文山生姜葉多糖純化工藝研究

王紅萍，郭慶森

（文山學(xué)院 化學(xué)與工程學(xué)院，云南 文山 663099）

文山生姜葉多糖純化工藝研究

王紅萍，郭慶森

（文山學(xué)院 化學(xué)與工程學(xué)院，云南 文山 663099）

為了純化文山生姜葉中的多糖，采用了熱水粗提取生姜葉多糖，去除蛋白質(zhì)、色素等操作之后，用大孔樹(shù)脂和聚酰胺來(lái)吸附純化多糖，做單因素以及正交試驗(yàn)。通過(guò)對(duì)溶劑濃度、樣品上樣量、樹(shù)脂種類、樹(shù)脂的量等單因素進(jìn)行研究，確定了最佳純化條件為：用sevage法除蛋白、用活性炭脫色、醇沉濃度95%，選擇AB-8樹(shù)脂，在最佳工藝條件下多糖的純化量為4.5 %。

生姜葉；多糖；大孔樹(shù)脂；純化工藝

文山盛產(chǎn)生姜，但是只食用生姜的根莖部，生姜采收時(shí)，大量的生姜葉子廢棄在地里，沒(méi)有得到充分的利用。據(jù)有關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，生姜葉中糖含量為鮮重每百克中含有56.68 g［1］，本實(shí)驗(yàn)對(duì)文山生姜葉多糖進(jìn)行提取和純化，可為生姜葉的開(kāi)發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料

文山小黃姜生姜葉，采自云南硯山縣農(nóng)戶家中，經(jīng)文山學(xué)院環(huán)境與資源學(xué)院陳云老師鑒定，為百合綱，姜目，姜科，姜族中的小黃姜（Globba racemosa Smith）姜葉。

1.2儀器與試劑

儀器：分光光度計(jì)（V-1100型，上海美譜達(dá)儀器有限公司）、離心機(jī)（800型，江蘇大地自動(dòng)儀器廠）、抽濾機(jī)（2x-1A型，沈陽(yáng)微電機(jī)廠）、真空干燥機(jī)（DZF-6020，上海喬躍電子有限公司）、比旋光儀（WXG-4型，上海長(zhǎng)方光學(xué)儀器廠）、層析管、200 mL容量瓶。

試劑：95 %乙醇、60 %乙醇、葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品、硫酸蒽酮、樹(shù)脂AB-8和60目的聚酰胺。

1.3文山生姜葉多糖的粗提取

取10 g的生姜葉碎片過(guò)一個(gè)多孔篩，用80 ℃蒸餾水提取2次，第1次加8倍量水，第2次加7倍量水，加3.5倍量95 %乙醇沉淀，沉淀抽濾離心后，用50 ℃真空干燥［2］，得到生姜葉粗多糖1.0141 g。

1.4標(biāo)準(zhǔn)曲線制備

精密稱取經(jīng)105 ℃干燥恒重的葡萄糖100 mg，置100 mL量瓶中，加水適量使溶解，稀釋至刻度，搖勻，精密吸取10 mL，置100 mL量瓶中，加水至刻度，搖勻，備用，此標(biāo)準(zhǔn)溶液l mL含葡萄糖0.1 mg。分別準(zhǔn)確吸取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL（相當(dāng)于葡萄糖0 mg、0.02 mg、0.04 mg、0.06 mg、0.08 mg、0.1 mg），置于25 mL比色管中，準(zhǔn)確補(bǔ)充水至2.0 mL，加入50 g/L苯酚溶液1.0 mL，混勻，小心加入濃硫酸10.0 mL搖勻后沸水浴10 min，取出至室溫后用分光光度計(jì)在490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸收度［3］，以吸光度值為Y，葡萄糖濃度為X，得回歸方程［4］。

1.5生姜葉粗多糖除蛋白

由于蛋白質(zhì)不溶于水且在氯仿中變性，將多糖水溶液、氯仿、戊醇（或正丁醇）之比調(diào)為25∶4∶1，混合后搖動(dòng)20～30 min，生成凝膠再離心，除去水層和交界處的變性蛋白質(zhì)，上清液為去蛋白的多糖溶液［5-9］。

脫蛋白質(zhì)率= （C0- C1）/C0×100 %

式中：C0為脫色前蛋白質(zhì)的質(zhì)量濃度；C1為脫色后蛋白質(zhì)的質(zhì)量濃度［10］。

1.6生姜葉粗多糖除色素

活性炭屬非極性吸附劑，有較強(qiáng)的吸附能力，特別適合于水溶性物質(zhì)的分離。它的來(lái)源充足，價(jià)格便宜，上柱量大，適用于大量制備性分離。目前用于色譜分離的活性炭主要為粉末狀活性炭［11］。

