雙抗夾心酶聯(lián)免疫吸附法檢測蕎麥過敏蛋白

張新瑀，崔曉東，楊 歡，葛 川，王轉(zhuǎn)花，*

（1.山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西太原030006；2.山西省科學(xué)技術(shù)情報研究所，山西太原030001）

雙抗夾心酶聯(lián)免疫吸附法檢測蕎麥過敏蛋白

張新瑀1，崔曉東1，楊 歡1，葛 川2，王轉(zhuǎn)花1，*

（1.山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西太原030006；2.山西省科學(xué)技術(shù)情報研究所，山西太原030001）

提取制備蕎麥過敏原蛋白（TBt）并免疫動物，分別制備鼠多克隆抗體和兔多克隆抗體，建立了雙抗夾心酶聯(lián)免疫吸附檢測法（ELISA）用于檢測食品中的蕎麥過敏原。SDS-PAGE結(jié)果表明，純化的TBt純度達(dá)到98%以上，鼠抗血清效價為1∶6400。建立的雙抗夾心ELISA法對蕎麥過敏原蛋白的最低檢測限為0.16μg/mL，線性范圍為0.16～16μg/mL。并采用建立的雙抗夾心ELISA法對市場出售的15種食品中蕎麥過敏成分進(jìn)行了檢測。結(jié)果顯示，該方法對絕大多數(shù)食品中的蕎麥過敏原都有很好的特異性及靈敏性，說明該法可用于食物過敏原的診斷及食品中微量蕎麥過敏成分的檢測。

蕎麥，過敏蛋白，多克隆抗體，酶聯(lián)免疫吸附法

蕎麥屬蓼科雙子葉植物，有甜蕎麥（Fagopyrum esculentum Moench）和苦蕎麥［Fagopyrum tataricum（L.）Gaertn］兩個栽培種，在我國西南云貴高原和北方長城沿線地區(qū)被廣泛種植。蕎麥種子中含有較高的營養(yǎng)成分和藥用活性物質(zhì)，其中富含的黃酮類化合物能夠有效地預(yù)防糖尿病、高血壓和冠心病等多種慢性疾病［1］，已經(jīng)成為“三高”患者的最佳食物選擇。但是有報道稱蕎麥?zhǔn)称房蓪?dǎo)致特定人群發(fā)生過敏反應(yīng)，發(fā)生哮喘和紅斑，嚴(yán)重時甚至引發(fā)休克和死亡［2-3］。日本已把蕎麥列為五大食物過敏原之一，其病理機制為IgE介導(dǎo)的Ⅰ型速發(fā)型過敏反應(yīng)［4］。近年來，隨著蕎麥功能食品的問世，有關(guān)蕎麥?zhǔn)称窛撛诘闹旅魡栴}也引起了國內(nèi)外學(xué)者的普遍關(guān)注。由過敏引起的臨床癥狀如過敏性哮喘，痙攣等被世界衛(wèi)生組織定為二十一世紀(jì)重點防治三大疾病之一，且發(fā)病率逐年增高［5］。有關(guān)食物過敏的報道時有發(fā)生，尋找蕎麥含有的潛在過敏原，研究其結(jié)構(gòu)及致敏機理，并開發(fā)檢測相關(guān)過敏原的試劑，對于控制因攝入蕎麥?zhǔn)称范鸬倪^敏，提高人類健康具有重要意義。

酶 聯(lián) 免疫 吸 附 測 定 法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）是1971年由荷蘭學(xué)者Van Weerman和瑞典學(xué)者Engvail等建立的以免疫學(xué)反應(yīng)為基礎(chǔ)，利用抗原、抗體的特異性反應(yīng)與酶對底物的高效催化兩者相結(jié)合的一種敏感性很高的實驗技術(shù)［6-7］。該技術(shù)可以檢測到大分子抗原以及特異性抗體等物質(zhì)，具有快速、靈敏、特異、簡便，以及載體可標(biāo)準(zhǔn)化等優(yōu)點［8-9］。雙抗體夾心ELISA（Sandwich ELISA）法在原有實驗技術(shù)的基礎(chǔ)上經(jīng)過改良，使放大倍數(shù)和檢測靈敏度得到了較大提高，避免了標(biāo)記特異性抗體。

