mir－181c靶向作用Smad7在神經(jīng)母細(xì)胞瘤中的調(diào)控機(jī)制研究

李 勇 王莉華

鄭州大學(xué)附屬鄭州中心醫(yī)院神經(jīng)外科 鄭州 450000

研究表明miRNA 參與多種生物過程［1］，有許多關(guān)于miRNA 對神經(jīng)母細(xì)胞瘤（Neuroblastoma，NB）組織下調(diào)機(jī)制的研究的報道［2－3］。我們先前的研究發(fā)現(xiàn)miR－181c抑制NB細(xì)胞的生長，然而，miR－181c對NB 的靶向調(diào)控機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。

1 實(shí)驗(yàn)步驟

1.1 細(xì) 胞 系 和 轉(zhuǎn) 染 人 類NB 細(xì) 胞 系SK－N－SH 和SHSY5Y。MiR－181c模 塊，Smad7siRNA 和 反 義siRNA 購 買 于上?；蛑圃旃?。基因編碼Smad7放大和插入pcDNA3向量（上 游：5“CGAAGCTTATGTTCAGGACCAAACGATCTGCGC 3”；下游：5“CCCTCGAGGGGCGCAGATCGTTTGGTCCTGAACAT 3”）。使用Lipofectamine TM 2000細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑（英杰公司）進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。

1.2 綠色熒光蛋白報告基因分析 擴(kuò)增Smad7的野生型3‘UTR，并插入到pcDNA3／EGFP媒介的下游。Smad7DE 突變體3‘UTR（UGAAUGA 突變?yōu)锳GUAAGA）進(jìn)行擴(kuò)增，并克隆到載體pcDNA3／EGFP 的下游。對于EGFP 報告基因的分析，使用mir－181c模塊或ASO－mir－181c和野生型Smad7的3＇UTR 或突變體3＇UTR 進(jìn)行細(xì)胞共轉(zhuǎn)染。RFP表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率增高。在轉(zhuǎn)染48h后，通過一個F－4500熒光分光光度計來測定裂解的細(xì)胞和GFP密度。

1.3 免疫蛋白印跡分析 在6孔板中培養(yǎng)細(xì)胞，密度為30×104個細(xì)胞／孔，并且在第2天細(xì)胞數(shù)量達(dá)到大約80%的時候進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后48h，用RIPA 緩沖液，在4度裂解細(xì)胞30min。使用BCA方法測定蛋白質(zhì)濃度并且用20μg的蛋白質(zhì)上樣來進(jìn)行SDS－PAGE分析。一抗是兔抗人Smad7的抗體（1：500，Abcam 公 司，美 國）和 兔 抗 人GAPDH 抗 體（1：1 000，Abcam 公司，美國）。二抗是羊抗兔IgG 結(jié)合辣根過氧化物酶（1：1 000，Abcam 公司，美國）。使用的ECL Plus Western印跡檢測系統(tǒng)（GE Healthcare）檢測結(jié)合的抗體，并使用高性能的化學(xué)發(fā)光膜（GE Healthcare）上進(jìn)行檢測。

1.4 RNA 的提取和實(shí)時定量PCR 根據(jù)制造商的說明方案，使用Trizol提取總的RNA。使用1μg的RNA 進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。對于miRNA 的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，使用特定的miR－181c RT 引物，然后用于總RNA 的逆轉(zhuǎn)錄，Oligo（dT）作為一個通用的引物。使用SYBR GreenPCR 混合物進(jìn)行實(shí)時定量PCR。所有使用的引物如下：miR－181cRT primer：5’CTCAAC TGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGACTCACCG 3’；miR－181c forward primer：5’ACACTCCAGCTGGGAACATTCAACCTG 3’；Reverse primer：5’TGGTGTCGTGGAGTCG 3’；Smad7sense：5’TCTGCTCCTGGATCTCCCTGA GATG 3’；Smad7antisense：5’GCTTGCTGGCCTAATAGCAGAGCTT3’。

1.5 腫瘤細(xì)胞存活實(shí)驗(yàn)（MTT） 鋪96孔板，4000個／每孔轉(zhuǎn)染細(xì)胞。在轉(zhuǎn)染48h 后，用MTT 培養(yǎng)4h。加入DMSO100μL，解除MTT 并將細(xì)胞放置搖晃10min。用分光光度計測定吸光值A(chǔ)（波長570nm）。細(xì)胞增殖率（%）＝ATest／AControl×100%。

