黑莓籽總多酚、總黃酮含量及其抗氧化活性

張 偉，尹震花，張 勇，康文藝

（黃河科技學(xué)院，河南鄭州450063）

黑莓籽總多酚、總黃酮含量及其抗氧化活性

張 偉，尹震花，張 勇，康文藝*

（黃河科技學(xué)院，河南鄭州450063）

采用清除DPPH自由基、ABTS自由基及鐵離子還原能力法評(píng)價(jià)黑莓籽體外抗氧化活性，F(xiàn)olin-Ciocalteau法測(cè)其總多酚含量，NaNO2-AlCl3比色法測(cè)定其總黃酮含量，相關(guān)系數(shù)法分析其總多酚、總黃酮與抗氧化活性間的相關(guān)性。結(jié)果顯示，乙酸乙酯部位和正丁醇部位具有強(qiáng)的DPPH自由基［IC50=（41.93±4.05）、（64.75±5.89）μg/mL］和ABTS自由基［IC50=（2.91±0.46）、（3.18±1.01）μg/mL］清除活性，較強(qiáng)的鐵離子還原能力［Trolox當(dāng)量=（2348.73±2.78）、（1262.55± 31.58）μmol/g］，石油醚部位具有ABTS自由基［IC50=（21.85±0.61）μg/mL］清除活性和較弱的鐵離子還原能力［Trolox當(dāng)量=（123.59±10.01）μmol/g］。3個(gè)部位總多酚、總黃酮含量與清除ABTS自由基能力之間存在一定的相關(guān)性（R2分別為0.6832、0.2596）；總多酚含量與還原鐵離子能力（Trolox當(dāng)量）之間存在一定的相關(guān)性（R2=0.990）?？梢?jiàn)，黑莓籽具有良好的抗氧化活性。

黑莓籽，抗氧化活性，總多酚，總黃酮

黑莓（Rubus spp.Blackberry）為薔薇科（Rasaceae）懸鉤子屬聚合果類(lèi)植物，果實(shí)營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和藥用價(jià)值高，主要作為加工型水果［1-2］。具有清除自由基、延緩衰老、增強(qiáng)免疫力等功能，特別具有降低膽固醇含量、防治心臟疾病、抗癌（降低化療引起的毒副作用）和抗血栓的功效［3-5］。

黑莓籽是黑莓果酒和果汁等產(chǎn)品的副產(chǎn)物，具有豐富的黃酮、多酚類(lèi)和花青素等天然活性成分，是黑莓綜合利用的一個(gè)重要部分。參閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，對(duì)于四氧嘧啶誘導(dǎo)的糖尿病小鼠，黑莓籽石油醚部位和乙酸乙酯部位及黑莓籽油具有體內(nèi)糾正脂質(zhì)代謝紊亂和增強(qiáng)機(jī)體抗氧化防御體系的能力［6］；對(duì)于高血脂小鼠，黑莓籽石油醚部位和正丁醇部位及黑莓籽油具有一定程度的調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝和抗脂質(zhì)過(guò)氧化，改善脂質(zhì)在小鼠肝臟和脾中的蓄積，減少氧化應(yīng)激［7］的作用；對(duì)于四氯化碳誘導(dǎo)小鼠急性肝損傷，黑莓籽石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位和黑莓籽油的抗氧化機(jī)制是其保肝作用機(jī)制之一［8］；蔣彩云等發(fā)現(xiàn)黑莓籽的總提取物具有清除DPPH自由基和氧自由基的作用［9］；陳欣欣研究發(fā)現(xiàn)，黑莓渣中提取出的多酚類(lèi)化合物有較強(qiáng)的還原能力，能夠抑制脂質(zhì)體過(guò)氧化，具有清除·OH、O2·-和DPPH·的活性，且其多酚類(lèi)化合物的抗氧化活性與其濃度之間有良好的量效關(guān)系［10］。但有關(guān)黑莓籽不同極性部位的抗氧化活性及其總多酚和總黃酮的含量的研究還未見(jiàn)報(bào)道。本文采用不同溶劑對(duì)黑莓籽進(jìn)行提取，得到3個(gè)極性不同的部位，同時(shí)測(cè)定樣品中總多酚和總黃酮的含量，清除DPPH和ABTS自由基及鐵離子還原能力，觀察它們之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黑莓籽 2013年7月購(gòu)買(mǎi)于河南省封丘縣，由河南大學(xué)天然藥物研究所李昌勤教授鑒定為薔薇科（Rasaceae）懸鉤子屬聚合果類(lèi)植物黑莓（Rubus spp. Blackberry）籽，標(biāo)本存于黃河科技學(xué)院天然藥物研究所；1，1-二苯基-2-苦?；杂苫―PPH） 日本東京化成工業(yè)株式會(huì)社；Fe3+-三吡啶三啞嗪（TPTZ）、二丁基羥基甲苯（BHT） 比利時(shí)AcrosOrganics公司；2，2′-連氨-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二氨鹽（ABTS） 美國(guó)Fluka公司；Trolox（6-hydroloxy-2，5，7，8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid） Aldrich公司；鄰苯二酚 北京化學(xué)試劑公司；斐林酚試劑Merck公司；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品 河南大學(xué)天然藥物研究所提供，純度98%；其他試劑 均為分析純。