本課題組前期已從蕎麥中提取分離并克隆表達(dá)獲得了分子量約為24、35、58ku的三種過敏型蛋白，對其結(jié)構(gòu)特征、表位及免疫活性進(jìn)行了較為系統(tǒng)的研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)三者均是蕎麥中的主要過敏原［10-11］，都可以與過敏患者血清特異性IgE結(jié)合，根據(jù)人群的耐受性不同，表現(xiàn)出不同的過敏癥狀。進(jìn)一步通過免疫動物制備了蕎麥過敏蛋白的兔多克隆抗體，兔抗血清效價為1∶256000［12-13］，為深入研究蕎麥過敏原的作用機理及對蕎麥?zhǔn)称分羞^敏成分的檢測奠定了良好的基礎(chǔ)。本研究在前期研究基礎(chǔ)上，采用鼠多克隆抗體和兔多克隆抗體，建立了雙抗體夾心ELISA方法，并對其中關(guān)鍵因素進(jìn)行了摸索，同時應(yīng)用建立的方法對多種食品中的致敏成分進(jìn)行了檢測。本文旨在優(yōu)化和建立檢測食品中蕎麥過敏蛋白的最佳方法，為開發(fā)過敏原檢測試劑盒提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蕎麥 品種為湖南一號，系2013年收獲的種子；BALB/c小鼠 購自山西醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)實驗動物中心；特異性過敏原TBt多克隆抗體（兔抗TBt） 本實驗室自制；辣根過氧化物酶（HRP） 購自Southernbiotech公司；底物-鄰苯二胺、弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑 均購自Sigma公司；其余試劑 均為國產(chǎn)分析純；抗原包被液 50mmol/L碳酸鹽緩沖液，pH 9.6；抗體稀釋液 0.01mmol/L PBST，NaCl 8g，KH2PO40.2g，Na2HPO41.15g，Tween-20 0.5m l，蒸餾水加至1L，pH 7.4；底物-鄰苯二胺溶液 臨用前配制：0.1mol/L檸檬酸，0.2mol/L Na2HPO4，12.5m L蒸餾水，10mg鄰苯二胺，臨用前加30%H2O2（m/m）40μL。

Resource Q、Superdex G-75層析柱和AKTA Explorer蛋白質(zhì)純化系統(tǒng) 美國GE HEALTHCARE公司；ELx800酶標(biāo)儀 美國BIO-RAD公司；-80℃低溫冰箱 丹麥HETO BIOTECH公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 蕎麥過敏蛋白的分離和純化 參照實驗室之前建立的制備過敏原蛋白的方法［11］，脫脂蕎麥粉經(jīng)緩沖液抽提、鹽析、離子交換層析、凝膠層析等分離純化步驟，獲得電泳純的過敏原蛋白TBt，用于多克隆抗體的制備。

1.2.2 多克隆抗體（鼠抗TBt）的制備及純化 首先使采購的小鼠在新環(huán)境中穩(wěn)定（12d左右），在尾部進(jìn)行取血，取血量約50μL，-40℃保存，作為陰性血清對照。初次免疫，將弗氏完全佐劑與TBt抗原（100μg/m L）按1∶1（v/v）比例混合，采用皮下多點注射，以刺激機體發(fā)生免疫反應(yīng)。免疫10d后取血，-40℃保存。加強免疫，后續(xù)用弗氏不完全佐劑與TBt抗原（100μg/m L）以1∶1的比例充分乳化后，采用腹腔注射進(jìn)行免疫，每周免疫一次，共免疫三次，免疫10d后進(jìn)行取血，-40℃保存。用間接ELISA法測定血清效價值。效價值達(dá)到2000以上，并有明顯上升的趨勢，再加強免疫一次，加強免疫后的第7d，摘眼球取血約500μL，將采集的新鮮血液37℃靜置60m in，凝固后4℃冰箱過夜，吸取上清，3000r/m in離心10m in。用辛酸-硫酸銨沉淀法純化鼠多克隆抗體，SDS-PAGE法鑒定純化后的抗體純度，用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行分析?？贵w于-80℃保存。

