亞硝酸鹽對(duì)墨吉明對(duì)蝦的毒性及其免疫因子的影響

栗志民等

摘要[目的]為墨吉明對(duì)蝦的工廠化健康養(yǎng)殖提供理論依據(jù)。[方法]采用靜水生物毒性法研究亞硝酸鹽對(duì)墨吉明對(duì)蝦的24、48、96 h急性毒性效應(yīng)，分析96 h半致死濃度脅迫下墨吉明對(duì)蝦血清蛋白含量、超氧化物歧化酶（SOD）活力以及溶菌酶活力的變化。[結(jié)果]亞硝酸鹽毒性效應(yīng)與亞硝酸鹽濃度和脅迫時(shí)間呈正相關(guān)。亞硝酸鹽對(duì)墨吉明對(duì)蝦24、48、96 h的半致死濃度分別為281.83、151.36和11482 mg/L，其安全濃度為11.48 mg/L。114.82 mg/L的亞硝酸鹽對(duì)墨吉明對(duì)蝦進(jìn)行脅迫，在24～96 h范圍內(nèi)墨吉明對(duì)蝦免疫指標(biāo)隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)而發(fā)生顯著變化，其中血清蛋白含量隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)而呈先升高后下降的趨勢(shì)，且顯著低于對(duì)照組 （P<0.05）。墨吉明對(duì)蝦肝胰臟中超氧化物歧化酶（SOD）活力在48 h內(nèi)呈下降趨勢(shì)，且48 h SOD活力最?。?48.90 U/mg prot），而48 h后SOD活力逐步上升。在脅迫時(shí)間24～96 h范圍內(nèi)，肝胰臟中溶菌酶活力隨著亞硝酸鹽脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸升高，96 h達(dá)到最大值（0.62 U/ml）。墨吉明對(duì)蝦血清蛋白含量、肝胰臟SOD活力和溶菌酶活力在3個(gè)取樣時(shí)間點(diǎn)均存在顯著差異（P<0.05），而對(duì)照組在3個(gè)取樣時(shí)間點(diǎn)差異不顯著（P>0.05），而在3個(gè)取樣時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組血清蛋白含量和2種酶的活力均未達(dá)到顯著差異（P>0.05）。[結(jié)論]墨吉明對(duì)蝦對(duì)亞硝酸鹽的安全濃度達(dá)到11.48 mg/L，證實(shí)該蝦類(lèi)對(duì)亞硝酸鹽具有較高的耐受性。當(dāng)水體中亞硝酸鹽濃度超過(guò)安全濃度時(shí)，會(huì)導(dǎo)致墨吉明對(duì)蝦的死亡。

關(guān)鍵詞墨吉明對(duì)蝦；亞硝酸鹽；半致死濃度；免疫因子

中圖分類(lèi)號(hào)S949文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào)0517-6611（2015）21-160-04

海洋甲殼動(dòng)物免疫易受到多種環(huán)境因子（如溫度、鹽度、污染物等）的脅迫，其中亞硝酸鹽作為水生態(tài)系統(tǒng)中氮代謝的中間產(chǎn)物，是水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境中主要的污染物之一。亞硝酸鹽不僅能抑制對(duì)蝦的生長(zhǎng)和代謝，而且會(huì)對(duì)機(jī)體內(nèi)抗氧化酶活力、溶菌酶活力以及細(xì)胞呼吸爆發(fā)力等體液免疫因子產(chǎn)生嚴(yán)重影響。已有研究表明，亞硝酸鹽可以改變羅氏沼蝦（Macrobrachium rosenbergii）肝胰臟中超氧化物歧化酶（SOD）活力，降低斑節(jié)對(duì)蝦（Penaeus monodon）血藍(lán)蛋白攜氧能力，引起凡納濱對(duì)蝦（Litopenaeus vannamei ）體內(nèi)溶菌酶、血清蛋白含量變化等。此外，亞硝酸鹽對(duì)其他水生動(dòng)物的免疫因子也存在影響。例如，羅非魚(yú)（Tilapia）體內(nèi)溶菌酶活力隨著亞硝酸鹽濃度的升高而降低；三角帆蚌（Hyriopsis cumingii）的免疫因子隨著亞硝酸鹽濃度的升高均下降；中華絨螯蟹（Eriocheir sinensis）幼體隨著亞硝酸鹽濃度升高以及脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，SOD活力呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。因此，控制養(yǎng)殖水體中亞硝酸鹽濃度對(duì)增強(qiáng)對(duì)蝦免疫水平和提高存活率至關(guān)重要。

