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    Folin睠iocalteu法測定昭通蘋果總酚含量

    2015-10-21 19:11:20袁曉春李輔碧陳屏昭
    安徽農(nóng)業(yè)科學(xué) 2015年21期
    關(guān)鍵詞:昭通總酚定容

    袁曉春 李輔碧 陳屏昭

    摘要

    [目的] 采用FolinCiocalteu法測定蘋果總酚含量,探索基層實(shí)驗室快速準(zhǔn)確測定蘋果總酚的有效方法,為昭通蘋果生產(chǎn)及加工工藝提供科學(xué)依據(jù)。[方法] 采用70%乙醇酸性溶液作溶劑,35 ℃下超聲提取蘋果總酚,以FolinCiocalteu試劑和120 g/L Na2CO3溶液處理,在765 nm處測其吸光度。 [結(jié)果] 以沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn),質(zhì)量濃度在0~125.4 mg/L范圍內(nèi)與吸光度線性關(guān)系良好(r=0.999 1),據(jù)此測定昭通蘋果試樣的總酚含量范圍為361.1~1 008.0 mg/kg,加標(biāo)回收率試驗結(jié)果為103.2%,RSD 1.4%。 [結(jié)論] 該方法操作簡便,重復(fù)性好,結(jié)果準(zhǔn)確可靠,適用于基層實(shí)驗室。

    關(guān)鍵詞昭通蘋果;FolinCiocalteu法;測定;總酚

    中圖分類號S609.9文獻(xiàn)標(biāo)識碼A文章編號0517-6611(2015)21-292-03

    近年來,廣泛存在于蔬菜、水果、豆類、谷物類等植物中的植物多酚,因為其重要作用,而倍受人們關(guān)注。植物多酚在蘋果、葡萄、荔枝、漿果等水果中的含量極高。蘋果是多酚的主要來源,蘋果多酚具有獨(dú)特的生理功能活性,是一種有效的自由基清除劑,具有很好的開發(fā)應(yīng)用前景[1]。

    蘋果中富含維生素、礦物質(zhì)、黃酮類、酚類等活性物質(zhì),是一種很好的食材,無論西洋蘋果還是中國蘋果,都深受人們的喜愛。有研究表明,蘋果是荷蘭人飲食中第三大黃酮醇類物質(zhì)的食物來源,僅居于茶和洋蔥之下;在芬蘭,則與洋蔥并列第一。在美國水果酚類的22%來自于蘋果,排列第一。一系列研究表明,吃蘋果和預(yù)防許多慢性病是相關(guān)的,冠心病、慢性阻塞性肺病、腦中風(fēng)均和食用蘋果量相關(guān)。我國老百姓喜愛蘋果,普遍認(rèn)同吃蘋果時連皮吃更有營養(yǎng)。研究證明,水果果皮中的多酚含量確實(shí)比果肉中的要多。蘋果的基因型、培育條件、生長區(qū)都對蘋果多酚的濃度和清除自由基能力起到不同的作用,果皮的作用更明顯,這是因為致病的壓力大多作用于果皮[2-4]。

    我國蘋果古稱為“柰”,我國史書自漢以后歷代皆有記載[4]。昭通蘋果種植歷史悠久,于1940年便被引入栽種[5],發(fā)展至今,具有了早果、豐產(chǎn)、果面色澤鮮艷、風(fēng)味香甜濃郁、肉質(zhì)爽脆可口,成熟期較北方早30 d等特點(diǎn)。加之得天獨(dú)厚的地理優(yōu)勢和區(qū)位優(yōu)勢,昭通由此贏得 “蘋果之鄉(xiāng)”的美譽(yù)[6]。近年來,雖然昭通蘋果產(chǎn)量大增,但在蘋果的品質(zhì)提升和加工等方面還需提高和發(fā)展。研究昭通蘋果多酚對提升昭通蘋果品質(zhì)和蘋果生產(chǎn)具有現(xiàn)實(shí)意義。