1.2.3 抗體與HRP偶聯(lián) 稱取適量HRP酶，溶于蒸餾水中，加入新鮮配制的過碘酸鈉溶液，混勻，4℃下放置30m in；加入乙二醇溶液，室溫放置30m in；加入適量純化鼠多克隆抗體，混勻，調(diào)pH至9.0，4℃下過夜；加入硼氫化鈉，混勻，置4℃下2h；在酶標(biāo)抗體混合液中加入等體積飽和硫酸銨溶液，4℃下放置30m in；離心后，用pH7.4的磷酸鹽緩沖液透析過夜［8］。

1.2.4 鼠多克隆抗體效價的測定 用抗原包被液稀釋TBt至100μg/m L，包被96孔酶標(biāo)板，每孔加入100μL，4℃過夜，棄去孔內(nèi)液體，洗滌液洗3次，每次10min。每孔加入1%脫脂奶粉100μL，37℃封閉1h，洗滌液洗3次，每次10m in。加入不同稀釋度（1∶100、1∶200、1∶400、1∶800、1∶1600、1∶3200、1∶6400、1∶12800、1∶25600、1∶51200）的HRP-多克隆抗體，每孔加入100μL，37℃結(jié)合1h，洗滌液洗3次，每次10m in。加入100μL底物鄰苯二胺溶液，暗處顯色20m in，每孔加入5μL的稀硫酸（1mol/L），終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀上測490nm處的光密度值，每個稀釋度設(shè)定3個重復(fù)實驗孔，計算光密度值A(chǔ)490平均值，同時設(shè)空白對照、陰性對照和陽性對照孔。按照以下公式計算P/N值：

P/N=（測試孔A490－空白孔A490）/（陰性孔A490－空白孔A490）

1.2.5 雙抗體夾心ELISA法 包被：將兔抗TBt多克隆抗體用包被液稀釋為1∶1000，每孔加入100μL，包被96孔酶標(biāo)板，4℃過夜，棄去孔內(nèi)液體，洗滌液洗3次，每次10m in。

封閉：每孔加入1%脫脂奶粉100μL，37℃封閉1h，洗滌液洗3次，每次10m in。

加入抗原：用抗體稀釋液稀釋TBt為不同濃度（100、50、25、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.16、0.08μg/m L），每孔分別加入100μL，37℃結(jié)合1h，洗滌液洗3次，每次10m in。

加入酶標(biāo)二抗：HRP-鼠抗多克隆抗體用抗體稀釋液稀釋1∶1000，每孔加入100μL，37℃結(jié)合1h，洗滌液洗3次，每次10m in。

顯色：加入100μL底物鄰苯二胺溶液，暗處顯色20m in，每孔加入50μL的稀硫酸（1mol/L），終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀上測490nm處的光密度值。

以上每組數(shù)據(jù)設(shè)定3個重復(fù)實驗孔，計算光密度A490平均值，同時設(shè)空白對照、陰性對照和陽性對照孔。

1.2.6 最低檢測濃度的測定 通過雙抗體夾心ELISA法檢測不同稀釋度的TBt溶液，以待測孔的A490值與陰性血清A490值之比大于等于2.1為陽性（P/N≥2.1），以結(jié)果呈現(xiàn)陽性的最高稀釋倍數(shù)為終點檢測濃度。每組數(shù)據(jù)設(shè)定3個重復(fù)實驗孔，計算光密度A490平均值，根據(jù)測量得到的光密度值平均值，繪制光密度值與TBt稀釋度曲線，得出最低檢測濃度。

1.2.7 食品中蕎麥過敏成分的特異性檢測 取市售食品15種（8種標(biāo)示含蕎麥成分，7種標(biāo)示未含蕎麥成分），每種取3g（液體取3m L），研磨成粉末，用pH為7.4的30mmol/L PBS緩沖液20m L提取總蛋白2h，離心取上清，利用雙抗體夾心ELISA法，測定食品中蕎麥過敏原成分。以待測孔的A490值與陰性A490值之比大于等于2.1為陽性（P/N≥2.1），以小麥面粉提取物為陰性對照。同時進(jìn)行加標(biāo)實驗，在每種食品的PBS提取緩沖液中添加5μg純化的TBt，來檢測基質(zhì)對蕎麥過敏成分測定的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 過敏蛋白TBt的SDS-PAGE分析

