核磁共振脈沖寬度法測定嬰幼兒乳粉中乳糖、蔗糖含量

姜 潔，李 瑋，路 勇，何 濤，趙雅松，宋麗萍

（北京市食品安全監(jiān)控和風險評估中心，北京100041）

核磁共振脈沖寬度法測定嬰幼兒乳粉中乳糖、蔗糖含量

姜 潔，李 瑋，路 勇，何 濤，趙雅松，宋麗萍

（北京市食品安全監(jiān)控和風險評估中心，北京100041）

建立了乳粉中乳糖、蔗糖的NMR脈沖寬度定量分析法。以已知濃度的順丁烯二酸為定量外標，利用核磁信號互易原理實現(xiàn)對分析物的定性、定量分析。結(jié)果表明，本方法中乳糖、蔗糖在標準品與外標摩爾濃度比為0.05～5.00范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)均大于0.999；平均加標回收率為100.19%～103.21%，相對標準偏差在1.79%～3.57%之間。與現(xiàn)行的國家標準嬰幼兒乳粉中乳糖、蔗糖含量測定方法（GB 5413.5-2010）相比，該方法具有操作簡便，取樣量小，選擇性好，無需標準品作參比等優(yōu)點，適于乳粉樣品中乳糖、蔗糖含量的快速測定。

核磁共振，脈沖寬度定量，嬰幼兒乳粉，乳糖，蔗糖

核磁共振氫譜定量（qHNMR，Quantitative1H Nuclear Magnetic Resonance）技術(shù)發(fā)展迅猛，目前已被廣泛的用于藥物質(zhì)量控制［1-3］、代謝組學［4-5］、食品科學［6-8］等研究領(lǐng)域。qHNMR分析法以結(jié)構(gòu)測定為基礎(chǔ)，有著選擇性好，樣品無需分離，可同時測定被測樣品中多種成分含量等優(yōu)點。傳統(tǒng)的qHNMR內(nèi)標法是在樣品中加入已知量的化合物作為校正參比內(nèi)標，將被測樣品定量質(zhì)子的信號峰面積與內(nèi)標物定量信號峰面積進行比較，最終確定樣品的濃度。因此，內(nèi)標物應(yīng)滿足含量準確，溶解性好，其定量峰與待測組分定量峰的化學位移相近并能完全分離，縱向弛豫時間T1要小于被測物T1等要求。食品樣品基質(zhì)復(fù)雜，在實際應(yīng)用中很難找到合適的內(nèi)標物，因此外標qHNMR分析方法更適合食品樣品的檢測。NMR脈沖寬度定量（Pulse Length Based Concentration Determination，PULCON）技術(shù)，以核磁信號強度互易原理（Princip le of Reciprocity in NMR Signal Strength）［9-11］為基礎(chǔ)，在同一個探頭中通過先后測定分別放入兩個核磁管中外標物和樣品的1H-NMR譜定量峰信號面積及90°脈沖寬度，即可完成對分析物的無內(nèi)標qHNMR絕對定量。與NMR電信號內(nèi)標分析法［5，12-13］相比，PULCON不用改變儀器的硬件，操作簡單，使用方便。Gerhard等［14］將這一技術(shù)應(yīng)用于蛋白質(zhì)的NMR定量分析，但目前，尚未見小分子的應(yīng)用報道［15］。

