復(fù)合益生菌粉對(duì)刺參生長(zhǎng)·體壁成分和消化酶活性的影響

錢(qián)淑媛　王福強(qiáng)　憨素連等

摘要 [目的]研究飼料中添加復(fù)合益生菌粉對(duì)刺參生長(zhǎng)、體壁成分和消化酶活性的影響。[方法] 在基礎(chǔ)日糧中分別添加含有0、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%的復(fù)合益生菌粉（由枯草芽孢桿菌、嗜酸乳桿菌、釀酒酵母菌組成，含有106CFU/g）進(jìn)行喂養(yǎng)試驗(yàn)，養(yǎng)殖8周。[結(jié)果]隨著復(fù)合益生菌添加量的提高，刺參增重率和特殊生長(zhǎng)率有增加趨勢(shì)。與對(duì)照組相比，添加0.8%的復(fù)合益生菌能顯著提高刺參的增重率和特定生長(zhǎng)率（P<0.05）。復(fù)合益生菌對(duì)刺參成活率和體壁成分均無(wú)顯著影響（P>0.05）。復(fù)合益生菌對(duì)刺參腸道的消化酶活性也無(wú)顯著影響（P>0.05），但有提高刺參腸道脂肪酶活性的趨勢(shì)。當(dāng)益生菌添加量為0.4%時(shí)，刺參脂肪酶活性最高。[結(jié)論]復(fù)合益生菌粉能夠促進(jìn)刺參的生長(zhǎng)。當(dāng)益生菌添加量為0.8%時(shí)刺參的生長(zhǎng)較好。

關(guān)鍵詞 復(fù)合益生菌；刺參；生長(zhǎng)；消化酶活性

中圖分類(lèi)號(hào) S816 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2015）20-129-04

Abstract [Objective] The experiment was conducted to investigate the effects of compound probiotics powder on the growth，body wall composition and digestive enzyme activity of sea cucumber，Apostichopus japonicus.[Method] Five diets were formulated by supplementing with 0.0%（control），0.4%，0.6% and 0.8% compound probiotics （Bacillus subtilis，Lactobacilli acidophilus，Saccharomyces cerevisiae，106cfu/g） in basal diet，respectively.The experiment lasted for 8 weeks.[Result] Weight gain and specific growth rate had an increasing trend with increasing compound probiotics，weight gain and specific growth rate in sea cucumber fed the diets with 0.8% supplementation were significantly higher than that of control group （P<0.05）.There were no significant difference on survival rate and body wall composition among treatments （P>0.05）.Although there were no significant difference on digestive enzyme activity （P>0.05），sea cucumber fed the diets with compound probiotics showed higher trends of lipase activity than those fed the control diet.The highest lipase activity appeared in 0.4% supplementation group.[Conclusion] Diet supplementing with 0.8% compound probiotics can promote the growth performance of sea cucumber .

Key words Compound probiotics； Apostichopus japonicus； Growth performance； Digestive enzyme activity

刺參是棘皮動(dòng)物門(mén)、海參綱的動(dòng)物，是我國(guó)黃渤海海域最具經(jīng)濟(jì)價(jià)值的水產(chǎn)養(yǎng)殖品種之一。大規(guī)模、高密度的刺參人工養(yǎng)殖、藥物濫用常常會(huì)導(dǎo)致刺參的疾病和死亡大規(guī)模爆發(fā)等問(wèn)題。在飼料中添加益生菌，不僅可以提高養(yǎng)殖動(dòng)物的增重率，而且可以增強(qiáng)養(yǎng)殖動(dòng)物的免疫力，降低疾病的發(fā)生幾率，是實(shí)現(xiàn)生態(tài)養(yǎng)殖的重要方式。

大量研究表明，益生菌對(duì)魚(yú)類(lèi)的生長(zhǎng)有積極作用[1-3]。益生菌還可以產(chǎn)生多種酶類(lèi)，減少細(xì)菌毒素毒害的發(fā)生[4]。

復(fù)合益生菌比單一益生菌對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物有更好的作用效果。胡毅等[5]用復(fù)合益生菌和單一益生菌投喂凡納濱對(duì)蝦，復(fù)合益生菌組的特定生長(zhǎng)率、飼料效率、溶菌酶活力和血清蛋白濃度等均優(yōu)于單一益生菌組。Salinas等[6]用芽孢桿菌和乳酸菌復(fù)合投喂烏頰魚(yú)（Gilthead seabream）效果比單一的這2種菌更好。