UV-2000型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 尤尼可上海儀器有限公司；電子天平 梅特勒-托利多儀器有限公司；MultiskaMK3酶標(biāo)儀 美國(guó)Thermo Electron公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 德國(guó)Heidolph公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品提取及配制 黑莓籽粉末，用50L石油醚冷浸4次，每次3d脫脂；脫脂后的殘?jiān)鼡]干石油醚后，加入40L 70%乙醇冷浸3次，每次3d，濃縮、回收乙醇得到乙醇總浸膏。總浸膏分散于水中，依次用500m L石油醚、乙酸乙酯和正丁醇進(jìn)行萃取，萃取4次，得黑莓籽石油醚部位、乙酸乙酯部位和正丁醇部位。

分別稱取3個(gè)部位樣品4mg，加入2m L的甲醇，80Hz超聲30m in溶解，配成所需濃度的樣品用于抗氧化活性和含量的測(cè)定。

1.2.2 抗氧化活性測(cè)定

1.2.2.1 清除DPPH自由基能力的測(cè)定 參考文獻(xiàn)［11］的方法，按公式（1）計(jì)算DPPH自由基清除率。每份樣品平行操作3次，取平均值。

式中：Acontrol為DPPH本身在測(cè)定波長(zhǎng)的吸收度，Asample為樣品對(duì)DPPH作用后的吸收度數(shù)值（除去樣品自身吸收）。

1.2.2.2 清除ABTS自由基能力的測(cè)定 參考文獻(xiàn)［12］的方法，按公式（2）計(jì)算ABTS自由基清除率。每份樣品平行操作3次，取平均值。

式中：Acontrol為ABTS自由基本身在測(cè)定波長(zhǎng)的吸收度，Asample為樣品對(duì)ABTS自由基作用后的吸收度數(shù)值（除去樣品自身吸收）。

1.2.2.3 鐵離子還原能力（FRAP）的測(cè)定 參考文獻(xiàn)［13］酶標(biāo)儀的方法測(cè)定黑莓籽鐵離子還原能力。

1.2.2.4 數(shù)據(jù)處理 依據(jù)上述公式計(jì)算得到的清除率，用Origin 8.0軟件處理，得到樣品清除DPPH自由基和ABTS自由基的半數(shù)清除率IC50值。

1.2.3 總多酚和總黃酮的含量測(cè)定

1.2.3.1 總多酚的含量測(cè)定 在參考文獻(xiàn)［14］的基礎(chǔ)上，A lCl3代替A l（NO3）3，改進(jìn)反應(yīng)時(shí)間、測(cè)定波長(zhǎng)和體積，于510nm處測(cè)定吸光度。以吸光度（Y）對(duì)鄰苯二酚濃度（X，mg/m L）作圖，得鄰苯二酚標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算黑莓籽三個(gè)部位的總多酚含量。

1.2.3.2 總黃酮的含量測(cè)定 在參考文獻(xiàn)［15］的基礎(chǔ)上，改進(jìn)反應(yīng)時(shí)間、測(cè)定波長(zhǎng)和體積，于765nm處測(cè)定吸光度。以吸光度（Y）對(duì)蘆丁濃度（X，mg/m L）作圖，得蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算黑莓籽三個(gè)部位總黃酮含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 DPPH自由基清除活性

以各樣品質(zhì)量濃度為自變量，對(duì)DPPH自由基清除率為因變量進(jìn)行曲線擬合，結(jié)果如圖1所示。在選定的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)（6.76～108.11μg/m L）內(nèi)，乙酸乙酯部位和正丁醇部位對(duì)DPPH清除率幾乎呈線性關(guān)系增加，進(jìn)行線性擬合，結(jié)果表明線性關(guān)系較好，R2分別為0.9672和0.999。在初篩濃度108.11μg/m L時(shí)，石油醚部位對(duì)DPPH自由基的清除率低于50%，故IC50未測(cè)定，故沒(méi)有石油醚部位的數(shù)據(jù)。