乳糖是6個月以內(nèi)嬰兒主要能量來源，對嬰幼兒的生長發(fā)育有著重要的作用。乳粉中添加蔗糖可以改善乳粉口味，但嬰幼兒食用過量的蔗糖會危害身體健康，如引發(fā)兒童期肥胖、增加得齲齒的風險等。目前，現(xiàn)行的食品安全國家標準中，嬰幼兒乳粉中乳糖和蔗糖含量的測定方法推薦高效液相色譜法和萊因-埃農(nóng)氏法［16］。但萊因-埃農(nóng)氏法存在滴定條件不易控制和終點難以確定的缺點，而高效液相色譜法配合示差折光檢測器的穩(wěn)定性重復(fù)性和選擇性均有一定程度的不足［17］。本研究運用多種NMR技術(shù)，對乳粉重水（D2O）溶液中乳糖、蔗糖的主要1H-NMR譜特征信號峰進行了確認，以建立乳粉中乳糖、蔗糖的PULCON分析方法。該法檢測速度快、操作簡單、取樣量少，無需標準品及內(nèi)標，旨為食品快速檢測領(lǐng)域研究提供一種可選的分析方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

乳糖、蔗糖、順丁烯二酸標準品 美國SIGMA公司；重水（D2O，99.9%）、DSS［3-（三甲基硅基）-1-丙磺酸鈉］美國CIL公司；嬰幼兒配方乳粉樣品（1、2、3號樣品分別為2、1、3段嬰幼兒配方奶粉） 購于市內(nèi)某超市。

Bruker AVANCE 600MHz超導(dǎo)傅立葉變換核磁共振儀 配有BBO探頭和topspin3.2處理軟件，瑞士Bruker公司；Norell 5mm核磁管 美國Norell公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 標準儲備液及外標溶液的配制 精確稱取一定量的乳糖、蔗糖標準品，用D2O分別配制成100mmol/L的標準儲備液，置冰箱-20℃條件下保存。精確稱取適量順丁烯二酸，用D2O配制成10mmol/L的外標液，移取600μL于核磁管中作為外標定量管。

1.2.2 樣品制備 稱取乳粉樣品20mg于離心管中，加入1m L D2O，充分振搖，靜置5m in后，過0.22μm濾膜。取濾液600μL于核磁管中，備用。

1.2.3 采樣參數(shù) 實驗使用的核磁共振儀1H載波頻率為600.13MHz，實驗溫度為300K，采樣次數(shù)NS為64次，空掃次數(shù)DS為2次，采樣點TD為64K，譜寬SWH為6009.62Hz，外標脈沖延遲時間D1為40.0s，樣品D1為10.0s。

1.2.4 PULCON定量原理及計算公式 PULCON定量技術(shù)的基礎(chǔ)是NMR信號強度互易原理［10］，該原理可被描述為：將含有磁性原子核（自旋量子數(shù)不為零）的樣品放置于具有強磁場環(huán)境的線圈中，原本雜亂無章的微觀核磁矩會在宏觀上形成按強磁場方向排列的磁化強度（M）。給線圈通入單元直流電使其在樣品處產(chǎn)生一射頻場（B1），該線圈接收到的由M進動所產(chǎn)生的感應(yīng)信號強度（S）與B1成正比。

簡單地說，對在一個給定的核磁線圈中的樣品，其射頻90°脈沖寬度與信號檢測靈敏度成反比。根據(jù)這一原理，給定NMR線圈測定樣品的信號強度S可以用公式（2）表示［12］：

式中，S為樣品信號強度；c為物質(zhì)的摩爾濃度；T為實驗時探頭的溫度（K）；B90為已調(diào)諧、匹配好的NMR線圈測得的樣品90°脈沖射頻場強；Blu為單位電流在體積單元dV上產(chǎn)生的場強；M為在dV上垂直于靜磁場方向的磁化強度。

由于射頻場強B90與90°脈沖寬度成反比，當液體樣品在線圈z方向的有效體積足夠時，在樣品有效體積區(qū)間內(nèi)對公式（2）積分，就可將在同一線圈中獨立測定的兩個1H-NMR譜圖信號強度和濃度聯(lián)系起來，即：

式中，c為物質(zhì)的摩爾濃度；S為定量峰積分面積；n為定量峰所包含的質(zhì)子數(shù)；θ90為90°脈沖寬度；T為實驗溫度；下標U及R分別代表被測物和外標物；fT為修正因子，當定量外標物和被測物使用同一個脈沖在短時間內(nèi)先后測定時，fT可視為等于1。

