糞便中犬弓首蛔蟲卵飽和鹽水卵漂浮法的改良研究

繁萍等

摘要[目的]提高糞便中犬弓首蛔蟲卵的漂浮效果。[方法]對(duì)常用的飽和鹽水漂浮法進(jìn)行改良，對(duì)2份含犬弓首蛔蟲卵的糞便進(jìn)行漂浮和沉淀等處理。[結(jié)果]采用改良漂浮法2個(gè)糞便樣本中蟲卵的回收率分別為52.66%和38.90%，其回收效果較常規(guī)漂浮法有明顯提高。[結(jié)論] 采用吸取表層漂浮液的方式回收漂浮液，對(duì)蟲卵的回收效果良好。

關(guān)鍵詞糞便；犬弓首蛔蟲卵；飽和鹽水漂浮法；改良

中圖分類號(hào)S852.7文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào)0517-6611（2015）21-145-03

當(dāng)代生物學(xué)研究中，微量樣本作為研究材料的情況已經(jīng)十分常見，與之適應(yīng)的微量研究技術(shù)已逐步建立起來(lái)，但在一些研究工作中還存在不足之處。例如，標(biāo)準(zhǔn)的McMaster法計(jì)數(shù)蟲卵要求蟲卵量不少于2 g，而在實(shí)際中會(huì)遇到如糞便樣本不足的情況。2014年9月至11月，從青海西寧市寵物醫(yī)院和寵物交易市場(chǎng)采集到新鮮的犬糞便27份，初步篩查獲得2份含疑似犬弓首蛔蟲卵糞樣，2份樣本的重量分別是9.3和1.6 g，如實(shí)現(xiàn)分子生物學(xué)等的進(jìn)一步鑒定需要高質(zhì)量的蟲卵，因此濃縮純化工作尤為重要。N. Cardillo采用飽和蔗糖漂浮法對(duì)糞便中毛弓首蛔蟲卵濃縮純化并計(jì)數(shù)，計(jì)數(shù)效果優(yōu)于McMaster法。飽和蔗糖溶液粘度和漂浮力明顯高于飽和鹽水，蟲卵被漂浮的同時(shí)往往會(huì)有很多雜質(zhì)也被漂浮，需要更多的處理，如前期過(guò)濾和后期密度梯度離心等，操作手續(xù)較為繁雜，且存在技術(shù)操作的一定難度。筆者對(duì)常用的飽和鹽水漂浮法進(jìn)行改良，以實(shí)現(xiàn)簡(jiǎn)便快捷獲得濃縮的蟲卵效果。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1樣本及來(lái)源。2份來(lái)自西寧市寵物醫(yī)院和寵物交易市場(chǎng)的新鮮犬糞便，初步篩查均含有疑似犬弓首蛔蟲卵，分別編號(hào)為Qf1（2014）和Qf2（2014）。

1.1.2試劑。分析純級(jí)NaCl與甲醛，購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2方法

1.2.1濃縮純化方法。按照常規(guī)的飽和鹽水漂浮操作方法，取2 g糞便，用60 ml飽和鹽水稀釋，60目銅篩過(guò)濾，分裝入10 ml玻璃試管，補(bǔ)充少量飽和鹽水至液面與試管口成1個(gè)平面，靜置1 h后，鐵絲圈沾取表層液，10 倍物鏡鏡檢。然后，按照N. Cardillo的步驟進(jìn)行操作，吸取約3 ml上清液，移入15 ml離心管，加入5%福爾馬林9 ml，3 000 r/min離心10 min，棄上清，挑去少量沉淀鏡檢。再加入12 ml 5%福爾馬林，重懸沉淀，3 000 r/min離心10 min，棄上清，用少量滅菌蒸餾水重懸沉淀，即為濃縮蟲卵，鏡檢濃縮純化效果。

1.2.2蟲卵計(jì)數(shù)方法。用改進(jìn)的McMaster法計(jì)數(shù)蟲卵，計(jì)算回收率。

1.2.3造成蟲卵損失的因素分析。直接將含蟲卵液滴于載玻片上，不加蓋玻片鏡檢；然后，吸去液滴，再觀察載玻片。

1.2.4簡(jiǎn)易濃縮純化方案制定與檢驗(yàn)。根據(jù)上述工作的結(jié)果，擬定濃縮純化方案，并用樣本進(jìn)行效果檢驗(yàn)。

2結(jié)果與分析

2.1常規(guī)漂浮處理后的鏡檢結(jié)果

常規(guī)程序的漂浮液在100倍的視野中，蟲卵輪廓清晰，但內(nèi)部結(jié)構(gòu)不太明顯，同時(shí)有大量雜質(zhì)存在（圖1A）。經(jīng)過(guò)濃縮后鏡檢，可觀察到的蟲卵量并不多，同時(shí)顏色較深的雜質(zhì)也明顯減少（圖1B）。由表1可知，McMaster法計(jì)數(shù)回抽率不到10%。

