P16基因抑制胃癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的機(jī)制初步研究

朱崎 歐瑜 李杰通

摘要：目的： 將p16重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人高轉(zhuǎn)移胃癌細(xì)胞株MKN-28中，觀察轉(zhuǎn)染前以及轉(zhuǎn)染后p16基因?qū)ξ赴┘?xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力與運(yùn)動(dòng)能力的影響。在基因的水平探討p16基因?qū)τ谖赴┘?xì)胞轉(zhuǎn)移的抑制機(jī)制。方法： 通過(guò)脂質(zhì)體傳染法順利的將p16重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到MKN-28細(xì)胞株中，根據(jù)Transwell小室測(cè)定法測(cè)定細(xì)胞穿膜侵襲的能力，利用SDS-PAM凝膠電泳法檢測(cè)明膠酶的活性。結(jié)果： 在經(jīng)過(guò)p16重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后，根據(jù)顯微鏡下的計(jì)數(shù)顯示，胃癌細(xì)胞能夠穿透基底膜的數(shù)量與轉(zhuǎn)染前相比具有明顯的減少（p<0.05），具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)能力也是差與轉(zhuǎn)染前。PAM凝膠電泳顯示負(fù)染帶的寬度有明顯的變窄，降解基質(zhì)膜的轉(zhuǎn)移能力明顯下降。結(jié)論： p16基因抑制胃癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移可能是通過(guò)對(duì)癌細(xì)胞的侵襲和運(yùn)動(dòng)能力的控制得以實(shí)現(xiàn)的。

關(guān)鍵詞：p16基因；胃癌細(xì)胞；癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移

資助項(xiàng)目：湖南省教育廳科技計(jì)劃項(xiàng)目（13C963）

胃癌是一種常見(jiàn)的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，它嚴(yán)重危害著人們的身心健康，在全球腫瘤發(fā)病率以及死亡率中位居第2，給胃癌患者帶來(lái)了很大的身體危害及心理壓力[1]。并且目前胃癌的發(fā)病率在國(guó)內(nèi)外均呈顯著上升的趨勢(shì)。臨床醫(yī)學(xué)上對(duì)于胃癌的治療也是較為吸引人們的注目，目前利用腫瘤抑制基因?qū)Π┘?xì)胞的轉(zhuǎn)移進(jìn)行抑制成為研究的熱點(diǎn)[2]。故本次研究利用p16轉(zhuǎn)染人高轉(zhuǎn)移胃癌細(xì)胞株MKN-28，研究轉(zhuǎn)染前后p16基因?qū)τ谖赴┘?xì)胞轉(zhuǎn)移以及運(yùn)動(dòng)的能力的影響，旨在尋求一種能夠?yàn)橐院罄迷摶蜻M(jìn)行癌癥治療的時(shí)候提供實(shí)驗(yàn)以及理論上的依據(jù)。

注：P值表示MKN-28與P16- MKN-28組間比較的結(jié)果。

1材料與方法

1.1主要試劑

P16重組質(zhì)粒由本室進(jìn)行構(gòu)建，脂質(zhì)體買(mǎi)自Invitrogen公司，RT-PCR試劑盒買(mǎi)自TaKaRa公司，RPMI1640培養(yǎng)基為Hyclone產(chǎn)品。G418及丙烯酰胺凝膠電泳試劑買(mǎi)自Sigma公司，Transwell細(xì)胞培養(yǎng)小室為Costor產(chǎn)品，纖維黏連蛋白和ECL試劑盒購(gòu)自Invitrogen公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)與處理

胃癌細(xì)胞株MKN-28接種于RPMI1640培養(yǎng)基，在37℃、含有50ml/LCO2 的濕潤(rùn)空氣的恒溫密閉式培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。按照1×105/孔的細(xì)胞密度進(jìn)行接種，并使用無(wú)血清培養(yǎng)液進(jìn)行清洗。將脂質(zhì)體稀釋與無(wú)血清培養(yǎng)液中制備成混合溶液A。另將p16以及空白質(zhì)粒稀釋成B1和B2。然后將A與B溶液分別進(jìn)行混合，并置室溫放置20分鐘。然后滴加混合液和無(wú)血清培養(yǎng)液，培養(yǎng)一定時(shí)間之后，換為G418完全培養(yǎng)液，然后篩選，擴(kuò)大培養(yǎng)。設(shè)轉(zhuǎn)染前胃癌細(xì)胞為空白對(duì)照組，而轉(zhuǎn)染后為陰性對(duì)照組。

1.3細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力的測(cè)定

將實(shí)驗(yàn)用品先進(jìn)行預(yù)冷處理，在室膜表面加入膠體，此時(shí)要注意涂抹要均勻，然后對(duì)著燈光輕輕拍打均勻。然后將其放在培養(yǎng)液中水化，然后在外膜上涂上纖維黏連蛋白，干燥。最后一定濃度的細(xì)胞放置于Transwell小室中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間為10-60h，每10h小時(shí)為觀察點(diǎn)。具體的觀察方法為：將樣品取出小室，用棉簽擦去上室中的細(xì)胞，并用蘇木素伊紅染色，用樹(shù)脂膠將其封片。400倍顯微鏡下在上下左右中五個(gè)不同的視野內(nèi)將侵襲細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，取平均。

1.4Western blot

將轉(zhuǎn)染前后胃癌細(xì)胞置于細(xì)胞裂解液中，離心分離收集。配置一定含量的分離膠和濃縮膠，將樣品與緩沖液等體積進(jìn)行混合，并用蛋白質(zhì)對(duì)參照物進(jìn)行標(biāo)記。電泳后使用清水以及緩沖液進(jìn)行清洗，利用電轉(zhuǎn)移法進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。然后清洗干燥，加脫脂粉后封閉過(guò)夜。ECL試劑盒內(nèi)的溶液等體積混合后滴加到膜上，溫室孵育后用X線進(jìn)行膠片曝光[2]。