通過分別測定已知濃度定量外標物和被測物的定量峰峰面積、90°脈沖寬度，將其帶入公式（3）進行計算，就可得到樣品中被測物的絕對含量。

1.2.5 標準溶液的配制及曲線繪制 準確吸取一定體積的乳糖、蔗糖標準儲備液，制為混標。用D2O將混標逐級稀釋，配制成乳糖、蔗糖濃度均為0.5、1.0、5.0、10.0、20.0、50.0mmol/L的6個混合標準樣品溶液。在1.2.3項條件下，首先測定外標管的1H-NMR譜，再依次測定上述6個混標溶液的1H-NMR圖譜。計算測定被測物定量峰面積與90°脈沖寬度乘積和外標物峰面積與90°脈沖寬度乘積的比值，以此比值為縱坐標，被測物的濃度與外標物濃度的比值（CU/ CR）為橫坐標做線性回歸。

1.2.6 精密度實驗 準確吸取混合標準品D2O溶液（乳糖、蔗糖濃度均為5mmol/L）600μL于核磁管中，在1.2.3項條件下分別測定外標物和混標的定量信號峰峰面積和脈沖寬度，1d內(nèi)重復(fù)6次，以計算精密度。

1.2.7 重現(xiàn)性實驗 按1.2.2項下方法平行制備6份樣品溶液，在1.2.3項條件下分別測定外標物和樣品的定量信號峰峰面積和脈沖寬度，計算值。

1.2.8 穩(wěn)定性實驗 取同一樣品溶液，分別于0、2、4、6、8、12、24、48h進行測定，在1.2.3項條件下分別測定外標物和樣品各時間點的定量信號峰峰面積和脈沖寬度，計算值。

1.2.9 加標回收率實驗 平行稱取12份乳粉樣品，其中3份作為對照，余下分別加入低、中、高3個不同濃度的標準品溶液，每個添加水平重復(fù)3次，按1.2.2項下方法制備，在1.2.3項條件下測定1H-NMR圖譜，計算回收率和標準偏差（RSD）。

1.2.10 樣品測定 實驗前，使用ASTM標準管精確校準90°脈沖寬度。按照1.2.3項下條件，首先測定外標的1H-NMR譜，完成后設(shè)置D1=10.0s，余下參數(shù)不變，測定各待測樣品的1H-NMR圖譜。測定每個樣品前都要調(diào)諧和匹配探頭、精細勻場、測定并記錄對應(yīng)的90°脈沖寬度。測得的定量圖譜使用Bruker Topspin 3.2軟件處理，變換點數(shù)為96K，用指數(shù)窗函數(shù)處理，基線和相位校正均采用手動方式進行。乳糖、蔗糖信號確認實驗的1H-NMR圖譜以DSS定標；其余所有1H-NMR圖譜參照確認實驗的圖譜信號，以蔗糖中葡萄糖基的端基質(zhì)子定標。每個樣品的積分面積取5次積分的平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳粉樣品1H-NMR譜中乳糖和蔗糖特征峰確認、定量峰及外標物的選擇

測定乳糖、蔗糖標準品在D2O中的1H-NMR譜，結(jié)合HMQC、HMBC、1H-1H COSY等2D-NMR圖譜對乳糖、蔗糖1H-NMR譜信號峰進行歸屬。由于端基碳的兩個質(zhì)子間的兩面角不同其耦合常數(shù)也不同。對于呋喃型葡萄糖和半乳糖來說，β構(gòu)型端基碳兩個質(zhì)子之間的兩面角接近180°，它們的偶合常數(shù)（J1，2）接近8.0Hz；α構(gòu)型端基碳兩個質(zhì)子之間的兩面角接近60°，它們的J1，2接近4.0Hz，因此，根據(jù)端質(zhì)子的偶合常數(shù)可以判斷糖的構(gòu)型。通過對乳糖、蔗糖標準品（D2O）的1H-NMR譜中端基質(zhì)子耦合常數(shù)的分析可知，蔗糖在D2O中只存在一種構(gòu)型，乳糖在D2O中存在兩種構(gòu)型（圖1），與文獻報道相符［7，18］。結(jié)合以上信息，對乳粉樣品1H-NMR譜圖（圖2）中乳糖、蔗糖的特征信號進行確認（表1）。利用這些特征信號，可以實現(xiàn)對乳粉樣品中乳糖和蔗糖的無標樣定性分析。

