應(yīng)用RT—PCR方法檢測(cè)牛輪狀病毒的研究

李成元等

摘 要：牛輪狀病毒主要引起犢牛腹瀉，近年來(lái)，其國(guó)內(nèi)感染率不斷增加，本研究參照牛輪狀病毒VP7基因序列，設(shè)計(jì)合成特異性檢測(cè)引物，通過(guò)RT-PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化，建立了檢測(cè)牛輪狀病毒的一步法RT-PCR方法，并應(yīng)用該方法進(jìn)行了臨床樣品的檢測(cè)。結(jié)果顯示，該方法具有良好的特異性、敏感性、重復(fù)性和臨床適用性。本研究為牛輪狀病毒的檢測(cè)提供了一種敏感、特異、快速、簡(jiǎn)單的方法，具有很好的臨床應(yīng)用價(jià)值，值得推廣應(yīng)用。

關(guān)鍵詞：牛輪狀病毒；RT-PCR；檢測(cè)

Abstract： bovine rotavirus causes diarrhea in calves， in recent years， the infection rate is increasing， this study refers to the bovine rotavirus VP7 gene sequence， design and synthesis of specific primers， through the optimization of RT-PCR reaction conditions， established a one-step RT-PCR method for detection of bovine rotavirus， and application of the method for detection of clinical samples. The results showed that， the method has good specificity， sensitivity， reproducibility and clinical application. It provides a method for sensitive， specific， rapid， simple method for the detection of bovine rotavirus， which had good clinical application value， and it's worthy of popularization and application.

Keywords： bovine rotavirus； RT-PCR； detection

牛輪狀病毒（bovine rotavirus，BRV）又稱犢牛腹瀉病毒（calfdiarrha virus），屬于呼腸孤病毒科（Reoviridae）輪狀病毒屬（Rotavirus），是引起犢牛急性腹瀉的主要病原之一，呈全世界范圍內(nèi)流行，給全球養(yǎng)牛業(yè)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失[1，2]。BRV主要感染1～7日齡的犢牛，可引起犢牛消化道機(jī)能紊亂，臨床上以精神沉郁、食欲廢絕、嘔吐、水樣腹瀉、嚴(yán)重脫水和酸中毒等為主要特征，嚴(yán)重的可以導(dǎo)致死亡，病死率高達(dá)50%，成年牛多呈隱性感染[3，4]，BRV感染后易繼發(fā)細(xì)菌性感染，可使病情進(jìn)一步惡化[5]。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)BRV感染的陽(yáng)性率不斷增加，對(duì)我國(guó)養(yǎng)牛業(yè)的健康發(fā)展造成了嚴(yán)重的影響和巨大的威脅[6]。RT-PCR技術(shù)操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)快速、敏感性高、特異性強(qiáng)，是目前動(dòng)物疫病常用的分子生物學(xué)診斷技術(shù)，應(yīng)用RT-PCR方法檢測(cè)BRV，有助于對(duì)臨床表現(xiàn)腹瀉癥狀的病牛進(jìn)行快速確診，也有利于疾病的早期診斷和流行病學(xué)調(diào)查，為疾病的診斷提供更敏感、特異的方法。

1 材料和方法

1.1 病毒

牛輪狀病毒（bovine rotavirus，BRV）、牛病毒性腹瀉病毒（bovine viral diarrhea virus，BVDV）、牛冠狀病毒（bovine coronavirus，BCV）、牛病毒性腹瀉病毒（BVDV）、牛傳染性鼻氣管炎病毒（infectious bovine rhinotracheitis virus，IBRV）均由棗莊職業(yè)學(xué)院動(dòng)物疫病檢驗(yàn)檢疫中心實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2試劑、載體及試劑盒

Trizol試劑購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司；鼠源M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶、Ribonuclease Inhibitor 購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司。Ex Taq酶、dNTP為TaKaRa公司產(chǎn)品；病毒基因組RNA提取試劑盒、病毒基因組DNA提取試劑盒購(gòu)自百泰克科技（北京）有限公司。

1.3 病料處理

牛場(chǎng)送檢的腹瀉病料，用無(wú)菌研缽研磨并用PBS液（pH 7.2-7.4）5倍稀釋，分裝1.5 mL滅菌EP管，反復(fù)凍融3次，12 000 r/min離心5 min，取上清待用。