圖1 提取物質(zhì)量濃度對(duì)DPPH自由基的影響Fig.1 Effectofmass concentration of extracts on DPPH free radical

在DPPH自由基清除實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)上述線性擬合方法得到乙酸乙酯部位和正丁醇部位清除DPPH自由基的IC50值分別為（41.93±4.05）和（64.75±5.89）μg/ m L，結(jié)果見(jiàn)表1。與陽(yáng)性對(duì)照BHT相比，正丁醇部位活性比BHT弱（p＜0.05）。乙酸乙酯部位具有較強(qiáng)的清除DPPH自由的能力，且與BHT相當(dāng)，無(wú)顯著性差異（p＞0.05）。

表1 黑莓籽不同部位的抗氧化活性Table 1 Antioxidant activity of different extracts from blackberry seed

2.2 ABTS自由基清除活性

ABTS是一種水溶性的自由基引發(fā)劑，經(jīng)活性氧氧化后生成穩(wěn)定的藍(lán)綠色陽(yáng)離子自由基ABTS+·，向其中加入被測(cè)物質(zhì)，當(dāng)待測(cè)物質(zhì)中含有抗氧化成分時(shí)，該物質(zhì)會(huì)與ABTS+·發(fā)生反應(yīng)而使反應(yīng)體系顏色褪去，此時(shí)ABTS+在734nm處有最大吸收。利用此原理進(jìn)行樣品清除ABTS自由基能力的測(cè)定。

以各樣品質(zhì)量濃度為自變量，對(duì)ABTS自由基清除率為因變量進(jìn)行曲線擬合，如圖2所示。由圖2可見(jiàn)，在5.95～47.62μg/m L范圍內(nèi)，石油醚部位對(duì)ABTS清除率幾乎呈線性關(guān)系增加，進(jìn)行線性擬合，其線性關(guān)系較好，R2為0.9784，當(dāng)濃度超過(guò)47.62μg/m L，對(duì)ABTS自由基的清除緩慢增加。在1.49～11.91μg/m L范圍內(nèi)，乙酸乙酯部位和正丁醇部位對(duì)ABTS清除率幾乎呈線性增加，線性擬合結(jié)果表明線性關(guān)系較好，R2分別為0.9296和0.9806。當(dāng)質(zhì)量濃度為11.91μg/m L時(shí)，乙酸乙酯部位和正丁醇部位對(duì)ABTS清除率分別達(dá)到了98.57%和99.01%，此后清除率幾乎不變。

圖2 提取物質(zhì)量濃度對(duì)ABTS自由基的影響Fig.2 Effect ofmass concentration of extracts on ABTS free radical

在ABTS自由基清除實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)上述線性范圍內(nèi)的擬合方法得石油醚部位、乙酸乙酯部位和正丁醇部位清除ABTS自由基的IC50值分別為（21.85± 0.61）、（2.91±0.46）和（3.18±1.01）μg/m L，結(jié)果見(jiàn)表1。與陽(yáng)性對(duì)照BHT相比，三個(gè)部位與BHT之間均具有顯著性差異（p＜0.05），其中石油醚部位清除ABTS自由基的IC50值大于BHT，乙酸乙酯、正丁醇部位小于BHT。由此可見(jiàn)，乙酸乙酯部位和正丁醇部位具有較強(qiáng)的清除ABTS自由基的能力，且強(qiáng)于BHT，石油醚部位清除ABTS自由基的能力弱于BHT。

2.3 鐵離子還原能力

目前，測(cè)定鐵離子還原能力的方法有Fe3+-三吡啶三啞嗪和鐵氰化鉀法。范金波等［16］采用這兩種方法測(cè)定了綠咖啡豆提取物還原鐵離子能力，結(jié)果顯示，兩種實(shí)驗(yàn)方法得到的結(jié)果一致，但對(duì)比發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)e3+-三吡啶三啞嗪法較鐵氰化鉀法更靈敏且操作也更簡(jiǎn)單，缺點(diǎn)是成本高。本實(shí)驗(yàn)采用酶標(biāo)儀建立了Fe3+-三吡啶三啞嗪微量法，試劑用量少，降低了實(shí)驗(yàn)成本。

