在煮制5m in后的增幅也較穩(wěn)定（約10%）（表2）。經二次煮制后，各兒茶素類含量基本下降50%以上。這表明，煮制時間以及二次煮制，對水溶性相近的兒茶素類的浸出趨勢（不同時間的總浸出量、二次煮制的總含量下降率）的影響無顯著差異。煮制10m in內，第二道茶湯的兒茶素類總含量顯著下降（p＜0.01）。

圖5 紫娟普洱茶湯的兒茶素類HPLC圖（10min第一道茶湯）Fig.5 HPLC analysis of the catechins in Zijuan puer tea extraction（the firstextraction of 10min cooking sample）

圖6 紫娟普洱茶湯的其他黃酮類HPLC圖（10min第一道茶湯）Fig.6 HPLC analysis of other flavonoids in Zijuan puer tea extraction（the first extraction of 10min cooking sample）

表2 紫娟普洱茶湯的兒茶素類定量分析（μg/mL）Table 2 The catechins concentrations（μg/mL）in Zijuan puer tea extraction

表3 紫娟普洱茶湯的其他黃酮類定量分析（μg/mL）Table 3 The other flavonoids concentrations（μg/mL）in Zijuan puer tea extraction

2.6 紫娟普洱茶湯中其他黃酮類成分的變化

紫娟普洱茶湯中亦含其他11種黃酮類活性成分（圖6），不同煮制時間下，黃酮含量如表3所示。其他黃酮類成分以黃酮醇苷類為主，隨煮制時間延長，它們的總含量增加，這與分光光度法的變化趨勢（圖3）一致。其中，第一道茶湯的黃酮總含量隨時間的增幅基本大于25%，而第二道茶湯的黃酮總含量隨時間的增幅也在15%以上，這可能是由于紫娟普洱茶中含有較多黃酮類成分，因此，隨煮制時間延長，有更多的黃酮類物質被持續(xù)浸出。經二次煮制后，各黃酮含量下降較多，尤其是短時間煮制的茶湯，這可能是由于紫娟普洱茶中的黃酮類成分多為苷類，因此，水溶性較好，能較快被浸出。二次煮制7m in后，茶湯的黃酮總含量下降率再次升高，這可能是由于熱穩(wěn)定性較好的黃酮成分在第一次煮制時，隨時間延長才被較多地浸出。因此，在相對較長時間下煮制兩次后，茶湯中的總黃酮含量下降率才得以提高。與分光光度法結果不同的是，煮制10m in內，第二道茶湯的黃酮總含量顯著下降（p＜0.01）。

2.7 茶湯抗氧化能力的變化

2.7.1 茶湯清除·OH能力 不同煮制時間下，紫娟普洱茶煮制兩次的茶湯及它們的等體積合并液的·OH清除能力隨活性成分含量的變化如圖7所示。煮制時間越長，總花青素、總酚及總黃酮的浸出量越多，而茶湯的·OH清除能力也隨之增強。9個樣品的·OH清除能力與總花青素、總酚及總黃酮含量均呈線性關系（R2分別為0.843、0.902、0.613），其中，·OH清除能力與總花青素及總酚含量呈明顯的線性正相關。這表明，紫娟普洱茶的·OH清除能力可能由總花青素及總酚含量所決定。

圖7 ·OH清除能力隨活性成分含量的變化Fig.7 The·OH scavenging activity with the change of active ingredient content

2.7.2 茶湯清除DPPH自由基能力 不同煮制時間下，經適當稀釋后的茶湯DPPH自由基清除能力隨活性成分含量的變化如圖8所示。與·OH清除能力不同的是，DPPH自由基清除能力并未隨煮制時間延長而增強，即DPPH自由基清除能力與總花青素、總酚及總黃酮含量之間并無線性關系（R2分別為0.237、0.183、0.416）。

圖8 DPPH自由基清除能力隨活性成分含量的變化Fig.8 DPPH scavenging activity with the change of active ingredient content

2.7.3 茶湯的總抗氧化性 不同煮制時間下，經適當稀釋后的茶湯總抗氧化性隨活性成分含量的變化如圖9所示。茶湯的總抗氧化性與總花青素、總酚及總黃酮含量均呈明顯的線性正相關（R2分別為0.950、0.931、0.828）。

2.7.4 茶湯的還原能力 不同煮制時間下，經適當稀釋后的茶湯還原能力隨活性成分含量的變化如圖10所示。還原能力與與總花青素、總酚及總黃酮含量之間并無線性關系（R2分別為0.513、0.435、0.349）。