1.5明膠酶活性檢測(cè)

將細(xì)胞進(jìn)行接種后，進(jìn)行培養(yǎng)，然后離心分離去除細(xì)胞碎片，然后取長(zhǎng)層液加入緩沖液后進(jìn)行點(diǎn)樣。電泳結(jié)束后，浸入孵育液中進(jìn)行孵育，然后使用考馬斯亮藍(lán)進(jìn)行染色，然后使用脫色液進(jìn)行脫色，指導(dǎo)顯示出白色條帶為止。清洗觀察。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 15.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)，結(jié)果采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示， P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1轉(zhuǎn)染前后MKN-28胃癌細(xì)胞中p16蛋白的表達(dá)

進(jìn)行轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒p16的實(shí)驗(yàn)組中在明確的蛋白位置出現(xiàn)p16的特異性目的蛋白質(zhì)條帶，但是轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒以及轉(zhuǎn)染前并沒(méi)有出現(xiàn)這中特異性條帶。

2.2轉(zhuǎn)染前后MKN-28胃癌細(xì)胞的穿膜能力

顯微鏡下的細(xì)胞計(jì)數(shù)顯示，隨著實(shí)驗(yàn)時(shí)間的不斷增長(zhǎng)，具有侵襲能力的細(xì)胞數(shù)量呈增加的趨勢(shì)。轉(zhuǎn)染后胃癌細(xì)胞穿透基底膜的數(shù)量與為傳染相比有很大程度上的減少，雖然在實(shí)驗(yàn)進(jìn)行10h、20h的時(shí)候轉(zhuǎn)染前后差異較?。╬>0.05），但是30h以后，轉(zhuǎn)染前后期差異較大（p<0.05），具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。還能夠看出，未轉(zhuǎn)染和空質(zhì)粒轉(zhuǎn)的情況下，侵蝕細(xì)胞數(shù)沒(méi)有很大差異。具體見(jiàn)表1。

2.3 轉(zhuǎn)染前后MKN-28胃癌細(xì)胞明膠酶活性的情況

聚丙烯酰胺凝膠電泳的結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的負(fù)染帶寬度比轉(zhuǎn)染前顯著變窄，并且亮度也隨之減弱，其轉(zhuǎn)染前的積分吸光度值為31.2±0.56，轉(zhuǎn)染后為27.8±0.51，兩者相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。轉(zhuǎn)染p16基因的胃癌細(xì)胞其基質(zhì)膜降解和侵襲轉(zhuǎn)移能力都有所下降。

3討論

根據(jù)國(guó)內(nèi)外大量的研究資料顯示[3]，抗遺傳基因家族可以通過(guò)對(duì)腫瘤細(xì)胞間或者是腫瘤細(xì)胞外的細(xì)胞基質(zhì)的作用進(jìn)而影響到腫瘤細(xì)胞的浸潤(rùn)以及轉(zhuǎn)移的能力，所以這里基因在控制腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的過(guò)程中顯示出非常重要的作用。目前臨床醫(yī)學(xué)中已經(jīng)證實(shí)，p16與胃癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移具有很大的關(guān)系[4]。

侵襲、轉(zhuǎn)移是胃癌等惡性腫瘤最為基本的性質(zhì)，防止其轉(zhuǎn)移和侵襲是降低死亡率的主要方法之一。而這些腫瘤細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)能力是使其自身發(fā)生轉(zhuǎn)移的重要作用。其主要的侵襲轉(zhuǎn)移過(guò)程是先通過(guò)膜表面受體與基底膜發(fā)生粘附，然后它會(huì)釋放出蛋白明膠酶并且將基底膜進(jìn)行分解，之后才會(huì)運(yùn)動(dòng)穿過(guò)基底膜[4]。而p16基因可能會(huì)使其釋放的明膠酶活性降低甚至是失去活性進(jìn)而不能夠使基底膜受到分解，所以會(huì)抑制癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移與運(yùn)動(dòng)。

故本次研究采用p16基因作為胃癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移抑制劑，旨在探討它對(duì)胃癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移的抑制作用。研究結(jié)果顯示，在胃癌細(xì)胞MKN-28進(jìn)行轉(zhuǎn)染后，在明確的蛋白位置出現(xiàn)p16的特異性目的蛋白質(zhì)條帶；轉(zhuǎn)染后胃癌細(xì)胞穿透基底膜的數(shù)量與為傳染相比有很大程度上的減少，雖然在實(shí)驗(yàn)進(jìn)行10h、20h的時(shí)候轉(zhuǎn)染前后差異較?。╬>0.05），無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但是30h以后，轉(zhuǎn)染前后期差異較大（p<0.05），具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。并且進(jìn)過(guò)聚丙烯酰胺凝膠電泳測(cè)試后發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的負(fù)染帶寬度比轉(zhuǎn)染前顯著變窄，其并且轉(zhuǎn)染前的積分吸光度值為31.2±0.56，轉(zhuǎn)染后為27.8±0.51，兩者相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

故p16基因?qū)τ谝种莆赴┘?xì)胞的轉(zhuǎn)移可能是通過(guò)對(duì)癌細(xì)胞的侵襲和運(yùn)動(dòng)能力的控制得以實(shí)現(xiàn)的，p16可以有效地對(duì)胃癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移進(jìn)行控制，為以后治療研究胃癌的轉(zhuǎn)移機(jī)制提供了依據(jù)。

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