2.2蟲卵損失因素分析

在同時(shí)開展的另一工作中，為了了解卵殼的裂解情況，用經(jīng)過(guò)凍融后的蟲卵液，直接滴于載玻片上，不加蓋玻片鏡檢，可見蟲卵在液滴最上表層聚集（圖2A）。然后吸去液滴，再觀察載玻片，能見到有許多蟲卵分散分布在載玻片上（圖2B）。這可能提示蟲卵丟失嚴(yán)重的原因是蟲卵與容器壁的吸附，也是文獻(xiàn)中提到注意清洗管壁的操作的原因。蟲卵在漂浮態(tài)時(shí)多集聚于液體上表層，也提示濃縮蟲卵可以直接回收漂浮液的上表層。

同時(shí)，還注意到蟲卵經(jīng)12 000 r/min離心5 min，再經(jīng)過(guò)組織裂解液處理，卵殼有破損，但蟲卵的卵殼內(nèi)其余結(jié)構(gòu)仍然保存完好（圖2C）。這說(shuō)明高速離心可以用于蟲卵的分離操作。

2.3簡(jiǎn)易濃縮純化方案

①挑去約0.05 g糞便放入2 ml離心管中，加500 μl飽和鹽水，破碎糞便并與飽和鹽水混勻。②靜置10 min后吸取少量上清稀釋后鏡檢計(jì)數(shù)，計(jì)數(shù)后把計(jì)數(shù)板上液體回收并用飽和鹽水沖洗計(jì)數(shù)板2～3次。沖洗液回收到新離心管中，補(bǔ)加飽和鹽水至液面凸出離心管口，小心吸取上表層液，放入新的2 ml離心管A；③在原離心管中補(bǔ)加飽和鹽水至1 500 μl，4 000 r/min離心10 min。然后，緩慢補(bǔ)加飽和鹽水至液面凸出離心管口，小心吸取表層上清約100 μl放入離心管A，重復(fù)操作1次。④在離心管A中的上清液中，加入1 ml 5%的福爾馬林混勻，靜置過(guò)夜。⑤10 000 r/min離心5 min，小心吸去上層上清液約1 ml。重新加入1 ml滅菌蒸餾水混勻，10 000 r/min離心5 min，吸去大部分上清液。⑥余液約100 μl，加入1 ml滅菌蒸餾水混勻，10 000 r/min離心，棄上清，沉淀用100 μl 的生理鹽水重懸，4 ℃或更低溫度下保存?zhèn)溆谩?/p>

2.4濃縮純化效果

對(duì)濃縮純化過(guò)程中的上清和沉淀混懸液鏡檢見圖3，濃縮純化的回收率見表1。微量糞便樣本漂浮處理，較大量糞便處理的視野中雜質(zhì)量相對(duì)較少，蟲卵形態(tài)相對(duì)清晰；經(jīng)過(guò)初次高速離心后的成點(diǎn)重懸液中，仍然有一定量的雜質(zhì)；完成濃縮純化操作后的樣本，視野中幾乎看不到雜質(zhì)的存在，但也可以注意到蟲卵量有減少跡象，2個(gè)樣本的回收率分別為52.66%和38.90%，較常規(guī)漂浮法回收效果有明顯提高。

3討論

3.1與飽和蔗糖漂浮法的比較

飽和蔗糖液的比重128，液體粘稠度很大，漂浮前必須經(jīng)過(guò)過(guò)濾處理和長(zhǎng)時(shí)間靜置，如果短時(shí)間內(nèi)處理，必將增加漂浮層中的雜質(zhì)含量。飽和鹽水的比重為1.17～1.20，與飽和硫酸鋅比重（118）接近，明顯減少了漂浮層的雜質(zhì)成分，這可能是因?yàn)榛紫x卵比重（1.16）與飽和鹽水比重相近有關(guān)。但是，蛔蟲卵的比重有變化，飽和鹽水的比重也隨環(huán)境溫度的不同而不同，可能造成不同研究中的漂效果不一致。在對(duì)吸取表層液的剩余漂浮液鏡檢中發(fā)現(xiàn)偶有蟲卵存在，提示比重的不穩(wěn)定可能是該研究中的部分蟲卵丟失的原因之一，因此選擇