1.6 Transwell小室遷移試驗(yàn)和侵襲試驗(yàn) 無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24h，消化細(xì)胞并離心收集細(xì)胞，細(xì)胞懸液（細(xì)胞密度2.5×104）250μL 加入transwell上室，腔室底部則加入750μL的含有10%～20%血清的培養(yǎng)液。20h后取出transwell小室，使用棉簽輕輕擦拭小室上層細(xì)胞，使用4%多聚甲醛固定transwell小室。取出固定好的小室，使用自來水沖洗小室，結(jié)晶紫染色15min沖洗。將染好色的小室經(jīng)梯度酒精脫水，風(fēng)干后取下膜層，用中性樹脂封片，顯微鏡下計數(shù)即可。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析 數(shù)據(jù)分析選用SPSS 13.0軟件，所有數(shù)據(jù)采用mean±SD，兩組間比較采用雙樣本t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 mi－181c的直接目標(biāo)基因Smad7 為了探索mir－181c對NB 細(xì)胞的調(diào)控機(jī)制，使用生物信息學(xué)技術(shù)我們預(yù)測了mi－181候選目標(biāo)基因，認(rèn)為候選基因?qū)Π┯袧撛谧饔?。我們挑選了Smad7，MAT2A，CDKN2AIP，TGFB1 當(dāng)作候選靶向基因。為了確定這些基因是否被mir－181c調(diào)控，我們首先檢測mir－181c控制3＇UTR 段綠色熒光蛋白的（Green Fluorescent Protein GFP）強(qiáng) 度。如 圖4B 示，mir－181c 減 少3＇UTR 段Smad7、CDKN2AIP 和TGFB1 的GFP 強(qiáng) 度，而MAT2A 除外。另外，蛋白印跡法（Western blot）分析表明，mir－181c蛋白水平上減少對Smad7 和CDKN2AIP 的表達(dá)，而對TGFB1 和MAT2表達(dá)增高。鑒于mir－181c對Smad7的表達(dá)影響較CDKN2AIP顯著，我們選擇了Smad7作為進(jìn)一步 研 究 對 象。Figure 1D 示，mir－181c 的 結(jié) 合 位 點(diǎn) 在Smad7 3＇UTR，而且產(chǎn)生了多個突變位點(diǎn)。我們用mir－181c對野生型／3＇UTR 段突變的Smad7重新轉(zhuǎn)染細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)mir－181c減少Smad 3＇UTR 段GFP強(qiáng)度，對突變的Smad7 3＇UTR段GFP強(qiáng)度沒有影響。在蛋白水平上，mir－181c對Smad7 mRNA 的表達(dá)減少約40%。這些數(shù)據(jù)表明mir－181c直接靶向作用于Smad7，mir－181c可抑制Smad7的表達(dá)。

圖1 mi－181c的直接目標(biāo)基因Smad7

2.2 Smad7 介導(dǎo)mir－181c在NB 細(xì)胞中的抗腫瘤作用Smad7作為mir－181c的直接靶向基因，我們試圖確定mir－181c是否引誘Smad7可以調(diào)節(jié)其生物學(xué)行為，我們用mir－181c模塊和Smad7 過度表達(dá)載體pcDNA3／Smad7（無Smad7 3＇UTR）共同轉(zhuǎn)染細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，兩者均能控制Smad7表達(dá)量。通過Western blot和RT－PCR 驗(yàn)證了Smad7 的表達(dá)。MTT 和Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)分析表明，Smad7過度表達(dá)可以恢復(fù)細(xì)胞活力，促進(jìn)遷移和侵襲能力。對修復(fù)細(xì)胞活性，遷移和入侵能力。此外，進(jìn)一步驗(yàn)證Smad7在NB 細(xì)胞中的作用，我們用siRNA 技術(shù)抑制了Smad7的表達(dá)。我們發(fā)現(xiàn)Smad7的敲除抑制細(xì)胞的生長，遷移和入侵。總而言之，這些數(shù)據(jù)表明，Smad7 蛋白可能作為的mir－181c在NB腫瘤發(fā)生的重要介質(zhì)。