蕎麥過敏原蛋白經(jīng)提取純化等步驟后，SDSPAGE（圖1）顯示所提取的蛋白純度較高，達(dá)到了98%以上的純度。其非還原性樣品（泳道1）在58ku處有條帶，而還原性樣品（泳道2）在24、35ku處分別有兩個條帶，說明在還原劑的存在下58ku蛋白的二硫鍵斷開，出現(xiàn)兩個大小不等的亞基。純化的蛋白可用于下一步多克隆抗體的制備。

圖1 蕎麥過敏蛋白的SDS-PAGE分析Fig.1 SDS-PAGE of allergenic protein from buckwheat

2.2 TBt多克隆抗體效價的測定

如圖2所示，以免疫前小鼠血清為陰性對照，免疫后小鼠血清為陽性組，A490為縱坐標(biāo)，血清稀釋度為橫坐標(biāo)作圖。圖2中隨著抗體稀釋倍數(shù)的增加相應(yīng)的光密度吸收值明顯降低，效價逐漸上升，以免疫前血清作為陰性對照，分別減去空白對照，計算P/N值大于2.1時的多抗血清的滴度約為6400，TBt多克隆抗體的效價值為1∶6400。

圖2 TBt多克隆抗體效價曲線Fig.2 The titer curve of TBt polyclonal antibody

2.3 雙抗體夾心ELISA法測定最低檢測TBt濃度

如圖3，隨著TBt的稀釋度不斷下降，A490值下降，兩者成正相關(guān)，計算P/N值。當(dāng)P/N值大于等于2.1時，蕎麥過敏蛋白TBt的最低濃度為0.16μg/m L。曲線顯示在0.16～16μg/m L區(qū)間內(nèi)，其線性方程為y=0.0285x+ 0.0482，R2=0.9945。即當(dāng)TBt濃度在0.16～16μg/m L的濃度范圍時，檢測值與TBt濃度呈正相關(guān)。

圖3 雙抗體夾心ELISA法檢測蕎麥過敏蛋白Fig.3 Double-Antibody Sandwich ELISA method for detection of buckwheat allergenic protein

2.4 食品中蕎麥過敏原成分的檢測

提取15種食品中的總蛋白，采用雙抗體夾心ELISA法檢測其中是否含有蕎麥過敏蛋白TBt，重復(fù)測定3次。檢測結(jié)果如表1，在所選15種食品中，6種標(biāo)記以蕎麥為原料的食品呈現(xiàn)陽性結(jié)果，7種沒有標(biāo)記含有蕎麥的食品呈現(xiàn)陰性結(jié)果，2種標(biāo)記以蕎麥為原料的食品呈現(xiàn)陰性結(jié)果，未檢測出含有過敏蛋白。陽性食品P/N值范圍在2.2～2.7之間，陰性食品P/N值則在1.1～1.8之間，在所選的產(chǎn)品中基本可檢測出微量的蕎麥過敏成分。由于各種食品未明確標(biāo)示出所添加蕎麥面粉的含量，另外也可能由于食品加工使過敏蛋白失活等原因，使個別食品未能檢測出過敏成分。加標(biāo)實驗表明，除了苦蕎保健醋，其他食品的基質(zhì)對測定結(jié)果沒有影響?？嗍w保健醋的基質(zhì)對測定結(jié)果有一定的影響，可能是醋的pH較低，影響TBt與相應(yīng)抗體的結(jié)合。

檢測結(jié)果說明采用本實驗建立的雙抗體夾心ELISA法對檢測蕎麥過敏蛋白具有較好的實用性。

表1 雙抗夾心ELISA法檢測食品中蕎麥致敏成分Table 1 Sandwich ELISA method for detection of buckwheat allergenic protein in foods