圖1 乳糖、蔗糖在D2O中構(gòu)型Fig.1 Configurations of lactose and sucrose in D2O

圖2 乳粉樣品的1H-NMR譜（D2O）Fig.2 1H-NMR spectrum ofmilk powder（D2O）

表1 乳粉樣品1H-NMR譜中乳糖、蔗糖特征信號（D2O）Table 1 The1H-NMRdataoflactoseand sucrose in sample（D2O）

蔗糖和乳糖均為二糖，糖環(huán)上多數(shù)質(zhì)子的化學環(huán)境比較相近。在圖2中，這些質(zhì)子的1H-NMR信號分布在δH3.0～4.0范圍內(nèi)，峰與峰多有重疊，裂分情況難以歸屬（如圖2e），因此不能用于定量分析。但由于糖的端基質(zhì)子受到的去屏蔽作用明顯強于環(huán)上其他質(zhì)子，因此糖的端基質(zhì)子一般會出現(xiàn)在δH4.3～5.5的低場區(qū)，很易辨識。在圖2中，蔗糖和乳糖分子中的葡萄糖基和乳糖分子中半乳糖基的四個端基質(zhì)子信號（a、b、c、d）與樣品中其他成分信號無重疊，峰形尖銳，易于辨認。但乳糖中葡萄糖基的端基質(zhì)子有α（δH5.17）和β（δH4.61）兩種構(gòu)型，且在D2O中可相互轉(zhuǎn)化，不宜用于定量。所以，最終選定乳糖中半乳糖基端基質(zhì)子信號峰d（δH4.39）和蔗糖中葡萄糖基的端基質(zhì)子信號峰a（δH5.35）分別作為乳糖和蔗糖的定量峰。

PULCON法定量使用的是外標校正，因此定量外標物的選擇不用考慮其溶解性、信號重疊、弛豫時間等因素。順丁烯二酸結(jié)構(gòu)簡單，實驗結(jié)果顯示，僅在δH6.34（D2O）處有一尖銳單峰（文中未列出），易于辨認，故選定為定量外標物。

2.2 實驗條件的選擇

2.2.1 采樣參數(shù) 為了避免造成樣品飽和，一般D1≥5T1［19］。反轉(zhuǎn)恢復(fù)法測得乳糖、蔗糖、順丁烯二酸定量峰的弛豫時間T1分別為1.51、1.12、6.52s。所以，樣品D1=10.0s，外標物D1=40.0s。脈沖的作用是為了建立x-y平面磁化強度，在傾倒角為90°時，信號最大，但即使是同一臺儀器，產(chǎn)生90°傾倒角所必須的脈沖寬度也會經(jīng)常變化。因此，在對每個樣品進行采樣前，都要重新測定本次檢測90°脈寬并記錄下具體數(shù)值，用于最后的濃度計算。NS較少會造成數(shù)據(jù)重現(xiàn)性差，較多會使數(shù)據(jù)重現(xiàn)性好，提高信噪比，但同時也會延長實驗時間。因此，NS一般取64次即可滿足一般分析的要求。采樣時外標物和樣品要使用相同的增益值（RG），以保證每個圖譜信號的增益比例相同［20］。

