SRB法檢測(cè)沒食子酸乙酯對(duì)PC12細(xì)胞的毒性作用

黃金蘭等

【摘 要】目的：研究沒食子酸乙酯對(duì)PC12細(xì)胞的毒性作用。方法：SRB法體外檢測(cè)沒食子酸乙酯對(duì)PC12細(xì)胞的毒性。結(jié)果：不同濃度的沒食子酸乙酯對(duì)PC12細(xì)胞的增值均有不同程度的抑制作用，且呈劑量依賴性。結(jié)論：1.25μg/mL～5μg/mL濃度范圍沒食子酸乙酯對(duì)PC12細(xì)胞的毒害最小。

【關(guān)鍵詞】沒食子酸乙酯；PC12；毒性

在阿爾茨海默?。ˋD）患者腦組織中普遍存在著神經(jīng)氧化損傷，AD病人腦中表現(xiàn)出異常高的氧化修飾蛋白、脂類和DNA水平，保護(hù)神經(jīng)元免受氧化脅迫并在尋找合適的抗氧化劑，是防治AD的有效手段。沒食子酸乙酯是一種用于油脂的抗氧化劑、食品添加劑及某些藥品的中間體，據(jù)報(bào)道，沒食子酸乙酯具有對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷具有一定保護(hù)作用，但同時(shí)在一定濃度范圍內(nèi)對(duì)神經(jīng)細(xì)胞SH-SY5Y也有一定的毒性[1]，本研究擬以沒食子酸乙酯為研究對(duì)象，體外評(píng)價(jià)其對(duì)小鼠腎上腺嗜鉻瘤細(xì)胞株P(guān)C12的毒性作用。

1 材料

1.1 藥物、細(xì)胞株與主要試劑

沒食子酸乙酯（購自阿拉丁，E119029）；小鼠腎上腺嗜鉻瘤細(xì)胞株P(guān)C12（上海細(xì)胞生物研究所細(xì)胞庫）；Sulforhodamine B（Sigma，批號(hào)230162），胚胎牛血清（FBS，Thermo，批號(hào)SV30087.02）；DMEM（Life，12800-017）。

1.2 主要儀器

CO2培養(yǎng)箱（Thermo，型號(hào)：3111），倒置顯微鏡（Olympus，型號(hào)：IX53），酶標(biāo)儀（Bio Tek，型號(hào)：Elx808）

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

PC12細(xì)胞置37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中，用含10% FBS的高糖DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)。倒置顯微鏡觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，0.25%胰蛋白酶消化傳代，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

2.2 SRB法檢測(cè)沒食子酸乙酯對(duì)PC12細(xì)胞的毒性

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期PC12細(xì)胞，胰酶消化，調(diào)整濃度為10000個(gè)/mL的單細(xì)胞懸液并接種于96孔培養(yǎng)板，100μL/孔，24h后加入含不同濃度沒食子酸乙酯培養(yǎng)液，對(duì)照組加入等體積溶劑培養(yǎng)液，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔（重復(fù)3次），置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h，終止時(shí)棄培養(yǎng)液，加入100μL預(yù)冷的10%TCA固定，4℃冰箱置1h。棄固定液，清水洗3次，甩干干燥，每孔加入100μL0.4%SRB室溫作用30min，用1%冰醋酸洗去游離染料。甩干干燥，每孔加入100μL10mM Tris溶解，放搖床直至染料全部溶解。最后用酶標(biāo)儀在564nm波長(zhǎng)處測(cè)定OD值。細(xì)胞抑制率%=（1-實(shí)驗(yàn)組平均OD/對(duì)照組平均OD）×100%

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS11.5進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。計(jì)量資料以x±s表示。組間比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)。

3 結(jié)果

由表1結(jié)果顯示，不同濃度的沒食子酸乙酯對(duì)PC12細(xì)胞的增值均有不同程度的抑制作用，并隨濃度增加，抑制率增大即細(xì)胞存活個(gè)數(shù)越少（圖1），其中1.25μg/mL～5μg/mL濃度范圍對(duì)PC12細(xì)胞的毒害最小。

4 討論

磺基羅丹明B（sulforhodamine B，SRB）是一種蛋白質(zhì)結(jié)合染料，可與生物大分于中的堿性氨基酸結(jié)合，其顏色變化與活細(xì)胞蛋白成正比。SRB法不僅具備MTT法操作簡(jiǎn)便、敏感的特點(diǎn)，而且測(cè)量結(jié)果不受時(shí)間影響，特別適用于大規(guī)模藥物篩選及毒性評(píng)價(jià)。

PC12細(xì)胞是大鼠腎上腺髓質(zhì)嗜鉻瘤分化細(xì)胞株，屬神經(jīng)嵴源性，具神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞的一般特征，且具可傳代特點(diǎn)，能夠代替原代培養(yǎng)的神經(jīng)細(xì)胞[2]，廣泛應(yīng)用于神經(jīng)生理、藥理學(xué)研究。

沒食子酸乙酯作為一種抗氧化劑，神經(jīng)細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷具有一定保護(hù)作用，但其有一定細(xì)胞毒性，本研究采用SRB法進(jìn)一步評(píng)價(jià)其對(duì)PC12細(xì)胞的毒性作用。結(jié)果顯示不同濃度的沒食子酸乙酯對(duì)PC12細(xì)胞的增值均有不同程度的抑制作用，且呈劑量依賴性，其中1.25μg/mL～5μg/mL濃度范圍對(duì)PC12細(xì)胞的毒害最小。

【參考文獻(xiàn)】

[1]田偉，畢玉婷，周啟龍，等.沒食子酸酯對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的抗氧化保護(hù)作用研究[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2013，25：1423-1427.

[2]黃文超，李云峰，羅質(zhì)璞.單胺遞質(zhì)對(duì)皮質(zhì)酮所致的PC12細(xì)胞損傷的保護(hù)作用[J].中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2003，19（1）：103-106.

[責(zé)任編輯：湯靜]