    考慮到基層實(shí)驗室人力、物力有限的現(xiàn)狀,擬定以乙醇為溶劑,利用超聲提取技術(shù),采用FolinCiocalteu法,常溫下測定蘋果多酚。此法所需設(shè)備儀器簡單,試驗操作簡便快速。力求通過試驗,探索出基層實(shí)驗室簡單、快速、準(zhǔn)確測定蘋果總酚的有效方法。

    1材料與方法

    1.1材料

    1.1.1

    試樣。昭通本土出產(chǎn)的紅富士蘋果樣品1、2、3、4、5號(1號、2號由陳屏昭提供, 3號、4號、5號從市場分批購進(jìn))。

    1.1.2

    主要試劑。

    沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品,中國食品藥品檢定研究院;無水乙醇(分析純),成都市科龍化工試劑廠;鹽酸(優(yōu)級純),西隴化工股份有限公司;FolinCiocalteu試劑(分析純),上海荔達(dá)生物科技有限公司;無水碳酸鈉(分析純),天津化學(xué)試劑三廠;水,超純水。

    1.1.3

    主要儀器。HR2843 Philips攪拌機(jī),巴西制造;MS105DU電子天平,梅特勒-托利多公司;PHS828型酸度計,上海精密科學(xué)儀器有限公司;UC7100S超聲波清洗器,美瑞泰克科技(天津)有限公司;TG16WS臺式高速離心機(jī),長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司;UV2550紫外可見分光光度計,日本島津公司。

    1.2方法

    1.2.1

    試劑的配制。沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液(現(xiàn)配):用電子天平稱取0.020 90 g沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品溶解于7.0 ml的無水乙醇中,并用水定容至100 ml,計算其濃度為209.0 mg/L。

    120 g/L Na2CO3溶液:稱取120 g無水Na2CO3,溶于水并定容至1 000 ml。70%乙醇酸性溶液[7]:量取700 ml 乙醇,加水稀釋定容至1 000 ml,并滴加鹽酸,調(diào)節(jié)溶液酸度至pH 4.30。

    1.2.2

    試驗條件的選擇。

    1.2.2.1

    選擇試驗波長。準(zhǔn)確移取209.0 mg/L沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液0.50 ml于25 ml容量瓶,先加6 ml左右水稀釋,再依次加入1.00 ml FolinCiocalteu試劑和一定體積的120 g/L Na2CO3溶液,定容搖勻,25 ℃下反應(yīng)一段時間,于不同波長處測其吸光度。

    1.2.2.2

    選擇顯色條件。綜合文獻(xiàn)資料[7-18]和基層實(shí)驗室條件,通過試驗選擇測定蘋果多酚的顯色條件:準(zhǔn)確移取209.0 mg/L沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液0.50 ml于25 ml容量瓶,先加6 ml左右水稀釋,再依次加入1.00 ml FolinCiocalteu試劑和不同體積的120 g/L Na2CO3溶液,定容搖勻。25 ℃下反應(yīng)一段時間后,每間隔15 min,于“1.2.2.1”試驗確定的波長處,分別測定其吸光度。依據(jù)試驗結(jié)果,確定Na2CO3溶液用量及顯色時間。

    1.2.3

    繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。準(zhǔn)確移取不同體積的209.0 mg/L沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液,按照“1.2.2”進(jìn)行試驗,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

    1.2.4

    測定蘋果多酚總量。將蘋果樣品洗凈后用不銹鋼刀具切開,撿出果籽并記錄蘋果籽顏色,后將剩余部分(包括果核、果皮)切成5 mm以下的碎塊,混勻后稱取100 g放入攪拌瓶,加水100 ml后破碎60 s,制成勻漿[12]。準(zhǔn)確稱取該勻漿10 g,以70% 乙醇酸性溶液定容至100 ml,35 ℃下超聲提取40 min,冷卻,用干燥濾紙過濾;準(zhǔn)確移取濾液1.00 ml,按照“1.2.2”進(jìn)行試驗,并依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品中蘋果多酚含量。

