P16蛋白在正常宮頸、CIN、宮頸癌組織中的表達(dá)差異及意義

鐘偉珍 唐忠慶 嚴(yán)敏莉

【摘? 要】目的：探討P16蛋白在正常宮頸、宮頸上皮內(nèi)瘤變（cervicalintraepithelialneoplasias，CIN）、宮頸癌組織中的表達(dá)差異及意義。方法：收集本院2012年10月～2013年10月行除的宮頸癌（3例）、CINⅡ、Ⅲ（61例）組織的石蠟標(biāo)本64例進(jìn)行研究，并收集30例正常宮頸組織標(biāo)本作為對照組。利用免疫組織化學(xué)技術(shù)對所有標(biāo)本進(jìn)行檢測，得出其中的P16蛋白表達(dá)情況。結(jié)果：在CIN組織和宮頸癌組織中，較之正常的宮頸組織，p16蛋白的陽性表達(dá)率顯著增加。而將宮頸癌組織與正常宮頸組織，以及正常宮頸組織和CIN組織，還有CIN組織與宮頸癌組織進(jìn)行兩兩對比，可以發(fā)現(xiàn)不同組織的p16蛋白陽性表達(dá)率經(jīng)比較均存在顯著差異。結(jié)論：16蛋白在正常宮頸、CIN以及宮頸癌組織中的表達(dá)存在較大的差異，臨床可以將16蛋白作為宮頸癌篩查的重要指標(biāo)之一。

【關(guān)鍵詞】宮頸;宮頸上皮內(nèi)瘤變（cervicalintraepithelialneoplasias，CIN）;宮頸癌;P16蛋白;表達(dá)

宮頸上皮內(nèi)瘤變（cervicalintraepithelialneoplasias，CIN）是一組與宮頸癌關(guān)系較為密切的病變，研究發(fā)現(xiàn)，P16蛋白是一種抗癌基因，廣泛存在于人體的宮頸細(xì)胞之中，與宮頸上皮內(nèi)瘤變等關(guān)系密切^[1]。一旦，P16蛋白發(fā)生變異，便會逐漸轉(zhuǎn)化為惡性細(xì)胞。因此，臨床積極對p16蛋白正常宮頸和CIN以及宮頸癌組織中的表達(dá)水平進(jìn)行研究，可以幫助人們更好的了解疾病的發(fā)生與發(fā)展等，提高臨床治療的準(zhǔn)確性，具有較強的現(xiàn)實意義^[2]。本研究中，筆者收集本院2012年10月～2013年10月行除的宮頸癌（3例）、CINⅡ、Ⅲ（一共61例）組織的石蠟標(biāo)本64例進(jìn)行研究，并收集30例正常宮頸組織標(biāo)本作為對照組，探討P16蛋白在正常宮頸、CIN、宮頸癌組織中的表達(dá)差異及意義?，F(xiàn)將研究結(jié)果進(jìn)行如下報告。

1一般資料和方法

1.1一般資料

收集本院2012年10月～2013年10月行除的宮頸癌（3例）、CINⅡ、Ⅲ（61例）組織的石蠟標(biāo)本64例進(jìn)行研究，患者年齡23 ～ 59歲。另外，從同期在本院接受健康體檢的健康人群中收集30例正常宮頸組織標(biāo)本作為對照組。研究獲得醫(yī)學(xué)倫理學(xué)相關(guān)部門同意，所有患者均了解研究相關(guān)情況，并簽署知情同意書，自愿參與研究。

1.2方法

利用免疫組織化學(xué)技術(shù)對所有標(biāo)本進(jìn)行檢測，分析其P16蛋白表達(dá)情況。

1.2.1試劑

（1）p16鼠抗人單克隆抗體購自上海天呈醫(yī)流科技股份有限公司;（2）超敏SP（鼠/兔）試劑盒購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司;（3）AB酶底物顯色劑購自上海領(lǐng)潮生物科技有限公司;（4）PH 6.0枸櫞酸緩沖液（自配）（5）0.01MPH7.4 PBS緩沖液（自配）。