益生菌在刺參養(yǎng)殖上的應(yīng)用研究還較少報(bào)道。筆者研究了復(fù)合益生菌粉對(duì)刺參的生長(zhǎng)、刺參體壁成分和腸道消化酶活性的影響，探索益生菌在刺參方面的應(yīng)用，以期為刺參的可持續(xù)養(yǎng)殖提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 復(fù)合益生菌。

試驗(yàn)所用的復(fù)合益生菌由大連陽(yáng)光白奧科技有限公司生產(chǎn)，由枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis， 106CFU/g以上）、嗜酸乳桿菌（Lactobacilli acidophilus， 106CFU/g以上）、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae， 106CFU/g以上）組成。

1.1.2 試驗(yàn)動(dòng)物。

試驗(yàn)所用刺參來(lái)自大連水益生海洋生物科技公司的同一批次刺參苗，刺參購(gòu)回后暫養(yǎng)馴化7 d。挑取個(gè)體大小均勻的健康刺參隨機(jī)分為5組，每組3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)30頭刺參，試驗(yàn)刺參初始體重為（1.07±0.02）g。

1.1.3 試驗(yàn)地點(diǎn)。養(yǎng)殖試驗(yàn)在大連海洋大學(xué)遼寧省水生生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)飼料。試驗(yàn)基礎(chǔ)日糧組成和營(yíng)養(yǎng)成分見(jiàn)表1～2。分別在基礎(chǔ)日糧中添加0、0.2%、0.4%、0.6%和0.8%的復(fù)合益生菌，制成A、B、C、D、E 5組飼料。在低于20 ℃室內(nèi)陰干后，貯存于-20 ℃的冰箱中備用。

1.2.2 飼養(yǎng)管理。

每天以刺參體重的3%投餌，根據(jù)攝食情況適當(dāng)調(diào)整飼喂量，達(dá)到飽食投喂，每天17：20投喂1次，次日13：30吸除殘餌和糞便，并補(bǔ)充暫存1 d的沙慮海水。飼養(yǎng)期間連續(xù)充氣，水溫控制在（15±3）℃。養(yǎng)殖試驗(yàn)持續(xù)56 d。

1.2.3 生長(zhǎng)指標(biāo)的測(cè)定。

同時(shí)，采集刺參體壁進(jìn)行體成分分析。粗蛋白的測(cè)定采用凱氏定氮法（GB/T 6432-1994），粗脂肪的測(cè)定采用索氏抽提法（GB/T 6433-1994），灰分的測(cè)定采用550 ℃灼燒質(zhì)量法（GB/T 6438-2007）。

1.2.4 腸道消化酶活性的測(cè)定。粗酶液的提取：刺參腸道粗酶液的提取參照袁成玉等[7]的方法進(jìn)行，收集刺參后，在冰盤(pán)中將腸道取出，將刺參腸道內(nèi)容物擠出，并用冷凍雙蒸水沖洗干凈。用濾紙輕輕吸干水分，迅速稱(chēng)重，在勻漿器中勻漿，并且稀釋10倍制成勻漿液，4 ℃下3 000 r/min 離心30 min，取上清液立即測(cè)定。

腸道中蛋白酶的活力采用福林-酚法進(jìn)行測(cè)定。腸道中淀粉酶的活力采用淀粉-碘顯色法進(jìn)行測(cè)定。腸道中脂肪酶活力采用滴定法進(jìn)行測(cè)定[8]。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理。

試驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，并使用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析，在差異顯著時(shí)對(duì)平均數(shù)進(jìn)行鄧肯氏多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 復(fù)合益生菌對(duì)刺參生長(zhǎng)、存活率及體成分的影響 由表2可知，各組刺參的始重?zé)o顯著差異（P>0.05）；養(yǎng)殖56 d后添加益生菌的各組刺參末重、增重率和特定生長(zhǎng)率隨著益生菌添加量的增加呈現(xiàn)遞增的趨勢(shì)。其中，E組增重率和特定生長(zhǎng)率均顯著高于A(yíng)、B、C組（P<0.05），其他試驗(yàn)組與A組差異不顯著（P>0.05）；各試驗(yàn)組刺參的存活率較高，但各組之間沒(méi)有顯著差異（P>0.05）。