    1.2.5

    方法評價。按“1.2.4”試驗方法進(jìn)行以下試驗。①重復(fù)性試驗:從同一批樣品中隨機(jī)抽取5個蘋果,分別制成勻漿后測其吸光度,計算總酚及其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。②精密度試驗:對同一蘋果樣品待測試液的吸光度平行測定5次,計算總酚及其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。③加標(biāo)回收率試驗:向已知蘋果多酚含量的樣品試液中,分別加入一定體積的 209.0 mg/L沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液,測定其吸光度,并計算其總酚回收率及其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 確定測試波長

    準(zhǔn)確移取209.0 mg/L沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液0.50 ml于25 ml容量瓶,先加6 ml左右水稀釋,再依次加入1.00 ml FolinCiocalteu試劑和8.00 ml 120 g/L Na2CO3溶液,定容搖勻,25 ℃下反應(yīng)60 min,于700~800 nm波長范圍內(nèi)測其吸光度。

    由表1表明,在765 nm處吸光度最大,確定765 nm為該試驗的測定波長。

    2.2反應(yīng)條件的確定

    2.2.1

    確定Na2CO3用量。準(zhǔn)確移取209.0 mg/L沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液0.50 ml于25 ml容量瓶,先加6 ml左右水稀釋,再依次加入1.00 ml FolinCiocalteu試劑和不同體積的 120 g/L Na2CO3溶液,定容搖勻,25 ℃下反應(yīng)60 min,于765 nm波長處測其吸光度。

    另取蘋果試液在相同條件下進(jìn)行測定,發(fā)現(xiàn)Na2CO3用量在4.00 ~ 8.00 ml范圍內(nèi),試液出現(xiàn)少量白色沉淀;Na2CO3用量大于8.00 ml以后,白色沉淀較多(表2),這與文獻(xiàn)資料的結(jié)果一致[13]??紤]到白色沉淀的生成將影響吸光度測定,少量白色沉淀量影響較小,因此確定120 g/L Na2CO3用量為8.00 ml,并且在測定蘋果多酚時,先將顯色試液進(jìn)行離心處理,再測定吸光度。

    2.2.2

    確定顯色時間。

    準(zhǔn)確移取209.0 mg/L沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液0.50 ml于25 ml容量瓶,先加6 ml左右水稀釋,再依次加入1.00 ml FolinCiocalteu試劑和8.00 ml 120 g/L Na2CO3溶液,定容搖勻,25 ℃下反應(yīng)15 min后開始,于765 nm波長處測定其吸光度,每間隔15 min測定一次。表3表明,顯色反應(yīng)在60 min后的吸光度趨于穩(wěn)定。

    由此確定此次試驗的反應(yīng)條件:FolinCiocalteu試劑用量為1.00 ml,120 g/L Na2CO3 用量為8.00 ml,25 ℃下顯色60 min。

    2.3繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線

    準(zhǔn)確移取209.0 mg/L沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.10、0.20、0.30、0.40、0.50、0.60 ml于25 ml容量瓶,先加6 ml左右水稀釋,再依次加入1.00 ml FolinCiocalteu試劑和8.00 ml 120 g/L Na2CO3溶液,定容搖勻, 25 ℃下反應(yīng)60 min,于765 nm處測定其吸光度(表4)。

    據(jù)此以吸光度對沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度作圖,總酚含量在0~125.4 mg/L范圍內(nèi)與吸光度呈良好的線性關(guān)系,線性計算公式y(tǒng)=0.005 4x+0.013 6,r=0.999 1。

    2.4 方法評價

    2.4.1

    重復(fù)性試驗。分別從1號、3號蘋果樣品中,隨機(jī)抽取5個蘋果,按照“1.2.4”的方法試驗并計算。由表5可見,1號蘋果總酚平均含量384.5 mg/kg,RSD 4.0%;3號蘋果總酚平均含量968.1 mg/kg,RSD 3.6%。