墨吉明對(duì)蝦（Fenneropenaeus merguiensis），俗稱大蝦、大明蝦，隸屬節(jié)肢動(dòng)物門(mén)（Arthropoda）、甲殼綱（Crustacea）、對(duì)蝦屬（Penaeus），廣泛分布于我國(guó)廣東、廣西沿海地區(qū)，此外在菲律賓等地也有分布。隨著凡納濱對(duì)蝦養(yǎng)殖規(guī)模的擴(kuò)大，病害發(fā)生、種質(zhì)退化以及進(jìn)口親蝦價(jià)格攀升等問(wèn)題嚴(yán)重影響著對(duì)蝦養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)和產(chǎn)量，因此眾多水產(chǎn)工作者開(kāi)始尋求可以替代凡納濱對(duì)蝦的品種。墨吉明對(duì)蝦作為本地品種，其抗病性較強(qiáng)、生長(zhǎng)速度較快、價(jià)格較進(jìn)口凡納濱對(duì)蝦低，因此備受業(yè)內(nèi)人士的關(guān)注。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)墨吉明對(duì)蝦的研究主要集中在性成熟與胚胎發(fā)育、年齡與增長(zhǎng)、基因表達(dá)、資源調(diào)查等方面，而關(guān)于亞硝酸鹽脅迫對(duì)墨吉明對(duì)蝦毒性及免疫因子的影響的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。因此，筆者采用靜水生物毒性試驗(yàn)法研究了亞硝酸鹽對(duì)墨吉明對(duì)蝦的毒性作用，并且探究了高濃度亞硝酸鹽脅迫下墨吉明對(duì)蝦體內(nèi)血清蛋白含量、超氧化物歧化酶（SOD）和溶菌酶活力的變化情況，旨在揭示墨吉明對(duì)蝦適合生存的亞硝酸鹽濃度，為墨吉明對(duì)蝦的大規(guī)模健康養(yǎng)殖提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

試驗(yàn)于2014年7月在廣東海洋大學(xué)無(wú)脊椎動(dòng)物工程中心進(jìn)行，試驗(yàn)所用墨吉明對(duì)蝦由廣東海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院自行繁育獲得，挑選體色正常、體質(zhì)健壯的墨吉明對(duì)蝦進(jìn)行試驗(yàn)，其體長(zhǎng)為（51.54±10.24）mm，腹節(jié)長(zhǎng)為（29.14±8.05）mm。試驗(yàn)容器采用經(jīng)消毒的100 L塑料白桶。墨吉明對(duì)蝦暫養(yǎng)7 d，每天換水1/2，暫養(yǎng)期間連續(xù)充氣，每天投喂東騰顆粒3～4次，每次投喂量占對(duì)蝦體質(zhì)量的30%～40%。試驗(yàn)用水為經(jīng)過(guò)消毒、曝曬后的海水，海水溫度為26～28 ℃，鹽度23‰。亞硝酸鹽濃度采用亞硝酸鈉（分析純）配制，購(gòu)于廣東光華有限公司。

1.2亞硝酸鹽急性毒性試驗(yàn)

亞硝酸鹽濃度根據(jù)毒性預(yù)試驗(yàn)結(jié)果按等對(duì)數(shù)間距設(shè)置6個(gè)濃度梯度（33.20、52.79、8393、133.45、212.19、337.38 mg/L），同時(shí)設(shè)置對(duì)照組（亞硝酸鹽濃度<0.02 mg/L），每組均設(shè)置3個(gè)平行，各放入20尾墨吉明對(duì)蝦。試驗(yàn)期間，每天換水1/2，且保持各組濃度不變，供給充足氧氣，不投喂餌料，觀察并記錄24、48、96 h對(duì)蝦死亡情況，及時(shí)清除死亡個(gè)體。

1.3免疫指標(biāo)的測(cè)定

另外選取健康的20尾墨吉明對(duì)蝦，飼養(yǎng)在亞硝酸鹽濃度為144.99 mg/L的白桶中，分別在24、48、96 h各取3尾對(duì)蝦進(jìn)行取樣。用消毒過(guò)的1 ml注射器從墨吉明對(duì)蝦心臟中抽取血液，并加入到預(yù)冷的抗凝劑中，血液與抗凝劑的體積比為1∶1，抗凝劑采用Gross等方法配制。將抽取血液8 000 r/min離心5 min后，取上清用于血清蛋白含量的測(cè)定。另外選取墨吉明對(duì)蝦肝胰臟，將其放入滅菌后的研磨器中，加入1 ml生理鹽水進(jìn)行研磨，研磨后的勻漿液置于4 ℃條件下保存，用于SOD和溶菌酶活力的測(cè)定。