2.2.2 圖譜處理及樣品體積 定量圖譜處理時，為避免圖譜間積分差異，在傅立葉變換前，各圖譜要套用同一指數(shù)窗函數(shù)，變換點數(shù)也要相同。公式（3）是在線圈內(nèi)樣品有效體積上對公式（2）積分的結(jié)果，因此，在使用PULCON法定量時，NMR樣品管中樣品體積不能小于線圈測試的有效體積，但大于有效體積的部分不會影響濃度的測定。對于一般的常規(guī)探頭，使用5mm的核磁管，450μL樣品就能滿足檢測要求［14］。

2.3 方法學考察

2.3.5 加標回收率實驗 加標回收率實驗結(jié)果見表2，平均加標回收率為100.19%～103.21%，相對標準偏差在1.79%～3.57%之間。確認本方法回收率良好。

表2 乳粉中乳糖、蔗糖的加樣回收率（n=3）Table 2 The results of recoveries of lactose and sucrose（n=3）

2.4 實際樣品含量測定

采用上述方法對市售的3個品牌的嬰幼兒乳粉樣品進行測定，結(jié)果見表3。結(jié)果顯示，三個奶粉樣品測定結(jié)果與標簽中標注的糖含量（1號樣品55.1g/100g；2號49.5g/100g；3號樣品54.7g/100g）基本相符。實驗表明，本法樣品前處理操作簡單，選擇性好，無需標準品及內(nèi)標物，適用于同時測定和確證嬰幼兒乳粉中的乳糖、蔗糖。

表3 嬰幼兒乳粉樣品中乳糖、蔗糖測定結(jié)果Table 3 Contents of lactose and sucrose in infant formulamilk powder determined by thismethod

3 結(jié)論

本研究以已知濃度的順丁烯二酸為定量外標，建立了乳粉中乳糖、蔗糖含量的PULCON分析法，解決了傳統(tǒng)核磁定量法中內(nèi)標物對qHNMR使用的限制問題。方法學驗證結(jié)果表明，2種糖標準品的線性相關(guān)系數(shù)均大于0.999，平均加樣回收率為100.19%～103.21%，且精密度、穩(wěn)定性和加標回收率的RSD值均小于4%，說明該方法具有準確、穩(wěn)定、重復(fù)性好、加樣回收率高的優(yōu)點，可用于乳粉中乳糖、蔗糖的含量測定。

qHNMR法以結(jié)構(gòu)測定為基礎(chǔ)，因此，在對目標分析物檢測的同時，通過對樣品圖譜中其他信號峰的分析，還能夠?qū)崿F(xiàn)對樣品中非目標物的篩查，為嬰幼兒乳粉的質(zhì)量控制提供新的研究思路。本方法對樣品的前處理只需要溶解過濾，簡單快速，無需標準品做參比，適合大批量樣本的快速檢測。

［1］Holzgrabe U，Deubner R，Schollmayer C，et al.Quantitative NMR spectroscopy-applications in drug analysis［J］.Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis，2005，38（5）：806-812.

［2］張才煜，吳建敏，李憬，等.核磁共振法定量測定氫溴酸東莨菪堿的絕對含量［J］.藥物分析雜志，2012，32（2）：327-329.

［3］張秀麗，王聰，任素梅，等.緩釋膠囊中布洛芬含量的核磁共振波譜定量分析方法研究［J］.中國海洋藥物，2014，33（1）：11-16.

［4］Nicholson JK，Connelly J，Lindon JC，et al.Metabonomics：a platform for studying drug toxicity and gene function［J］.Nature Reviews Drug Discovery，2002，1（2）：153-161.

［5］楊亮，茹閣英，唐惠儒，等.核磁共振電信號內(nèi)標法在人體尿液定量分析中的應(yīng)用［J］.分析化學，2010，38（6）：789-794.