1.4病毒基因組RNA/DNA的提取

按病毒基因組RNA提取試劑盒分別提取牛輪狀病毒（BRV）、牛病毒性腹瀉病毒（BVDV）、牛冠狀病毒（BCV）的基因組RNA、按病毒基因組DNA提取試劑盒提取牛傳染性鼻氣管炎病毒（IBRV）的基因組DNA，同時(shí)提取病料處理上清液的病毒基因組RNA，-70 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5引物的設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)GeneBank上公布的BRV毒株VP7基因組序列（登錄號(hào)：M63266.1），利用oligo6.0軟件設(shè)計(jì)并合成1對(duì)特異性檢測(cè)引物，BRVF1：5'-CTACGCAAA GTGAACCATT-3'；BRVR1：5'-ATAGAACGCTGACGAATTAAG-3'。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.6 RT-PCR擴(kuò)增反應(yīng)

1.6.1反轉(zhuǎn)錄合成cDNA 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)按25 μL體系操作，取提取的RNA 10 μL，加入RNase free dH2O 0.5 μL，下游引物BRV R1 2.5 μL，10×M-MLV Buffer 2 μL，Ribonuclease Inhibitor 0.5 μL，dNTP 1 μL，M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶1 μL，37 ℃作用50 min后95 ℃滅活5 min后用于PCR擴(kuò)增。DNA病毒的基因組不用進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄直接進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

1.6.2 RT-PCR條件的優(yōu)化

1.6.2.1 最適模板含量的確定 將反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA適當(dāng)稀釋，使其分別含有1 μg、0.1 μg、10 ng、

1 ng，分別以其為模板，確定最適模板含量。

1.6.2.2 最適引物含量的確立 在RT-PCR反應(yīng)體系中分別加入上下游引物（20 μmol/L）各0.1 μL、0.3 μL、0.5 μL、0.7 μL、0.9 μL，確定最適引物含量。

1.6.2.3 最適退火溫度的確立 分別取50 ℃、52 ℃、54 ℃、56 ℃為退火溫度進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，確定最適退火溫度。

1.7特異性試驗(yàn)

分別以提取的牛輪狀病毒（BRV）、牛病毒性腹瀉病毒（BVDV）、牛冠狀病毒（BCV）基因組RNA，牛傳染性鼻氣管炎病毒（IBRV）基因組DNA為模板，用已優(yōu)化的最佳反應(yīng)條件進(jìn)行檢測(cè)。

1.8敏感性試驗(yàn)

將反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA適當(dāng)稀釋，使其分別含有0.1 μg、1 μg 、0.1 ng、1 ng、10 ng 的含量，分別以其為模板進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)，確定PCR擴(kuò)增的敏感性。

1.9重復(fù)性試驗(yàn)

用建立的RT-PCR方法分別對(duì)牛輪狀病毒（BRV）、牛病毒性腹瀉病毒（BVDV）、牛冠狀病毒（BCV），牛傳染性鼻氣管炎病毒（IBRV）以及BRV 3份陽(yáng)性和3份陰性樣品重復(fù)檢測(cè)3次，確定檢測(cè)方法的重復(fù)性。

1.10檢測(cè)方法的臨床應(yīng)用

利用建立的BRV RT-PCR檢測(cè)方法檢測(cè)不同牛場(chǎng)的送檢22份臨床疑似BRV感染的犢牛腹瀉樣品和35份臨床組織病料，對(duì)RT-PCR擴(kuò)增呈陽(yáng)性的片段回收，送生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序鑒定。將測(cè)序結(jié)果進(jìn)行BLAST序列比對(duì)，以驗(yàn)證該檢測(cè)方法的準(zhǔn)確性。

2 結(jié)果與分析

2.1 RT-PCR反應(yīng)條件的確定

經(jīng)反應(yīng)條件的優(yōu)化試驗(yàn)確定RT-PCR的最適模板含量為0.1 μg，最適引物含量為10 μmol，最適退火溫度為52 ℃。確定RT-PCR反應(yīng)體系為： 5 μL 10× PCR Buffer、4 μL dNTP（2.5 mmol/L）、上下游引物P1、P2（20 μmol/μL）各0.5 μL、0.1 μg cDNA，加水至50 μL。RT-PCR反應(yīng)條件為：95 ℃ 4 min；94 ℃ 45 s，52 ℃ 45 s，72 ℃ 60 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min；4 ℃終止反應(yīng)。