脫色率= （Α0- Α1） /Α1×100 %

式中：Α0為脫色前吸光度；Α1為脫色后吸光度。

用蒽酮-硫酸法測(cè)定多糖并計(jì)算保留率，采用葡萄糖作對(duì)照，線性回歸方程為：

?。ㄎ舛龋?1.8262C-0.0010（R2=0.9992）

式中：C為以葡萄糖計(jì)的多糖質(zhì)量濃度。

保留率（多糖）=M2/M1×100 %

式中：M1為脫色前多糖的質(zhì)量，M2為脫色后多糖的質(zhì)量［10，12］。

1.7樹(shù)脂的預(yù)處理

1.7.1大孔樹(shù)脂AB-8預(yù)處理

先使用蒸餾水沖洗AB-8到無(wú)泡沫后用無(wú)水乙醇浸泡24 h，并用無(wú)水乙醇沖洗AB-8到無(wú)白色渾濁，再用蒸餾水洗到無(wú)醇味。分別用酸（5 % HCl）和堿（2% NaOH）沖洗，用溶液沖洗AB-8，使洗出液為酸性和堿性后用5 % HCl和堿2 % NaOH浸泡4 h，再用蒸餾水洗到中性備用［12-13］。

1.7.2聚酰胺樹(shù)脂預(yù)處理

將60目的聚酰胺放在95 %乙醇中煮沸0.5 h，取出離心甩干，換上新乙醇再煮，再甩干，重復(fù)幾次可達(dá)效果。也可用沸騰乙醇回流，但只要流動(dòng)相不含乙醇，這步處理就可省略。

1.8大孔樹(shù)脂和聚酰胺樹(shù)脂的吸附率以及解析率

1.8.1樹(shù)脂AB-8和聚酰胺對(duì)生姜葉多糖的吸附率

稱取經(jīng)上述處理過(guò)的AB-8和聚酰胺1.00 g放入100 mL錐形瓶中后加入30 mL生姜葉多糖粗提液振蕩，每間隔1 h取樣測(cè)定多糖量并計(jì)算其吸附量和吸附率。

吸附量（mg/g）=｛（C0-C1）×V ｝/M

吸附率（%）= （C0-C1）/C0×100%

式中：C0為吸附前多糖濃度；C1為吸附后多糖濃度（mg/mL）；V為液體體積（mL）；M為濕樹(shù)脂重（g）［12，14］。

1.8.2樹(shù)脂AB-8和聚酰胺對(duì)生姜葉多糖的解析率

將充分吸附后的AB-8和聚酰胺過(guò)濾，用蒸餾水沖洗濾干放到錐形瓶中，加入30 mL 60%乙醇塞口后振蕩，每間隔1 h取樣，測(cè)定多糖的含量計(jì)算解析率。

解析率（%）= m0/（m-m1-m2）×100%

式中：m0為解析液多糖質(zhì)量（mg）；m為上柱液多糖質(zhì)量（mg）；m1為漏出液多糖質(zhì)量（mg）；m2為水洗液多糖質(zhì)量（mg）［12］。

1.9單因素及正交實(shí)驗(yàn)

大孔吸附樹(shù)脂法純化姜葉多糖的主要影響因素為上樣量，稀釋倍數(shù)，和濕樹(shù)脂量，現(xiàn)以吸光度為指標(biāo)，安排單因素實(shí)驗(yàn)。以姜葉多糖純度為指標(biāo)，安排正交實(shí)驗(yàn)，各因素水平見(jiàn)表1。

表1　因素水平表

1.10生姜葉多糖的純化檢驗(yàn)

在純化后的生姜多糖水溶液中加入乙醇至其濃度為10%左右后離心，得沉淀1。取上清液再加入乙醇使其濃度為20%～25%離心，得到沉淀2，比較沉淀1、2的比旋度。若比旋度相同，則此多糖是純品［15-16］。

2　結(jié)果與討論

2.1文山生姜葉多糖研究結(jié)果與分析

2.1.1標(biāo)準(zhǔn)曲線

根據(jù)1.4方法得出的不同濃度下的不同吸光度值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。圖1是根據(jù)在490 nm處不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液的吸光度作標(biāo)準(zhǔn)曲線：

