血清MMP－9與DMD 骨骼肌纖維化的相關(guān)性分析

陳盼盼 李 哲 韓春錫 林婧嫻 廖建湘

1）山東濱州市人民醫(yī)院兒科 濱州 256600 2）山東濱州市人民醫(yī)院骨科 濱州 256600 3）廣東深圳市兒童醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 深圳 518038 4）廣東珠海市人民醫(yī)院兒科 珠海 519000

杜氏型肌營養(yǎng)不良（Duchenne muscular dystrophy，DMD）是X－連鎖隱性遺傳病，占活產(chǎn)男嬰的1／3 500～1／4 000［1－2］。DMD 患 者 由 于dystrophin基 因 突 變，導(dǎo) 致 肌 纖 維膜上的dystrophin蛋白缺失，從而出現(xiàn)肌纖維變性、壞死、再生，炎細(xì)胞浸潤，纖維結(jié)締組織和脂肪組織增生。研究表明，改善肌肉纖維化可延緩患者疾病進(jìn)展，并可通過改變肌纖維的微環(huán)境提高基因治療、干細(xì)胞治療的成功率［3－4］。本研究探討骨骼肌纖維化與年齡的關(guān)系，探討血清MMP－9與DMD骨骼肌纖維化的關(guān)系及作為DMD 病情變化指標(biāo)的可行性。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2011－08—2012－06就診于深圳市兒童醫(yī)院神經(jīng)肌肉病?？撇⑼ㄟ^肌肉病理檢查和（或）基因檢查診斷為DMD／BMD、且未經(jīng)藥物治療的50 例患兒（均為男孩）為研究對象，收集患者腓腸肌和非抗凝血資料。其中DMD 組42例，平均年齡（6.55±2.72）歲；BMD 組8 例，平均年齡（8.80±4.17）歲；收集正常對照組非抗凝血18例，平均年齡（8.07±3.86）歲。DMD 組又根據(jù)年齡分為3組，其中＜5歲組13例，5～9歲組21例，＞9 歲組8例。收集的肌肉標(biāo)本均來自于肌活檢。本研究標(biāo)本收集均經(jīng)患兒家長同意，并簽寫知情同意書。

1.2 方法 行HE染色觀察骨骼肌基本病理改變，Masson染色觀察骨骼肌纖維化程度，免疫組織化學(xué)鏈霉素抗生物素蛋白過氧化物酶連結(jié)（SP）法觀察MMP－9在肌肉組織中的分布情況；并對行DMD、BMD 及正常對照組行ELISA 法行血清MMP－9濃度測定。

2 結(jié)果

2.1 各組骨骼肌比較 DMD 組骨骼肌中可見纖維組織增生，其中＜5歲組DMD 患者骨骼肌纖維組織增生不明顯，5～9 歲組DMD 骨骼肌纖維組織增生明顯（圖1），＞9 歲組DMD 骨骼肌纖維組織增生明顯，且肌纖維數(shù)量明顯減少。BMD 對照組未見明顯纖維組織增生。除可見纖維化組織增生情況外，＜5歲組DMD 骨骼肌可見肌束間界限欠清，較多萎縮、肥大、變性、壞死肌纖維和以及少量再生肌纖維；5～9歲組DMD 骨骼肌肌束間界限欠清，大量萎縮、肥大、變性、壞死以及少量再生肌纖維（圖2）；＞9歲組DMD 骨骼肌肌束間界限欠清，大量萎縮、肥大、變性、壞死肌纖維，少量再生肌纖維。BMD 對照組骨骼肌肌束間界限清，較多萎縮、肥大、變性、壞死以及再生肌纖維。

圖1 DMD MASSON染色×100

圖2 DMD HE染色×100

2.2 各組纖維化程度通過膠原纖維／（膠原纖維＋肌纖維）面積百分比比較 DMD 組纖維化程度均值為（40.29±15.27）%，明 顯 高 于BMD 對 照 組（20.04±8.50）%（t＝3.653，P＜0.05）。見表1。DMD＜5 歲組、5～9 歲組、＞9歲組相比，纖維化程度逐漸增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，表2）。采用Pearson線性相關(guān)與回歸分析DMD 組纖維化程度與年齡的關(guān)系，結(jié)果提示膠原纖維含量隨患兒年齡的增長而增加，兩者成正相關(guān)（r＝0.6721，P＜0.05）。

表1 DMD 組、BMD 對照組纖維化程度測量結(jié)果比較

表1 DMD 組、BMD 對照組纖維化程度測量結(jié)果比較

注：2組數(shù)據(jù)均近似正態(tài)分布，經(jīng)兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，F(xiàn)＝2.457，P＝0.124，方差齊，t＝3.653，P＝0.001