    2.4.2

    精密度試驗。對4號蘋果試液平行5次測定吸光度并計算,得到5次測定總酚含量分別為792.1、788.6、802.5、806.0、809.5 mg/kg,平均

    799.7 mg/kg,RSD 1.1%。

    2.4.3

    穩(wěn)定性試驗。選用3號蘋果試液,在完成測定后的下列各時間段,再測定其吸光度并計算。試驗得出,在10、20、30、40、50、60 min時,總酚含量依次為1 008.0、1 012.0、1 015.0、1 022.0、1 018.0、1 015.0 mg/kg,RSD 0.5%。

    2.4.4

    加標(biāo)回收率試驗。準(zhǔn)確吸取4號蘋果試液0.50 ml,分別加入0.15、0.20、0.25 ml 的209.0 mg/L沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液,按照“1.2.4” 試驗方法測定其吸光度并計算,結(jié)果見表6。

    試驗數(shù)據(jù)表明,該試驗方法的重復(fù)性、穩(wěn)定性、回收率較好。

    2.5試樣蘋果多酚的測定

    從1、2、3、4、5號樣品中隨機(jī)抽取2個[8],按照“1.2.4”試驗方法測定并計算,得出1號蘋果樣品中總酚含量分別為402.2、361.1 mg/kg,2號蘋果樣品總酚含量分別為466.0、452.3 mg/kg,3號蘋果樣品總酚含量分別為1 008.0、912.7 mg/kg,4號蘋果樣品總酚含量分別為792.1、808.0 mg/kg,5號蘋果樣品總酚含量分別為

    6308、651.8 mg/kg。此次試驗試樣的蘋果多酚含量范圍361.1~1 008.0 mg/kg。

    3 結(jié)論與討論

    采用70%乙醇酸性溶液作溶劑,35 ℃下超聲提取蘋果總酚,以FolinCiocalteu法測定蘋果總酚的反應(yīng)條件:FolinCiocalteu試劑用量1.00 ml ,120 g/L Na2CO3 用量8.00 ml,25 ℃下顯色60 min。以沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn),在0~125.4 mg/L范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系(y=0.005 4x+0.013 6,r=0.999 1)。方法簡單、快速、準(zhǔn)確,適用于基層實(shí)驗室測定蘋果多酚。

    樣品1號和2號著色淺紅,甜脆,采摘后低溫保存約25 d;3號著色紅黑,果肉有些許澀味,采摘后低溫保存約30 d;4號和5號著色紅色,甜脆,采摘后低溫保存約3 d。試驗結(jié)果表明,果面著色較深、果籽顏色較深、果子澀味較濃、采摘后保存時間較短的蘋果,其總酚含量較高。樣品的蘋果總酚含量范圍:361.1~1 008.0 mg/kg,差別較大;這與蘋果品種、生長條件、采摘時間、成熟度、保存方法等因素有關(guān)。此試驗結(jié)果與國內(nèi)外文獻(xiàn)資料相符[19-21]。

    1號樣品經(jīng)過亞硫酸氫鹽處理,2號樣品為其對照品,1號樣品的總酚含量稍低于2號樣品。亞硫酸氫鹽對云南昭通紅富士蘋果產(chǎn)量和品質(zhì)的影響較大,能有效促進(jìn)果實(shí)增產(chǎn),改善果實(shí)外觀品質(zhì),提升果實(shí)內(nèi)在品質(zhì)(如提高維生素C的含量等)[22-23]。但是維生素C的含量會隨著蘋果貯存時間的延長而降低。趙曉娟等的研究表明,在測定蘋果醋飲料總酚時,添加維生素C后的吸光度比對照品的吸光度有較明顯的增加[24]。因此,在測定蘋果多酚時,不能忽視樣品中存在的維生素C對測定的影響。維生素C含量高低對測定蘋果多酚的影響程度還需進(jìn)一步研究。

    蘋果果肉、果皮、葉子中酚類的類別和質(zhì)量構(gòu)成了蘋果飲食的健康功效,深入了解蘋果酚類動態(tài)變化有助于育種計劃的制定[25]。測定蘋果多酚并掌握其變化情況,對進(jìn)一步提高蘋果品質(zhì)具有重要意義。

    安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)2015年

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