1.2.2儀器和設(shè)備

（1）醫(yī)用凈化工作臺購自北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司;（2）單道可調(diào)式微量移液器購自上海艾研生物科技有限公司;（3）雙目光學(xué)顯微鏡購自上海明茲儀器有限公司;（4）推拿式切片機(jī)購自香港萬浩科技有限公司;（5）隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱購自上海璽恒實業(yè)有限公司;（6）生物組織攤烤片機(jī)購自湖北康益達(dá)醫(yī)療科技有限公司;

1.2.3檢測方法

將購買試劑時提供的p16陽性切片作為陽性對照，將購買磷酸鹽緩沖液PBS代替一抗作為陰性對照。利用免疫組化鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化酶連接（S-P法）檢測不同組織中的p16表達(dá)情況。

1.3檢測結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)

p16蛋白的蛋白產(chǎn)物位于細(xì)胞核或者細(xì)胞漿，如果為陽性，則呈黃色或棕黃色。計數(shù)：利用100倍顯微鏡，觀察每張切片 10個以上的獨立視野，選取其中陽性細(xì)胞數(shù)最多的5個視野，繼續(xù)利用400倍視野予以記數(shù)，將5個視野平均值作為最終結(jié)果。根據(jù)陽性細(xì)胞比例和分布情況進(jìn)行判定：（1）陰性（-）：單個細(xì)胞染色，陽性細(xì)胞數(shù)小于5%，（2）弱陽性：（+）小的或散在細(xì)胞團(tuán)染色，陽性細(xì)胞數(shù)5%～24%;（3）中度陽性（++）：簇狀或者片狀細(xì)胞染色，陽性細(xì)胞數(shù)25%～50%;（4）強陽性（+++）：彌散細(xì)胞染色，陽性細(xì)胞數(shù)在50%以上。（5）過表達(dá)。（++-+++）。本研究中，弱陽性表達(dá)以下均計為陰性，過表達(dá)視為陽性。

1.4統(tǒng)計學(xué)處理

研究所得數(shù)據(jù)均輸入Excel表格，并使用SPSS 公司推出的SPSS 15.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，研究所得計數(shù)資料均進(jìn)行Χ²檢驗，計量資料均進(jìn)行t檢驗。并以P<0.05作為差異有統(tǒng)計學(xué)意義的標(biāo)準(zhǔn)。

2結(jié)果

經(jīng)統(tǒng)計和檢測，p16蛋白在不同宮頸組織中的表達(dá)情況存在顯著差異，（P<0.05）。其中，在CIN組織和宮頸癌組織中，較之正常的宮頸組織，p16蛋白的陽性表達(dá)率顯著增加。而將宮頸癌組織與正常宮頸組織，以及正常宮頸組織和CIN組織，還有CIN組織與宮頸癌組織進(jìn)行兩兩對比，可以發(fā)現(xiàn)不同組織的p16蛋白陽性表達(dá)率經(jīng)比較均存在顯著差異。具體結(jié)果如表1所示：

表1? p16蛋白在宮頸組織中的表達(dá)情況分析

組織分類

例

p16蛋白

陰性（例）陽性（例）

陽性表達(dá)率（%）

P

正常組織

CIN

宮頸癌

30

61

3

30

43

1

0

18

2

0

29.5

66.7

/

<0.05

<0.05

3討論

當(dāng)人體內(nèi)出現(xiàn)失控性細(xì)胞增殖現(xiàn)象的時候，便會導(dǎo)致各種腫瘤的出現(xiàn)。腫瘤的出現(xiàn)受累于多重遺傳和表觀遺傳水平上的異常，在對各種腫瘤進(jìn)行診治的時候，存在較大的難度^[3]。分析原因，是因為腫瘤的其基因組和表觀基因組在不同生物層面上具有極度的異質(zhì)性，在水平上具有極強的可變性^[4]。另外，腫瘤還對各種環(huán)境都具有極強的適應(yīng)性。因此，在對各種類型的腫瘤進(jìn)行診斷和治療的過程中，便需要積極的利用各種新型的測序技術(shù)，利用各種高效的影像學(xué)手段，并尋找新型的分子標(biāo)志物，以更好的掌握腫瘤發(fā)生和發(fā)展的相關(guān)問題，更好的指導(dǎo)臨床治療等。