圖1　標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

2.1.2各除雜操作實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析比較

根據(jù)1.5、1.6的方法得到表2數(shù)據(jù)。

表2　兩種樹(shù)脂效果比較

2.2AB-8和聚酰胺的吸附、解析率研究結(jié)果分析

圖2　樹(shù)脂吸附量與時(shí)間關(guān)系

圖3　樹(shù)脂解析率與時(shí)間關(guān)系圖

圖2表明，吸附在前6 h內(nèi)，AB-8和聚酰胺能夠快速吸附姜葉多糖，其后速率放緩，在9 h左右吸附量達(dá)到飽和和吸附平衡。AB-8和聚酰胺的靜態(tài)吸附量是：AB-8大于酰胺。由圖2知AB-8靜態(tài)飽和吸附量為28.3 mg/g，說(shuō)明AB-8對(duì)姜葉多糖的吸附具有選擇性，吸附能力與樹(shù)脂類型有關(guān)。

圖3表明，60%乙醇溶液對(duì)AB-8和聚酰胺具有較好的解析能力， 4 h內(nèi)就基本達(dá)到解析平衡。由圖3可知AB-8最大解析率可達(dá)96.70%。

綜上可知：AB-8對(duì)生姜葉多糖有較強(qiáng)的吸附和解析能力，所以用AB-8純化生姜葉多糖。

2.3單因素及正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

2.3.1單因素結(jié)果分析

單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3～表4：

表3　樣品上樣量與吸光度

表4　稀釋倍數(shù)與吸光度

表5　濕樹(shù)脂量與吸光度

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：樣品上樣量與吸附量成正比關(guān)系，稀釋倍數(shù)小一些更好。吸附量多少在于多糖含量的多少，樹(shù)脂量要根據(jù)上樣量多少適度增減。

2.3.2正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

現(xiàn)以姜葉多糖純度為指標(biāo)，安排正交實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表6。

表6　正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由表6可見(jiàn)，3個(gè)因素極差表現(xiàn)為：B＞A＞C，對(duì)生姜葉多糖所得率影響最大的因素是稀釋倍數(shù)，其次是樣品上樣，再次是樹(shù)脂量。生姜葉多糖的最優(yōu)工藝條件為A2B2C2，經(jīng)驗(yàn)證試驗(yàn)測(cè)定，在此最佳工藝純化條件下生姜葉多糖含量最高可達(dá)4.5 % 。

正交實(shí)驗(yàn)中，A2B2C2條件下和正交中A2B2C3條件下的提取率一樣的原因是AB-8已經(jīng)完全吸附了多糖成分，所以才出現(xiàn)提取率相等的結(jié)果。

3　結(jié)論

通過(guò)對(duì)文山小黃姜姜葉中多糖的純化研究，得出如下結(jié)論：

1）通過(guò)單因素、正交試驗(yàn)研究，確定了最佳純化條件為：用sevage法除蛋白、用活性炭脫色、醇沉濃度95%，樹(shù)脂選擇為AB-8樹(shù)脂，在最佳工藝條件下多糖的純化量為4.5%。

2）AB-8對(duì)生姜葉多糖有較強(qiáng)的吸附和解析能力，所以用AB-8純化生姜葉多糖。

3） 三個(gè)因素極差表現(xiàn)為：B＞A＞C，對(duì)生姜葉多糖所得率影響最大的因素是稀釋倍數(shù)，其次是樣品上樣，再次是樹(shù)脂量。生姜葉多糖的最優(yōu)工藝條件為A2B2C2，即在樣品上樣量為30 mL、稀釋倍數(shù)為20倍、濕樹(shù)脂量為10 g的時(shí)候文山生姜葉的純化效果最佳。

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A Study on the Polysaccharide Purifi cation Process of Wenshan Ginger Leaves

WANG Hongping， GUO Qingsen
（School of Chemistry and Chemical Engineering， Wenshan University， Wenshan Yunnan 663099， China）

In order to purify the polysaccharide in Wenshan ginger leaves， coarse polysaccharide is extracted from ginger leaves by hot water， polysaccharide is absorbed and purifi ed with macroporous resin and polyamide after removing protein and pigment and the single factor and orthogonal experiment are done. By the study of solvent concentration， sample quantity， the type of resin， and the amount of resin and single factor and orthogonal test， the optimum purifi cation conditions are determined as follows: remove protein by sevage method， decolor with active carbon ， alcohol concentration of 95%， choiced AB 8 resin. Under the optimum condition， the amount of purifi ed polysaccharide is 4.5%. The results can provide theoretical basis for the development and utilization of ginger leaves.

ginger leaves； polysaccharide； macroporous resin； purifi cation process

S567

A

1674 - 9200（2015）06 - 0049 - 04

（責(zé)任編輯 張鐵）

2015 - 03 - 19

文山學(xué)院科研基金項(xiàng)目“文山生姜葉的營(yíng)養(yǎng)成分分析及多糖的提取與純化”（14WSY12）。

王紅萍，文山學(xué)院化學(xué)與工程學(xué)院講師，碩士。