2.2 復(fù)合益生菌對(duì)刺參體壁成分的影響

由表3可知，試驗(yàn)組的粗脂肪含量較低，粗灰分含量較高，但各組間刺參體壁的粗蛋白、粗脂肪和粗灰分含量均沒(méi)有顯著差異（P>0.05）。

2.3 復(fù)合益生菌對(duì)刺參腸道消化酶活性的影響

由表4可知，隨著益生菌添加量的增加，刺參腸道中蛋白酶活性有輕微的降低趨勢(shì)，E組有所回升。但是，不同處理組間腸道蛋白酶活力沒(méi)有顯著差異（P>0.05）。刺參腸道中淀粉酶活性B組比A組有所升高，C組反而降低，之后又升高。不同處理組間腸道淀粉酶活力沒(méi)有顯著差異（P>0.05）。刺參腸道中脂肪酶活性先逐漸上升，后有所回落。但是，不同處理組間腸道脂肪酶活力也沒(méi)有顯著差異（P>0.05）。

3 討論與結(jié)論

3.1 飼料中添加益生菌對(duì)刺參生長(zhǎng)和存活率的影響

芽孢桿菌可以飼料的形式進(jìn)入水產(chǎn)動(dòng)物的消化道中，提高其消化酶的活性，促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)[9-10]。有學(xué)者推測(cè)，芽孢菌可以促進(jìn)水產(chǎn)動(dòng)物的生長(zhǎng)和消化，可能是由于芽孢菌可以分泌豐富的胞外消化酶類(lèi)，對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物有輔助消化的作用[11]。

嗜酸乳桿菌具有較高的蛋白水解酶活性[12]，這可能有輔助消化作用。Son等[13]在石斑魚(yú)飼料中添加4周的植物乳酸桿菌后，石斑魚(yú)的增重率和飼料效率顯著提高。Suzer等[14]的研究表明，在黑鯛（Sparus aurata）的仔魚(yú)發(fā)育階段使用乳酸菌，可以提高仔魚(yú)的生長(zhǎng)性能和消化酶活性。Aly等[15]在飼料中添加乳酸菌，飼喂羅非魚(yú)1個(gè)月和2個(gè)月后均可以顯著提高其體增重。Ha等[16]將1 g/kg的熱滅活的植物乳酸桿菌添加到對(duì)蝦的飼料中，可以提高對(duì)蝦的存活率、體增重率和特定生長(zhǎng)率。王國(guó)霞等[17]證實(shí)添加10%的乳酸菌可以提高南美白對(duì)蝦的成活率、增重率和特定生長(zhǎng)率，降低餌料系數(shù)。在凡納濱對(duì)蝦的研究中也得到相似結(jié)果[18]。

酵母菌含有豐富的菌體蛋白，可以作為水產(chǎn)動(dòng)物的餌料而被利用。酵母的細(xì)胞蛋白可以替代一定的魚(yú)粉或蝦粉，并且適宜的替代量可以促進(jìn)魚(yú)蝦的生長(zhǎng)，提高飼料效率，從而降低養(yǎng)殖成本[19]。

大量研究表明，飼料中添加益生菌也可以促進(jìn)刺參的生長(zhǎng)性能。王路平等[20]發(fā)現(xiàn)微生態(tài)制劑能夠凈化養(yǎng)殖水質(zhì)，并且顯著提高刺參生長(zhǎng)速度。周慧慧等[21]發(fā)現(xiàn)仿刺參腸道中分離的益生菌能夠使刺參生長(zhǎng)得到促進(jìn)，抗病力也有所加強(qiáng)。李明[22]用酵母菌和枯草芽孢桿菌投喂刺參，刺參的特定生長(zhǎng)率顯著提高。袁成玉等[7]用光合細(xì)菌和芽孢桿菌飼喂刺參后特定生長(zhǎng)率明顯提高。該試驗(yàn)中飼料中添加0.8%復(fù)合益生菌能顯著提高刺參的增重率和特定生長(zhǎng)率，但較低水平的益生菌添加量的促生長(zhǎng)作用不明顯。該試驗(yàn)結(jié)果與上述研究基本一致。這也預(yù)示著益生菌必須達(dá)到一定的添加量才具有促進(jìn)生長(zhǎng)的效果。

3.2 飼料中添加益生菌對(duì)刺參體成分的影響

為了考察飼料添加劑對(duì)刺參品質(zhì)的影響，在試驗(yàn)結(jié)束后測(cè)定刺參體壁中主要營(yíng)養(yǎng)成分。該試驗(yàn)中粗蛋白和粗脂肪含量與對(duì)照組相比均無(wú)顯著差異（P>0.05），C組的粗灰分含量最高，但與其他組間差異不顯著（P>0.05）。Shear[23]認(rèn)為影響粗蛋白含量的因素主要是內(nèi)因（如魚(yú)體大小，不同發(fā)育階段）造成的，而外因（如溫度、鹽度、日糧等）對(duì)魚(yú)體粗蛋白含量沒(méi)有影響。魯琳等[24]研究表明在飼料中添加微生物制劑對(duì)虹鱒魚(yú)體成分無(wú)明顯不良影響。這些研究與該試驗(yàn)結(jié)果類(lèi)似。