3.1宮頸病變

宮頸癌是一種常見的惡性腫瘤，對女性的危害極大。經(jīng)過大量的研究發(fā)現(xiàn)，宮頸上皮內(nèi)瘤變（cervicalintraepithelialneoplasias，CIN）是一組與宮頸癌關(guān)系較為密切的病變。但是，從宮頸病變發(fā)展為宮頸癌需要較長的時間，過程較為緩慢^[5]。而且，很多患者在疾病的發(fā)生和發(fā)展過程并沒有表現(xiàn)出特異性的征兆，因此較易出現(xiàn)病情的延誤，錯失最佳治療時機(jī)。隨著臨床醫(yī)學(xué)研究水平的不斷提高，人們開始對 宮頸癌的發(fā)生發(fā)展和不同控制細(xì)胞的生長、分化的關(guān)系等進(jìn)行研究，并分析腫瘤的發(fā)展是否與細(xì)胞基因受損之間存在一定的內(nèi)在聯(lián)系。經(jīng)過大量的研究人們發(fā)現(xiàn)，當(dāng)不同控制細(xì)胞受到一定的損傷之后，便會激活機(jī)體內(nèi)的癌基因，并導(dǎo)致各種抑癌基因的丟失或失活，從而引發(fā)腫瘤的出現(xiàn)。

3.2 p16蛋白

近年來，隨著現(xiàn)代細(xì)胞分子生物學(xué)理論和技術(shù)的發(fā)展，利用新的生物工程學(xué)技術(shù)，如克隆與序列分析、DNA重組、分子雜交、單抗和ELISA技術(shù)、PCR、限制性長度多態(tài)性分析和基因轉(zhuǎn)染等對宮頸癌的癌變過程進(jìn)行了大量的研究工作。研究發(fā)現(xiàn)，宮頸癌的發(fā)展過程中，抗癌基因有p53、p16等，以點突變和缺失為主^[6]。這些異?；蛟诎┳冞^程的不同時期影響細(xì)胞異型增生，癌細(xì)胞的分化程度、浸潤和轉(zhuǎn)移。p16基因的缺失或表達(dá)水平低下以及p53點突變或缺失者癌細(xì)胞分化程度低，浸潤和轉(zhuǎn)移能力強，故與惡性表型相關(guān)。在卵巢癌、子宮頸癌和子宮內(nèi)膜癌等婦科惡性腫瘤中，均存在p16基因的表達(dá)異常^[7]。p16蛋白是一種細(xì)胞周期負(fù)調(diào)控蛋白，又被稱為p16/CDKN2基因或者多種瘤抑制因子I（MTS-1）。p16蛋白可以指令細(xì)胞停止分裂，發(fā)揮出較強的抵御癌癥的作用，有效阻擊癌細(xì)胞，使之停止分裂^[8]。p16蛋白可以有效抑制細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶，因此對細(xì)胞的整個周期過程發(fā)揮出較強的“減速”作用。在具體的作用過程中，p16可以積極的與細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶4（CDK4）產(chǎn)生特異性的結(jié)合，導(dǎo)致其失活^[9]。于是進(jìn)一步發(fā)揮出對細(xì)胞周期的反向調(diào)節(jié)效應(yīng)，達(dá)到“減速”的目的。一旦p16蛋白受到各種因素的影響，出現(xiàn)較強的變異現(xiàn)象，便會對細(xì)胞的增殖周期產(chǎn)生較大的影響，導(dǎo)致其出現(xiàn)失控，于是細(xì)胞便會呈現(xiàn)出無限生長的情況^[10]。