2.2特異性試驗(yàn)

如圖1所示，BRV的擴(kuò)增產(chǎn)物在761 bp處出現(xiàn)特異性的擴(kuò)增條帶，與試驗(yàn)預(yù)期設(shè)計(jì)的大小相符。而B(niǎo)VDV、BCV、IBRV均未出現(xiàn)擴(kuò)增產(chǎn)物，表明檢測(cè)方法具有良好的特異性。

2.3敏感性試驗(yàn)

BRV的基因組RNA反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA稀釋至10 ng的含量仍然有特異性擴(kuò)增條帶，表明檢測(cè)方法具有良好的敏感性（圖2）。

2.4重復(fù)性試驗(yàn)

將保存的病毒基因組RNA/DNA進(jìn)行3次重復(fù)操作，試驗(yàn)結(jié)果完全一致，說(shuō)明該檢測(cè)方法有很好的重復(fù)性。

2.5檢測(cè)方法的臨床應(yīng)用

應(yīng)用該方法檢測(cè)22份疑似BRV感染的犢牛腹瀉樣品和35份臨床組織病料樣品，22份犢牛腹瀉樣品中16份為BRV陽(yáng)性，陽(yáng)性率達(dá)72.72 %（16/22），35份臨床組織病料樣品有6份為陽(yáng)性，陽(yáng)性率達(dá)17.14 %（6/35）。陽(yáng)性RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的測(cè)序結(jié)果經(jīng)過(guò)BLAST序列比對(duì)，與BRV CHLY株（GenBank登錄號(hào)：DQ195152.1）的同源性均在99.6 %以上，表明建立的RT-PCR檢測(cè)方法有很好的準(zhǔn)確性，值得臨床樣品檢測(cè)的推廣應(yīng)用。

3 討論

BRV是引起牛腹瀉的重要病原之一，約50 %的犢牛腹瀉是由BRV感染引起，給牛場(chǎng)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[7]。且輪狀病毒為人畜共患病毒，人感染輪狀病毒后也會(huì)引起腹瀉及發(fā)生胃腸炎，故加強(qiáng)BRV的綜合防控對(duì)養(yǎng)牛業(yè)和人類健康都具有十分重要的現(xiàn)實(shí)意義[8]。目前，BRV的檢測(cè)方法主要包括病毒分離、血清中和試驗(yàn)、ELISA技術(shù)及PCR等方法。傳統(tǒng)的病毒分離和血清中和試驗(yàn)方法，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，并且由于BRV不容易在細(xì)胞中出現(xiàn)病變也影響結(jié)果的觀察；ELISA方法雖然靈敏度高，但受到病毒感染時(shí)間的限制，不能進(jìn)行早期診斷；PCR方法敏感性高、特異性強(qiáng)，可以準(zhǔn)確快速檢測(cè)出極低含量的BRV，且操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)快速[9]。因VP7基因是BRV的結(jié)構(gòu)基因，具有高度的保守性，本研究選擇在VP7基因內(nèi)部設(shè)計(jì)RT-PCR檢測(cè)引物，提高了BRV的檢出率，減少了漏檢的可能。本研究建立的BRV RT-PCR檢測(cè)方法具有良好的特異性、敏感性、重復(fù)性和穩(wěn)定性，將為BRV的病原檢測(cè)及分子流行病學(xué)調(diào)查等提供一種敏感、特異、快速、準(zhǔn)確的分子生物學(xué)方法。 應(yīng)用該方法檢測(cè)22份臨床疑似BRV感染的犢牛腹瀉樣品16份為陽(yáng)性，35份臨床組織病料樣品6份為陽(yáng)性，陽(yáng)性率達(dá)17.14 %（6/35），該結(jié)果與常繼濤等[9]報(bào)道內(nèi)蒙古、黑龍江、新疆、北京、安徽等地區(qū)BRV感染的平均陽(yáng)性率為12 %具有高度的一致性，表明BRV在我國(guó)牛群中已普遍存在，建議加強(qiáng)對(duì)該病毒的診斷，及時(shí)淘汰感染牛，保障我國(guó)養(yǎng)牛業(yè)健康發(fā)展。

（編輯：李雨慈）

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