3.3 復(fù)合益生菌對(duì)刺參腸道消化酶活性的影響

大量研究表明，飼料中添加一些益生菌能影響?hù)~(yú)的消化酶活性。華雪銘等[25]研究表明枯草桿菌和地衣芽孢桿菌等益生菌能提高暗紋東方鲀腸道的消化酶活性。丁賢等[26]研究發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌能顯著影響對(duì)蝦腸道中蛋白酶活性。Pan等[27]研究表明添加芽孢桿菌制劑的鯉魚(yú)試驗(yàn)組腸道蛋白酶和淀粉酶活性均比對(duì)照組顯著提高。一定濃度的芽孢桿菌也顯著提高了印度白對(duì)蝦和凡納濱對(duì)蝦腸道蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶等消化酶的活性[28-29]。Suzer等[14]報(bào)道在金頭鯛的仔魚(yú)發(fā)育階段使用乳酸菌可以提高仔魚(yú)的生長(zhǎng)性能和消化酶活性。ZiaeiNejad[28]認(rèn)為益生菌可以刺激對(duì)蝦產(chǎn)生內(nèi)源性酶，從含有益生菌的日糧中獲得高活力的酶。

益生菌對(duì)刺參腸道消化酶的影響也有報(bào)道。張艷婷[30]研究表明滅活植物乳桿菌也能提高刺參腸道的蛋白酶和淀粉酶的活性。張濤等[31]用仿刺參腸道篩選的乳酸菌和芽孢桿菌投喂仿刺參，提高了腸道內(nèi)蛋白酶和淀粉酶的活性。李明[22]用酵母菌和枯草芽孢桿菌投喂刺參，刺參的脂肪酶、淀粉酶、胰蛋白酶都顯著提高。袁成玉等[7]用光合細(xì)菌和芽孢桿菌飼喂刺參后，蛋白酶和淀粉酶的活性高于對(duì)照組。

該試驗(yàn)中添加不同水平的復(fù)合益生菌對(duì)蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶活性均無(wú)顯著差異。該試驗(yàn)結(jié)果與上述文獻(xiàn)報(bào)道并不一致。這可能是此次試驗(yàn)的水溫較低（12～15 ℃）、益生菌的添加量也較低（106 CFU/g），導(dǎo)致芽孢桿菌和酵母菌等益生菌產(chǎn)酶活力較弱所致，有必要研究在不同水溫下添加更大劑量益生菌對(duì)刺參腸道消化酶活性的影響，以探討益生菌作用的最適水溫和最適添加量。

參考文獻(xiàn)

[1] 邱燕，蔡春芳，代小芳，等.枯草芽孢桿菌對(duì)草魚(yú)生長(zhǎng)性能與腸道黏膜形態(tài)的影響[J].中國(guó)飼料，2010（19）：34-36.

[2] GHOSH K，SEN S K，RAY A K.Supplementation of an isolated fish gut bacterium，Bacillus circulans， in formulated diets for rohu，Labeo rohita， fingerlings[J].Bamidgeh，2003，55：13-21.

[3] 李衛(wèi)芬，沈濤，陳南南，等.飼料中添加枯草芽孢桿菌對(duì)草魚(yú)消化酶活性和腸道菌群的影響[J].大連海洋大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，27（3）：221-225.

[4] HARRIS L J，DAESCHEL M A，STILES M E，et al.Antimicrobial activity of lactic acid bacteria against Listeria monocytogenes[J].Journal of Food Protection，1989，52（6）：384-387.

[5] 胡毅，譚北平，麥康森，等.飼料中益生菌對(duì)凡納濱對(duì)蝦生長(zhǎng)、腸道菌群及部分免疫指標(biāo)的影響[J].中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)，2008，15（2）：244-251.

[6] SALINAS I，CUESTA A，ESTEBAN M.Dietary administration of Lactobacillus delbrueckii and Bacillus subtilis， single or combined，on gilthead seabream cellular innate immune responses[J].Fish Shellfish Immunol，2005，19：67-77.

[7] 袁成玉，張洪，吳垠，等.微生態(tài)制劑對(duì)幼刺參生長(zhǎng)及消化酶活性的影響[J].水產(chǎn)科學(xué)，2006，25（12）：612-615.