［6］Ratanapariyanuch K，SHEN JH，JIA Y H，et al.Rapid NMR method for the quantification of organic compounds in thin stillage［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2011，59（19）：10454-10460.

［7］閻政禮，楊明生，李添寶，等.蜂蜜中葡萄糖、果糖和蔗糖NMR定量分析研究［J］.食品科學，2009，30（14）：253-255.

［8］李愛平，李震宇，邢婕，等.基于核磁共振代謝組學技術(shù)的食醋化學成分研究［J］.食品科學，2013，34（12）：247-253.

［9］Hoult D I，Richards R E.The Signal-to NOISE ratio of the nuclear magnetic resonance experiment［J］.Journal of Magnetic Resonance，1976，24：71-85.

［10］Hoult D I.The principle of reciprocity in signal strength calculations-a mathematical Guide［J］.Concepts in Magnetic Resonance，2000，12（4）：173-187.

［11］Van D K.The NMR reciprocity theorem for arbitrary probe geometry［J］.Journal of Magnetic Resonance，2001，148：147-154.

［12］Barantin L，Lepape A，Akoka S.A new method for absolute quantitation MRS metabolites［J］.Magnetic Resonance in Medicine，1997，38：179-182.

［13］Akoka S，Barantin L，Trierweiler M.Concentration measurement by proton NMR using the ERETIC Method［J］. Analytical Chemistry，1999，71：2554-2557.

［14］WiderG，Dreier L.Measuring protein concentrations by NMR spectroscopy［J］.Journal of The Ame rican Chemical Society，2006，128（8）：2571-2576.

［15］Holzgrabe U. Quantitative NMR spectroscopy in pharmaceuticalapplications［J］. Progress in Nuclear Magnetic ResonanceSpectroscopy，2010，57（2）：229-240.

［16］中華人民共和國國家標準委員會.GB 5413.5-2010嬰幼兒食品和乳品中乳糖、蔗糖的測定［S］.

［17］鐘寧，侯彩云.高效毛細管電泳測定液態(tài)乳中乳糖［J］.中國乳品工業(yè)，2011，39（10）：44-47.

［18］Fanguy H，Kazuo F，Mie II，etal.Nondestructive observation of bovine milk by NMR spectroscopy：analysis of existing states of compounds and detection of new compounds［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2004，52（16）：4969-4974.

［19］毛希安.現(xiàn)代核磁共振實用技術(shù)及應(yīng)用［M］.北京：科學技術(shù)文獻出版社，2000：47.

［20］Braun D，Wuthrich K，Wider G.Dissection of heteronuclear NMR experiments for studies of magnetization transfer efficiencies［J］.Journal of Magnetic Resonance，2003，165：89-94.

Determination of lactose and sucrose in infant formula milk powder by PULCON1H-NMR method

JIANG Jie，LIWei，LU Yong，HE Tao，ZHAO Ya-song，SONG Li-ping
（Beijing Municipal Center for Food Safety Monitoring and Risk Assessment，Beijing 100041，China）

A proton nuclear magnetic resonance quantification called PULCON was established for determination of lactose and sucrose in infant formula milk powder.Using the known concentration of maleic acid as the external standard，the concentration of analyte in two NMR spectra could be correlated by the NMR principle of reciprocity.For the two analytes，the calibration curves established showed good linearity over the concentration range of 0.05～5.00（R2＞0.999），and the average recoveries（n=3）were 100.19%～103.21%with RSD of 1.79%～3.57%.The high universality，selectivity，non-standard and efficiency of the PULCON method demonstrated in this work suggested that this method could serve as a highly potential alternative for determination of lactose and sucrose in milk powder，compared with the current national food safety standard（GB 5413.5-2010）.

NMR；PULCON；infant formula milk powder；lac tose；sucrose

TS201.2

A

1002-0306（2015）08-0068-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.08.005

2014－06－17

姜潔（1972-），女，博士，高級工程師，研究方向：食品營養(yǎng)與安全。