圖2 Smad7介導(dǎo)mir－181c在NB細(xì)胞中抗腫瘤作用

3 討論

先前關(guān)于miR－181家族靶標(biāo)基因研究主要是5p段結(jié)合位點(diǎn)干擾基因的研究［4］，最近研究人員用信息預(yù)測靶點(diǎn)法預(yù)測結(jié)合位點(diǎn)，進(jìn)一步用突變3′段綁定結(jié)合位點(diǎn)干擾基因表達(dá)，檢測靶點(diǎn)位目的基因表達(dá)率，發(fā)現(xiàn)miRNA－9靶定MMP－14基因3′段，并抑制其表達(dá)，對NB 起到抑制作用［5］。miR－181簇在癌癥中起到的不同作用主要取決于它的靶向基因，通過靶向基因調(diào)節(jié)miRNA 的功能。為了了解mir－181c在NB細(xì)胞系中的抑癌作用機(jī)制，進(jìn)一步研究靶向結(jié)合位點(diǎn)和堿基突變對基因表達(dá)的影響，本實(shí)驗(yàn)用EGFP 檢測3＇UTR段Smad7綠色熒光蛋白（GFP）強(qiáng)度，發(fā)現(xiàn)mir－181c結(jié)合位點(diǎn)在Smad73＇UTR 段，而且有多個結(jié)合位點(diǎn)（本研究發(fā)現(xiàn)有6個結(jié)合位點(diǎn)，Smad73＇UTR1460－1466），而且發(fā)現(xiàn)mir－181c對突變的Smad73＇UTR 段GFP 強(qiáng)度沒有影響（圖1），驗(yàn)證了Smad7是mir－181c的直接靶向基因，并確定了3＇UTR 段靶向位點(diǎn)，進(jìn)一步明確mir－181c對Smad7起負(fù)表達(dá)作用。

通過功能研究（圖2），證實(shí)Smad7 和pcDNA3／Smad7（Smad7超表達(dá)載體－無Smad7 3＇UTR）對NB細(xì)胞促進(jìn)生長，遷移和入侵作用。本實(shí)驗(yàn)兩個細(xì)胞系均轉(zhuǎn)染Smad7和pcDNA3／Smad7后MTT／Transwell結(jié)果示對NB細(xì)胞有積極作用，重要的是mir－181c－mmics＋pcDNA3 組對NB細(xì)胞的抑制作用最顯著，說明mir181c與超表達(dá)的Smad7 起到抑制NB細(xì)胞生長，遷移和侵襲作用，由此可以說明Smad7直接誘導(dǎo)mir－181c產(chǎn)生抗腫瘤作用。然而，以往研究結(jié)果表明，Smad7在EGF信號通路中起負(fù)性調(diào)控作用，在乳腺癌中抑制TGF－β1的表達(dá)，從而抑制腫瘤細(xì)胞生長［6］，與本次實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)形成了鮮明的對比。這個結(jié)果表明，Smad7 具有組織特性，在不同腫瘤中起到不同的作用。由此我們可以假設(shè)，mir－181c可能在乳腺癌和NB中起到不同的作用。

實(shí)質(zhì)性證據(jù)表明，Smad的腫瘤抑制作用與TGF－β信號通路有關(guān)。Smad7在惡性腫瘤演變過程中的扮演不同的角色（抑癌／促癌）。Smad7通過防止信號轉(zhuǎn)導(dǎo)復(fù)合物的活化抑制TGF－β1通路［7］。Smad7具有競爭性抑制作用外，還能夠調(diào)節(jié)TGF／BMP 通路中Smurf遍在蛋白。Smurf2 連接到Smad7蛋白，降低信號傳導(dǎo)，進(jìn)而調(diào)節(jié)Smad7的遍在蛋白化和降解Smad。然而，到目前為止Smad7的功能仍然不清楚。通 過抑 制TGF－β，Smad7 過 度 表 達(dá) 抑 制 骨 和 肺 轉(zhuǎn) 移［8－9］。Smad7同時通過減少M(fèi)MP－2和MMP－9的分泌［10］抑制黑色素瘤細(xì)胞的生長和腫瘤發(fā)生。與此相反，Smad7的可誘發(fā)大腸癌轉(zhuǎn)移［11－12］。符合Smad7 在結(jié)直腸癌促轉(zhuǎn)移作用，我們的數(shù)據(jù)還表明，Smad7蛋白促進(jìn)NB 細(xì)胞生長，遷移和侵襲。因此，Smad7蛋白功能機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

總之，我們研究證明了mir－181c通過Smad7 的表達(dá)抑制，調(diào)控NB 細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移，充當(dāng)一種腫瘤抑制基因。這些結(jié)果為基因治療NB患者奠定了重要基礎(chǔ)。

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