在低pH的溶液中，F(xiàn)e3+可被抗氧化劑還原為Fe2+，呈現(xiàn)出明顯的藍(lán)色，并在595nm處有最大吸收，根據(jù)此原理測(cè)定黑莓籽樣品鐵離子還原能力。結(jié)果以相對(duì)于Trolox抗氧化劑的能力來(lái)表示。

黑莓籽3個(gè)部位對(duì)鐵離子還原能力結(jié)果見(jiàn)表1。由表1可以看出，與陽(yáng)性對(duì)照BHT比較，石油醚部位還原鐵離子能力弱于BHT（p＜0.05）；而乙酸乙酯部位強(qiáng)于BHT（p＜0.05）；正丁醇部位與BHT相當(dāng)（p＞0.05）。三者還原能力依次為：乙酸乙酯部位＞正丁醇部位＞石油醚部位。

2.4 總多酚、總黃酮含量與其體外抗氧化相關(guān)性分析2.4.1 各部位總多酚、總黃酮的含量 各部位總多酚、總黃酮的含量繪制總多酚和總黃酮含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線，以吸光度（Y）對(duì)鄰苯二酚濃度（X，g/m L）作圖，得鄰苯二酚標(biāo)準(zhǔn)曲線，Y=0.119X-0.049（R2=0.9970）；以吸光度（Y）對(duì)蘆丁濃度（X，g/m L）作圖，得蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線，Y=0.009X-0.004（R2=0.999），以此計(jì)算黑莓籽3個(gè)部位中總多酚和總黃酮的含量結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 黑莓籽不同部位總多酚和總黃酮含量Table 2 Contents of total phenols and total flavonoids different extracts from blackberry seed

由表2可以看出，乙酸乙酯部位較石油醚部位和正丁醇部位總多酚含量高，三者之間具有顯著性差異（p＜0.05）；石油醚部位和乙酸乙酯部位較正丁醇部位總黃酮含量高，除石油醚和乙酸乙酯部位之間差異不顯著外（p＞0.05），其余兩組均差異顯著（p＜0.05）。

結(jié)合表1數(shù)據(jù)可以綜合分析，石油醚部位抗氧化能力與總多酚含量高低有關(guān)；乙酸乙酯部位中總多酚和總黃酮含量均高于正丁醇部位，且乙酸乙酯部位清除DPPH自由基的能力（IC50值）大于正丁醇部位，可見(jiàn)，乙酸乙酯部位和正丁醇部位清除DPPH自由基的能力與其總多酚和總黃酮含量高低有關(guān)。

2.4.2 體外抗氧化相關(guān)性分析 以清除ABTS自由基活性（IC50）對(duì)總多酚（或總黃酮）含量（%）作圖，得體外清除ABTS自由基相關(guān)性；以還原鐵離子能力（Trolox當(dāng)量）對(duì)總多酚（或總黃酮）含量（%）作圖，得體外還原鐵離子能力相關(guān)性，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 體外抗氧化相關(guān)性分析Table 3 In vitro antioxidant correlation analysis

由表3數(shù)據(jù)相關(guān)系數(shù)（R2）可以看出，清除ABTS自由基能力與總多酚含量之間的相關(guān)性高于與總黃酮含量之間的相關(guān)性，還原鐵離子能力與總多酚含量的相關(guān)性最高（R2=0.990），而還原鐵離子能力與總黃酮含量之間的相關(guān)性系數(shù)低于0.01。

3 討論

多種疾病，如糖尿病、肝損傷、心臟病、癌癥、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中，都出現(xiàn)了自由基的增多和抗氧化能力的減弱［17-18］。因此天然抗氧化成分日益成為國(guó)內(nèi)外研究熱點(diǎn)。由于果蔬、新鮮食品中的抗氧化活性物質(zhì)種類(lèi)復(fù)雜，導(dǎo)致極性、溶解性等不同；此外，雖然體外抗氧化機(jī)理只有單電子轉(zhuǎn)移和氫原子轉(zhuǎn)移，但抗氧化評(píng)價(jià)方法多且不統(tǒng)一，使目前食品中抗氧化能力的計(jì)算方法沒(méi)有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)［19］；另外，同一種樣品中會(huì)有多種抗氧化物質(zhì)同時(shí)存在，在一定程度上會(huì)出現(xiàn)協(xié)同抗氧化作用［20］。因此，對(duì)于同一個(gè)樣品，應(yīng)采用三種及其以上抗氧化方法綜合評(píng)價(jià)抗氧化活性。本文采用三種抗氧化方法，測(cè)定了黑莓籽不同極性部位的抗氧化活性。由結(jié)果可以看出，黑莓籽3個(gè)部位對(duì)DPPH和ABTS自由基及還原鐵離子能力具有相同的趨勢(shì)，即：乙酸乙酯部位＞正丁醇部位＞石油醚部位。