3 結(jié)論與討論

本實驗從蕎麥中提取、純化得到TBt過敏蛋白，利用此過敏蛋白制備多克隆抗體，并建立雙抗體夾心ELISA法，用來檢測食品中是否含有該過敏蛋白成分。由于各種食品加工條件不同，往往經(jīng)過不斷的加熱，酸堿處理等，食物中的過敏蛋白會發(fā)生變化，可能含量也會有所減少，但運用雙抗體夾心ELISA法可以極大的提高檢測的靈敏度，檢測蕎麥過敏蛋白成分的靈敏度達(dá)到0.16μg/m L。

此外對現(xiàn)售食品中，已經(jīng)標(biāo)記為含有蕎麥成分和未標(biāo)記含蕎麥成分的食品進(jìn)行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有6種標(biāo)記有蕎麥成分的食品檢測結(jié)果呈陽性，2種食品的原料中標(biāo)明有蕎麥成分，但是結(jié)果檢測為陰性。其中苦蕎保健醋檢測呈陰性，P/N值僅為1.2，這可能是由于保健醋在制作過程對原料要進(jìn)行粉碎、蒸煮、發(fā)酵、陳醋、滅菌等過程所致，這些發(fā)酵過程使得大分子蛋白降解為多肽，氨基酸等小分子物質(zhì)，使得檢測結(jié)果呈陰性。同時加標(biāo)實驗也表明，苦蕎保健醋的基質(zhì)（pH較低）對檢測結(jié)果影響很大。這兩者可能都是造成測定結(jié)果呈陰性的原因。蕎麥味雜糧餅干食品中的主要材料是小麥面粉，食品說明中對蕎麥的加入量未詳細(xì)說明，加標(biāo)實驗表明基質(zhì)對其測定無影響，則可以初步推斷其中蕎麥成分較少是其過敏蛋白檢測呈陰性的原因。市場上銷售的碗托分為兩種，一種為適量蕎麥為原料加工而成，另一種以小麥面粉為原料加工而成，本實驗中購買的平遙碗托，檢測結(jié)果為陰性，可以判斷其原料成分為小麥面粉。由此說明本方法不僅可檢測到添加有蕎麥成分的相應(yīng)過敏原，而且對未添加或未知成分的食品中的過敏原也可做出相應(yīng)的判斷。本方法可用于食品中蕎麥過敏原的檢測。

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Double-antibody sandwich enzyme linked immunosorbent assay for the detection of buckwheat allergen protein

ZHANG Xin-yu1，CUIXiao-dong1，YANG Huan1，GE Chuan2，WANG Zhuan-hua1，*
（1.School of Life Science，Shanxi University，Taiyuan 030006，China；2.Shanxi Science and Technology Information Research Institute，Taiyuan 030001，China）

In the p resent study，buckwheat allergenic p rotein（TBt）from tartary buckwheat seeds was extracted and purified，and specific antibodies against TBtwere produced.A double-antibody sandwich enzyme linked immunosorbent assay（ELISA）based on rabbit polyclonal antibody and mouse polyclonal antibody was established.This method could be used for the detection of buckwheat allergenic protein in food.SDS-PAGE experiments showed that the purified TBt reached a purity of more than 98%.The serum antibody titers from mouse was 1∶6400.The sandwich ELISA could detect buckwheat allergenic protein at levels as low as 0.16μg/m L，and the linear range was at 0.16～16μg/m L.Using the ELISA to detect 15 kinds of food commercially available in the market，it was found that the newly established ELISA had specificity and sensitivity toward different foods expect vinegar.It provided a method for the diagnosis of food allergenic and the detection of trace allergens in food.

buckwheat；allergen；polyclonal antibody；enzyme linked immunosorbent assay

TS207.3

A

1002-0306（2015）08-0053-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.08.002

2014－06－17

張新瑀（1990-），男，碩士研究生，研究方向：食品科學(xué)。

*通訊作者：王轉(zhuǎn)花（1956-），女，教授，研究方向：生物活性物質(zhì)與蛋白質(zhì)工程。

國家自然基金項目（31171659）；青年科學(xué)基金項目（31300653）；山西省科技平臺項目（2014091028）資助。