組別 n 年齡／歲 纖維化程度DMD 組42 6.56±2.69 40.29±15.27 BMD 對照組8 8.80±4.46 20.04±8.50

表2 DMD 各組纖維化程度測定結(jié)果比較

表2 DMD 各組纖維化程度測定結(jié)果比較

注：三組數(shù)據(jù)都近似正態(tài)分布。經(jīng)單因素方差分析，方差齊，P＝0.293，總體分析，F(xiàn)＝18.643，P＝0.000

組別 n 年齡／歲 纖維化程度／%＜5歲組13 3.48±0.28 30.53±10.26 5～9歲組 21 6.83±0.94 39.79±11.89＞9歲組8 10.81±0.93 59.59±13.65

2.3 α－SMA 是肌成纖維細(xì)胞的特異性標(biāo)記物，圖3b 示DMD 骨骼肌中存在肌成纖維細(xì)胞。CD68標(biāo)記巨噬細(xì)胞，在DMD 骨骼肌中，巨噬細(xì)胞浸潤，且壞死肌纖維周圍多見。MMP－9存在于DMD 骨骼肌中，且在巨細(xì)胞浸潤的部位表達(dá)較強(qiáng)。

圖3a DMD 陰性對照×200

圖3b DMDα－SMA染色×200

圖3c DMD CD68染色×200

圖3d DMD MMP－9染色×200

2.4 各 組MMP－9 濃 度 比 較 DMD 組、BMD 對 照 組 血 清MMP－9濃度比正常對照組明顯升高，且DMD 組血清MMP－9濃度升高最明顯，3組血清MMP－9濃度比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。在DMD 患者中，＞9歲組、5～9歲組與＜5歲組相比血清MMP－9均升高（P＜0.05）；＞9歲組與5～9歲組相比，血清MMP－9略下降，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表3、表4。經(jīng)Pearson相關(guān)分析，9歲前的DMD患者，血清MMP－9與年齡正相關(guān)（r＝0.6118，P＜0.05）。

表3 DMD 組、BMD 對 照 組、正 常 對 照 組 血 清MMP－9濃度測定結(jié)果

表3 DMD 組、BMD 對 照 組、正 常 對 照 組 血 清MMP－9濃度測定結(jié)果

注：近似正態(tài)分布，經(jīng)單因素方差分析，方差不齊，P＝0.000，總體分析F＝46.398，P＝0.000

組別 n 年齡（歲） MMP－9（ng／mL）DMD 組42 6.56±2.69 742.37±309.12 BMD 對照組 8 8.80±4.47 286.94±82.95正常對照組18 8.07±3.86 89.93±41.27

表4 DMD各組血清MMP－9濃度測定結(jié)果及P值表

表4 DMD各組血清MMP－9濃度測定結(jié)果及P值表

注：近似正態(tài)分布，經(jīng)單因素方差分析，方差齊，P＝0.241，總體分析F＝8.873，P＝0.001

組別 n 年齡／歲 MMP－9（ng／mL）＜5歲組13 3.48±0.28 499.83±205.52 5～9歲組 21 6.83±0.94 887.07±310.77＞9歲組8 10.81±0.93 756.69±229.55

3 討論

本研究采用Masson染色觀察、測定纖維化程度。目前，Masson染色是檢測纖維化最常用的病理方法，該方法成熟、可靠、方便，并廣泛應(yīng)用于肝腎纖維化、骨骼肌纖維化、mdx小鼠心肌纖維化等纖維化疾病的測定中［5－6］。對DMD、BMD患者的冰凍肌肉組織進(jìn)行Masson染色，染色后膠原纖維呈現(xiàn)藍(lán)色，肌纖維呈現(xiàn)紅色，容易區(qū)分，便于纖維化程度的計(jì)算。

本研究中，DMD 與貝克型肌營養(yǎng)不良（Becker muscular dystrophy，BMD）的纖維化嚴(yán)重程度不同。DMD 組纖維化程度較BMD 組明顯升高（P＜0.05），這與DMD、BMD 的發(fā)病機(jī)制相關(guān)。在DMD 中，dystrophin基因發(fā)生框移突變，導(dǎo)致合成的dystrophin蛋白缺失C末端，而且dystrophin蛋白的含量不足正常人的3%，dystrophin－C、N、R 免疫組化染色多為0～2級。在BMD 中，dystrophin基因突變并不改變翻譯閱讀框架，產(chǎn)生的dystrophin蛋白保留C 末端，合成dystrophin蛋白功能降低，且dystrophin－C、N、R 免疫組化染色多為3～4級［1，7－8］。dystrophin蛋白的缺失使細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)不完整、功能受損，這導(dǎo)致肌細(xì)胞變性壞死、炎細(xì)胞浸潤、纖維結(jié)締組織增生［9］。DMD 患者dystrophin蛋白缺失嚴(yán)重，其肌纖維結(jié)構(gòu)功能受影響較大，因此，在DMD 中可見較多變性、壞死、再生肌纖維。BMD 患者中dystrophin蛋白含量較多，對肌纖維結(jié)構(gòu)和功能的影響較小，細(xì)胞壞死發(fā)生的較緩慢，炎性反應(yīng)、纖維化程度較DMD 輕［10］。由于BMD 患者與DMD患者的發(fā)病機(jī)制類似，病理改變的特點(diǎn)密切相關(guān)，故本研究在觀察DMD 組纖維化程度時(shí)，選用BMD 早期患者作為對照組。