研究證明，天然植物中黃酮類(lèi)和多酚類(lèi)成分的含量與其抗氧化能力有很強(qiáng)的相關(guān)性。其中，酚類(lèi)化合物具有多種功能，能夠成為自由基終止劑、金屬螯合劑和單線態(tài)氧淬滅劑，其清除能力主要通過(guò)其羥基實(shí)現(xiàn)的［21］。黃酮類(lèi)化合物由于具有酚羥基，在很早就被認(rèn)為是最主要的抗氧化劑，能夠延緩或者抑制脂質(zhì)過(guò)氧化和氧化鏈反應(yīng)［22］，兩者雖然都含有酚羥基，但是其作用機(jī)理有一定的區(qū)別。參閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，黑莓的抗氧化性與總酚含量有很強(qiáng)的相關(guān)性［23］；黑莓渣中提取出的多酚類(lèi)化合物有較強(qiáng)的還原能力，具有清除OH、O2-和DPPH自由基的活性，且其多酚類(lèi)化合物的抗氧化活性與其濃度之間有良好的量效關(guān)系［10］。本文研究發(fā)現(xiàn)黑莓籽總多酚與抗氧化能力之間存在很高的相關(guān)性，總黃酮與抗氧化能力之間的相關(guān)性則相對(duì)較低，這與黑莓或黑莓渣的研究文獻(xiàn)結(jié)果一致。可見(jiàn)，黑莓、黑莓渣或黑莓籽的抗氧化活性主要與其總多酚的含量有關(guān)。

4 結(jié)論

黑莓籽乙酸乙酯部位和正丁醇部位具有清除DPPH自由基、ABTS自由基的活性及還原鐵離子能力；石油醚部位具有ABTS自由基清除活性和較弱的鐵離子還原能力。3個(gè)部位總多酚、總黃酮含量與清除ABTS自由基能力之間存在一定的相關(guān)性（R2分別為0.6832、0.2596）；總多酚含量與還原鐵離子能力之間存在一定的相關(guān)性（R2=0.990）?？梢?jiàn)，黑莓籽具有開(kāi)發(fā)功能食品的應(yīng)用前景。

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Contents of total plyphenols and total flavones and antioxidant activity of blackberry seed

ZHANG W ei，YIN Zhen-hua，ZHANG Yong，KANGW en-yi*
（Huanghe Science and Technology College，Zhengzhou 450063，China）

DPPH，ABTS and ferric ion reducing power methods were used to evaluate in vitro antioxidant activity of blackberry seed.The content of polyphenols was measured using the Folin-Ciocalteau method，and the content of total flavones was measured using the NaNO2-AlCl3colorimetric method.Correlation between polyphenol and flavone contents and antioxidant capacity was analyzed.The results showed that ethyl acetate extract and n-butanol extract from blackberry seed had DPPH［IC50=（41.93±4.05），（64.75±5.89）μg/m L，respectively］and ABTS radical scavenging activity［IC50=（2.91±0.46），（3.18±1.01）μg/m L，respectively］，and ferric ion reducing power［Trolox equivalent=（2348.73±2.78），（1262.55±31.58）μmol/g，respectively］.Petroleum ether extract had ABTS radical scavenging activity［IC50=（21.85±0.61）μg/m L］and weak ferric ion reducing power［Trolox equivalent=（123.59±10.01）μmol/g］.An excellent correlation between ABTS rad ical scavenging activity of three extracts and the contents of total polyphenols and total flavones were observed（R2=0.6832 and 0.2596）.Ferric ion reducing power was correlated with the content of total polyphenols（R2=0.990）.Blackberry seed had antioxidant activity.

b lackberry seed；antioxidant activity；total polyphenols；total flavones

TS255.1

A

1002-0306（2015）08-0125-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.08.016

2014－07－30

張偉（1974-），男，碩士，副教授，主要從事中藥活性成分方面的研究。

*通訊作者：康文藝（1971-），男，博士，教授，主要從事中藥活性成分及西藥開(kāi)發(fā)方面的研究。

鄭州市科技局科技攻關(guān)計(jì)劃（20120684，20140790）；河南省高等學(xué)校青年骨干教師資助計(jì)劃（2013GGJS-220）；河南省科技廳重點(diǎn)攻關(guān)項(xiàng)目（142102310147）。