以上結果表明，紫娟普洱茶的總抗氧化性可能由總花青素、總酚及總黃酮含量所決定，而DPPH自由基清除能力以及還原能力卻并不受這些活性成分的影響。

3 結論與討論

3.1 紫娟普洱茶煮制10m in內（一次煮制與二次煮制），總花青素、總酚及總黃酮含量隨煮制時間增加較多，兒茶素類含量則較穩(wěn)定。由于煮制7m in與10m in，各類活性成分浸出總量增加并不顯著，因此，煮飲紫娟普洱茶時可控制煮制時間為7m in。而煮制兩次后，這些活性成分的總含量均顯著下降（p＜0.05，圖4～圖6）。因此，飲用紫娟普洱茶應以第一道茶湯為主。

圖9 總抗氧化性隨活性成分含量的變化Fig.9 Total antioxidant activity with the change of active ingredient content

圖10 還原能力隨活性成分含量的變化Fig.10 Reducing powerwith the change of active ingredient content

3.2 紫娟普洱茶含有花青素、多酚、黃酮等多種活性成分，花青素含量尤其豐富。盡管花青素被認為在加熱過程中特別不穩(wěn)定，但是有研究表明，當用不同加熱方法提取土豆中的多酚時，沸水煮15min所得花青素含量最高，且水煮前后花青素含量穩(wěn)定［13］，這與本研究的花青素穩(wěn)定性結果一致。紫鵑普洱茶中的花青素，其花色苷類含量較高，研究表明，黃酮類物質能顯著提高花色苷類的熱穩(wěn)定性［14］，由于紫娟普洱茶中含有較多黃酮，因此，煮制10m in內，其茶湯的花青素總含量隨時間延長而增加。煮制兩次后，由于茶湯中的黃酮類物質含量下降，導致花色苷的熱穩(wěn)定性降低，且花色苷類的水溶性較好，易在第一次煮制時較快被浸出，因此，二次煮制后的茶湯花青素總含量下降較多。

兒茶素類成分是茶多酚的重要組成，紫娟普洱茶經二次煮制后，兒茶素類總含量隨時間的變化都不大，這可能是因為以兒茶素類成分為主的茶多酚，在沸水中煮制一定時間的熱穩(wěn)定性較好，有研究表明，茶多酚在沸水中保持60m in的消耗率為6%［15］。但是，兒茶素、表兒茶素沒食子酸酯（ECG），經二次煮制后的含量下降率卻高于其他兒茶素類，由此表明，這兩種組分在茶湯中的熱穩(wěn)定性可能低于其他兒茶素類。

3.3 紫鵑普洱茶湯的·OH自由基及總抗氧化性，與總花青素、總酚及總黃酮含量呈較好的線性正相關，其中，與總花青素、總酚含量呈明顯的正相關（R2＞0.8），而茶湯的DPPH自由基清除能力、還原能力則與這些活性成分不呈線性相關。因此，紫鵑普洱茶湯的抗氧化性主要與總花青素及總酚有關。

對于上述抗氧化指標與總花青素、總酚以及總黃酮含量之間的關系，不同學者的研究結果不盡相同［16-21］。這可能是由于評價結果受這些活性成分的具體組成以及所用的抗氧化指標測試方法的影響。盡管紫鵑普洱的DPPH自由基清除能力及還原能力與活性成分含量之間不呈線性正相關，但是，由于·OH等自由基是生物體內最常見的活性氧簇，而過氧化氫所誘發(fā)的自由基又最易通過細胞膜［22］。因此，控制合適的煮制時間，盡可能多地浸出花青素與多酚類物質，可有效起到保護細胞免受活性氧簇侵襲的作用。

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Effect of tea cooking time on antioxidant activities of Zijuan puer tea

TANG Xiao，NICui-yang，WANG Li-ying，WANG Shan，WANG Yun，HUA Jia-tian
（College of Chemical Engineering，Ningbo Polytechnic College，Ningbo 315800，China）

It was investigated that the effect of tea cooking time and two times of cooking on antioxidant activitiesof Zijuan puer tea. The contents of total monomeric anthocyanin ， total phenols and total flavonoids weredetermined. The relation between hydroxyl radical scavenging activity，DPPH radical scavenging activity，totalantioxidant activity and reducing power of tea extractions and the contents of these active ingredients wastested. The results indicated that within 10 minutes of tea cooking，the contents of active ingredients enhancedwith time，however，the amplification decreased with time. After 7 minutes of tea cooking for one time，theincrease of total contents of different types of active ingredients almost tended to be steady. The total contentof different types of active ingredients in Zijuan puer tea apparently decreased after two times of cooking （p＜0.05）. The hydroxyl radical scavenging activity and total antioxidant activity of Zijuan puer tea showed apositive linear correlation with the contents of active ingredients，which was more apparent with the contents oftotal monomeric anthocyanin and total phenols（R2＞0.8）.

tea cooking；Zijuan puer tea；antioxidant activity

TS201.2

A

1002-0306（2015）08-0141-07

10.13386/j.issn1002-0306.2015.08.020

2014－11－13

湯曉（1981-），女，碩士，講師，研究方向：黃酮類化合物的提取與應用。