比重略高于蟲卵比重的漂浮液可能會(huì)比飽和鹽水更適合。

3.2與密度梯度離心技術(shù)的比較

密度梯度離心是分離技術(shù)中效果最為理想的方法之一，從簡(jiǎn)單的處理和設(shè)備的要求方面考慮，密度梯度離心所需條件相對(duì)較高。為了簡(jiǎn)化條件和技術(shù)難度，采用了通過(guò)飽和鹽水、5%福爾馬林和滅菌蒸餾水輪換的方式替代密度梯度，并用不同的離心速度加速這種替代的密度梯度作用，研究表明此方式確實(shí)提高了分離的實(shí)際效果，也簡(jiǎn)化了大量操作的手續(xù)。

3.3高速離心對(duì)蟲卵的影響

常規(guī)的細(xì)胞離心速度以低速為主，差異大多因使用的介質(zhì)和離心機(jī)的不同而不同。相同介質(zhì)中離心速度過(guò)高，細(xì)胞損傷程度越大。寄生蟲的卵細(xì)胞外層多包有較厚的一層蛋白膜，這是保護(hù)其在各種環(huán)境中存活的方式。因此，利用蟲卵分離蛋白或核酸時(shí)，破碎蟲卵往往需要采用液氮凍融、蛋白酶K消化以及超聲裂解等相結(jié)合的方式。在另一研究中，將蟲卵裂解后經(jīng)12 000 r/min離心5 min的沉淀涂片鏡檢，可見有較多的蟲卵還未被徹底裂解，這是筆者采用10 000 r/min的離心轉(zhuǎn)速對(duì)蟲卵的破壞程度不大的證據(jù)，最終的純化結(jié)果也說(shuō)明了這一點(diǎn)。

3.4蟲卵自身特性對(duì)純化濃縮的影響

為了不浪費(fèi)蟲卵液，鏡檢均直接觀察液滴，不加蓋蓋玻片。鏡頭下面的蟲卵多集中在液面最上端，回收液滴后鏡檢載玻片可看到仍有許多蟲卵分散殘留，需清洗幾次才能全部回收，與N. Cardillo的濃縮方法相一致。這個(gè)現(xiàn)象一方面說(shuō)明常規(guī)漂浮中蟲卵大量丟失的原因之一，另一方面也提示采用吸取突出離心管口的表層液面的方法，是充分回收蟲卵的關(guān)鍵。如果結(jié)合選擇合適的漂浮介質(zhì)，漂浮效果將更加明顯。

3.5改良方法的推廣

構(gòu)建和檢驗(yàn)方法的2個(gè)樣本中Qf1的蟲卵含量很高，而Qf2的蟲卵含量比較低，嚴(yán)格按照方法的步驟操作，Qf2的回收效果并不理想。因此，在遇到這種情況時(shí)建議增加糞便的用量，靜置時(shí)間延長(zhǎng)至3 h以上，同時(shí)減少低速離心的次數(shù)，而增加收集凸起上層液的次數(shù)，同時(shí)結(jié)合顯微鏡檢來(lái)確定蟲卵收集程度。筆者所建立的方法是針對(duì)微量糞便樣本，方法中的關(guān)鍵技術(shù)同樣適用于大量糞便的操作，如可選取容量大但開口相對(duì)小的容器漂浮蟲卵，保證液面凸出瓶口即可。

犬類動(dòng)物糞便的雜質(zhì)顆粒較細(xì)小，而草食類動(dòng)物糞便多有未消化的植物纖維，這2種不同的糞便的前期處理應(yīng)有差別。該研究中省略了用蒸餾水混懸沉淀和粗篩過(guò)濾，正是基于此。對(duì)于草食類動(dòng)物糞便，可在初步了解蟲卵大小的前提下，經(jīng)過(guò)適合孔徑篩子過(guò)濾后可以按照此方法進(jìn)行相應(yīng)蟲卵的純化濃縮。

43卷21期繁 萍等糞便中犬弓首蛔蟲卵飽和鹽水卵漂浮法的改良研究

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