本研究觀察DMD 患者M(jìn)asson染色，發(fā)現(xiàn)＜5歲組者纖維結(jié)締組織增生不明顯，5～9 歲組肌纖維結(jié)締組織增生明顯，＞9歲組纖維結(jié)締組織增生最明顯，且DMD 骨骼肌纖維化程度隨年齡的增加而加重（r＝0.6721，P＜0.05），表明隨著年齡的增加，DMD 肌纖維逐漸被纖維結(jié)締組織取代，骨骼肌病理變化越來越嚴(yán)重。大量研究表明［1，11］，在DMD 中，骨骼肌病理改變的嚴(yán)重程度與年齡相關(guān)，在年幼患兒中肌肉病理改變較輕，在年齡大的患兒中病理改變較重，其中纖維化程度隨著年齡的增加逐漸加重，與本研究結(jié)果一致。

MMP－9作為一種分泌蛋白，由受損的肌肉及炎性細(xì)胞釋放，存在于mdx小鼠骨骼肌的肌纖維及其周圍組織表明，且巨噬細(xì)胞密度高的地方，MMP－9水平也較高［12］。在本研究中，MMP－9存在于DMD 骨骼肌組織中，且巨噬細(xì)胞密度高的地方表達(dá)較強(qiáng)，與MMP－9在mdx小鼠骨骼肌中的分布相符。

本研究中，除了DMD 組、BMD 對照組血清MMP－9濃度均比正常對照組高外，DMD 組血清MMP－9濃度比BMD對照組高（P＜0.05），且DMD 組纖維化程度比BMD 組高，這表明血清MMP－9濃度可能與纖維化程度有關(guān)。國外研究報(bào)道，生后6周、8周的mdx小鼠與同齡wt小鼠相比，血清MMP－9濃 度 升 高［13－14］，些 研 究 均 表 明MMP－9與mdx小 鼠骨骼肌纖維化有關(guān)，與本研究結(jié)果相符。

DMD＞9歲組、5～9歲組與＜5歲組相比，血清MMP－9濃度較高（P＜0.05），＞9 歲組與5～9 歲組相比，血清MMP－9略有下降，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。在第8到14周的mdx小鼠中，血清MMP－9水平在隨mdx小鼠年齡的增加而下降［13］，而本研究中＞9歲組與5～9歲組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這可能與mdx小鼠與DMD 患者的病理改變程度不同有關(guān)。

本研究中，可見DMD5～9歲組血清MMP－9濃度均比＜5歲組較高，且9歲之前，DMD 血清MMP－9（r＝0.6118，P＜0.05）濃度隨年齡的增加而升高。DMD 患者纖維化程度隨年齡的增加而加重，因此，我們推斷DMD 在9歲之前，血清MMP－9濃度隨纖維化程度的加重而升高。Nadarajab VD等［13］以接受了糖皮質(zhì)激素治療的DMD 患者為研究對象，發(fā)現(xiàn)血清MMP－9濃度隨年齡的增長而增加，這可能與糖皮質(zhì)激素有關(guān)。在其他疾病中，糖皮質(zhì)激素可使血清MMP－9水平降低［15］，或 先 升 高 后 降 低［16］，亦 有 研 究 表 明 無 明 顯 影響［17］；在Nadarajab VD 等［13］的 研 究 中，不 僅 應(yīng) 用 了 糖 皮 質(zhì)激素且治療時(shí)間長短不一，不能完全排除糖皮質(zhì)激素治療對研究結(jié)果的影響。Hughes等［53］指出，在DMD 中，糖皮質(zhì)激素可能通過鈣調(diào)磷酸酶／NF－AT（nuclear factor of activated T－cell，NF－AT）途徑減緩DMD 肌纖維化的病理過程，這可能會影響MMP－9水平。因此，本實(shí)驗(yàn)中選擇未經(jīng)過經(jīng)過糖皮質(zhì)激素治療的DMD 患者為研究對象，結(jié)果可以排除糖皮質(zhì)激素的影響。

本研究表明，DMD 患者血清MMP－9 濃度升高，且在DMD 患者9歲之前，血清MMP－9濃度隨年齡的增長、纖維化程度的增加而升高。因此，血清MMP－9濃度可與其他指標(biāo)共同作為評估DMD 病情變化的重要指標(biāo)，尤其是作為評估早中期DMD 病情變化的評估指標(biāo)，以及作為評估DMD早期治療效果的評估指標(biāo)。

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