3.3 p16蛋白與宮頸疾病

大量的研究發(fā)現(xiàn)，在各種婦科惡性腫瘤例如宮頸癌中，存在較為明顯的p16蛋白異常表達(dá)的情況^{[11，12]}。p16蛋白的異常變化包括了多種類型，例如p16蛋白啟動子甲基化和染色體異位以及體細(xì)胞突變和基因缺失。不同的因素影響下，均會導(dǎo)致 p16蛋白的異常表達(dá)。例如，如果出現(xiàn)p16蛋白啟動子甲基化，則會導(dǎo)致基因出現(xiàn)沉默繼而基失活，引發(fā)宮頸癌。研究發(fā)現(xiàn)，在不同病變性質(zhì)的宮頸組織中，p16 蛋白的表達(dá)均會出現(xiàn)不同表達(dá)情況^[13]。還有學(xué)者經(jīng)過研究報道，p16蛋白的陽性表達(dá)情況和宮頸癌的臨床分期之間呈現(xiàn)出明顯的正相關(guān)關(guān)系。其中，宮頸癌Ⅲ期和Ⅳ期病理患者的p16蛋白的陽性表達(dá)程度顯著低于宮頸癌Ⅰ期、Ⅱ期病理患者^[16]。汪勤^[14]等通過利用免疫組化SP法檢測正常子宮頸或炎性病變組織、CIN1～3中的p16蛋白表達(dá)情況發(fā)現(xiàn)，p16 蛋白表達(dá)和子宮頸上皮內(nèi)瘤變的病變進(jìn)展之間存在十分密切的聯(lián)系，因此，通過對檢測p16蛋白的表達(dá)水平，可以更好的對 臨床CIN進(jìn)行分級診斷，具有一定的臨床應(yīng)用價值。經(jīng)過大量的研究，學(xué)者們普遍認(rèn)為p16蛋白的實際表達(dá)情況和宮頸疾病之間存在較為密切的聯(lián)系^[15，16]。本研究最終結(jié)果顯示，在CIN組織和宮頸癌組織中，較之正常的宮頸組織，p16蛋白的陽性表達(dá)率顯著增加。而將宮頸癌組織與正常宮頸組織，以及正常宮頸組織和CIN組織，還有CIN組織與宮頸癌組織進(jìn)行兩兩對比，可以發(fā)現(xiàn)不同組織的p16蛋白陽性表達(dá)率經(jīng)比較均存在顯著差異。即提示，在正常宮頸、CIN以及宮頸癌組織中，p16蛋白的表達(dá)存在較為明顯的差異。與其他一些學(xué)者的研究結(jié)果進(jìn)行比較，基本一致。

另外，徐東曉等^[17]經(jīng)過研究發(fā)現(xiàn)，在增生期子宮內(nèi)膜、單純型增生過長、復(fù)雜型增生過長、非典型增生過長和子宮內(nèi)膜癌中，p16蛋白的表達(dá)情況呈現(xiàn)出依次下降的情況。其中，在p16蛋白的實際表達(dá)方面，增生期子宮內(nèi)膜和子宮內(nèi)膜癌之間存在顯著差異（P<0.05）。研究還發(fā)現(xiàn)，p16蛋白在子宮內(nèi)膜癌中表達(dá)在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移不同情況以及不同組織學(xué)分級的組別之中也存在較大的差異，（均P<0.05）。最終，研究學(xué)者提出觀點，認(rèn)為p16蛋白 的表達(dá)和子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生發(fā)展之間存在一定的關(guān)系，并可以積極的應(yīng)用對子宮內(nèi)膜癌的預(yù)后之中。但是，受到本研究樣本容量和觀察時間的影響，對于 p16 和宮頸癌預(yù)后之間的關(guān)系以及臨床應(yīng)用價值等，并沒有予以進(jìn)一步的研究。因此，本研究還存在一定不足之處。進(jìn)一步的結(jié)果，還需要在今后的研究中不斷擴(kuò)大樣本容量，延長研究時間，增加觀察指標(biāo)等，予以進(jìn)一步的分析探討。

綜上所述，p16蛋白在正常宮頸、CIN以及宮頸癌組織中的表達(dá)呈現(xiàn)出較大的差異。其中，p16蛋白的陽性表達(dá)發(fā)生在宮頸癌和癌前病變整個階段。因此，對p16蛋白陽性表達(dá)的檢測，可以積極的應(yīng)用于臨床對宮頸癌的篩查和診斷之中。所以，在今后的林從檢測過程中，可以積極的將p16蛋白作為一種特殊的腫瘤標(biāo)記物進(jìn)行檢測，以更好的提高診斷效果，指導(dǎo)臨床治療。

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