3.3亞硝酸鹽對(duì)墨吉明對(duì)蝦SOD活力的影響

超氧化物歧化酶是水生動(dòng)物體內(nèi)一種重要的抗氧化酶，在清除超氧化自由基O-2、防止機(jī)體氧化損傷、維持機(jī)體中氧自由基平衡等方面發(fā)揮重要作用。因此，水生動(dòng)物體內(nèi)SOD活力能夠較好反映機(jī)體的免疫能力。該試驗(yàn)結(jié)果表明，亞硝酸鹽脅迫下墨吉明對(duì)蝦SOD活力顯著低于對(duì)照組，且差異達(dá)顯著水平（P<0.05）。對(duì)羅氏沼蝦和中華絨螯蟹的研究也發(fā)現(xiàn)，在亞硝酸鹽脅迫下SOD活力顯著降低（P<0.05），并低于對(duì)照組。該試驗(yàn)結(jié)果表明，試驗(yàn)組墨吉明對(duì)蝦SOD活力變化呈現(xiàn)一定規(guī)律性，即先下降后升高，這與黃翔鵠研究亞硝酸鹽脅迫下凡納濱對(duì)蝦SOD活力變化有所不同。產(chǎn)生的原因可能是亞硝酸鹽脅迫條件下，墨吉明對(duì)蝦呼吸爆發(fā)產(chǎn)生大量的活力氧自由基，短時(shí)間內(nèi)抑制SOD活力，但隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，機(jī)體通過(guò)自身調(diào)節(jié)，SOD表達(dá)量增多，SOD活力增強(qiáng)，氧自由基被清除，機(jī)體產(chǎn)生較弱的抗氧化能力，因此48 h后SOD活力上升。墨吉明對(duì)蝦在亞硝酸鹽脅迫下，短時(shí)間內(nèi)通過(guò)提高自身的SOD活力，增強(qiáng)機(jī)體的抗氧化能力；然而，凡納濱對(duì)蝦SOD活力顯著下降，并無(wú)短暫升高，導(dǎo)致亞硝酸鹽的耐受力低于墨吉明對(duì)蝦。

3.4亞硝酸鹽對(duì)墨吉明對(duì)蝦溶菌酶活力的影響

溶菌酶是廣泛存在于水生動(dòng)物血清、吞噬細(xì)胞中的一種堿性蛋白，能夠?qū)Ω锾m氏陽(yáng)性菌起到破壞并消除的作用。因此，它在一定程度上能夠反映環(huán)境因素改變對(duì)水生動(dòng)物免疫水平的影響。該試驗(yàn)結(jié)果表明，在亞硝酸鹽脅迫下墨吉明對(duì)蝦溶菌酶活力逐漸上升，且48～96 h溶菌酶活力高于對(duì)照組。黃翔鵠和丁美麗等在對(duì)凡納濱對(duì)蝦、中國(guó)對(duì)蝦的研究中發(fā)現(xiàn)，隨著亞硝酸鹽脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，溶菌酶活力顯著降低，與該試驗(yàn)結(jié)果不同。墨吉明對(duì)蝦具有一定的耐受性，會(huì)調(diào)節(jié)自身相關(guān)的免疫機(jī)制，因此在亞硝酸鹽脅迫下逐漸出現(xiàn)上升趨勢(shì)，且趨勢(shì)變化顯著（P<0.05）。已有研究表明，亞硝酸鹽脅迫能夠降低凡納濱對(duì)蝦和羅氏沼蝦的免疫力，增加副溶血弧菌的易感性，造成對(duì)蝦死亡率增大。墨吉明對(duì)蝦溶菌酶活力會(huì)在亞硝酸鹽脅迫下升高，致使對(duì)蝦的抗病能力增強(qiáng)，降低致病菌的易感性，提高存活率。因此，墨吉明對(duì)蝦與其他品種對(duì)蝦相比具有更強(qiáng)的耐亞硝酸鹽能力。

綜上所述，亞硝酸鹽脅迫下墨吉明對(duì)蝦免疫因子的變化，反映了對(duì)蝦在不同時(shí)間段對(duì)亞硝酸鹽的響應(yīng)，而其誘導(dǎo)機(jī)制則有待進(jìn)一步研究。該試驗(yàn)條件下，墨吉明對(duì)蝦各免疫因子水平會(huì)隨脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)而提高，增強(qiáng)對(duì)蝦抗亞硝酸鹽能力，因此與其他品種對(duì)蝦相比亞硝酸鹽的安全濃度較高。

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