[8] 桂遠(yuǎn)明.水產(chǎn)動(dòng)物機(jī)能學(xué)實(shí)驗(yàn)[M].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2004：124-147.

[9] WANG Y B.Effect of probiotics on growth performance and digestive enzyme activity of the shrimp Penaeus vannamei[J].Aquaculture，2007，269（1/4）：259-264.

[10] ALY S M，MOHAMED M F，JOHN G.Effect of probiotics on the survival，growth and challenge infection in Tilapia nilotica （Oreochromis niloticus）[J].Aquaculture Research，2008，39（6）：647-656.

[11] GATESOUPE F J.The use of probiotics in aquaculture[J].Aquaculture，1999，180（1/2）：147-165.

[12] ZHAO R X，SUN J L，MO H Z，et al.Analysis of functional properties of Lactobacillus acidophilus[J].World Journal of Microbiology and Biotectmology，2007，23（2）：195-200.

[13] SON V M，CHANGA C C，WU M C，et al.Dietary administration of the probiotic，Lactobacillus plantarum，enhanced the growth，innate immune responses，and disease resistance of the grouper Epinephelus coioides[J].Fish Shellfish Immunol，2009，26：691-698.

[14] SUZER C，COBAN D，KAMACI H O，et al.Lactobacillus spp.bacteria as probioticsin gilthead sea bream （Sparus aurata L） larvae：Effects on growth performance and digestivc enzyme activities[J].Aquaculture，2008，280：140-145.

[15] ALY S M，AHMED Y A G，GHAREEB A A A，et al.Studies on Bacillus subtilis and Lactobacillus acidophilus，as potential probiotics，on the immune response and resistance of Tilapia nilotica （Oreochromis niloticus） to challenge infections[J].Fish Shellfish Immunol，2008，25：128-136.

[16] THANH TUNG H，KOSHIO S，ISHIKAWA M，et al.Effects of dietary heatkilled Lactobacillus plantarum on larval and postlarval kuruma shrimp， Marsupenaeus japonicus Bate[J].Journal of the World Aquaculture Socirty，2010，41（S1）：16-26.

[17] 王國(guó)霞，黃燕華，黃文慶，等.乳酸菌對(duì)南美白對(duì)蝦生長(zhǎng)，飼料利用和體組成的影響[J].中國(guó)飼料，2010（12）：24-32.

[18] 王國(guó)霞，黃燕華，周曄，等.乳酸菌對(duì)凡納濱對(duì)蝦生長(zhǎng)性能、消化酶活性和非特異性免疫的影響[J].動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào)，2010，22（1）：228-234.

[19] OLIVATELES A，GONQALVES P.Partial replacement of fishmeal by brewers yeast （Saccaromyces cerevisae） in diets for sea bass （Dicentrarchus labrax） juveniles[J].Aquaculture，2001，202（3/4）：269-278.

[20] 王路平，吳垠，班紅琴，等.微生態(tài)制劑對(duì)刺參幼參在封閉式循環(huán)養(yǎng)殖系統(tǒng)中的應(yīng)用研究[J].中國(guó)微生態(tài)學(xué)雜志，2009，21（6）：497-499.

[21] 周慧慧，馬洪明，張文兵，等.仿刺參腸道潛在益生菌對(duì)刺參生長(zhǎng)、免疫及抗病力的影響[J].水產(chǎn)學(xué)報(bào)，2010，34（6）：955-963.

[22] 李明.混合益生菌對(duì)刺參生長(zhǎng)、免疫、消化和腸道菌群的影響[D].大連：大連海洋大學(xué)，2014.

[23] SHEARER K D.Factors affecting the proximate composition of cultured fishes with emphasis on salmonids[J].Aquaculture，1994，119：63-88.

[24] 魯琳，于志強(qiáng)，燕楠.資源化微生物添加劑對(duì)虹鱒魚(yú)生長(zhǎng)性能的影響[J].飼料研究，2007（3）：3-5.

[25] 華雪銘，周洪淇，張宇峰.飼料中添加殼聚糖和益生菌對(duì)暗紋東方鲀幼魚(yú)生長(zhǎng)及部分消化酶活性的影響[J].水生生物學(xué)報(bào)，2005，29（3）：299-304.

[26] 丁賢，李卓佳，陳永青，等.芽孢桿菌對(duì)凡納對(duì)蝦生長(zhǎng)和消化酶活性的影響[J].中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)，2004，11（6）：580-584.

[27] PAN K C，YANG H B. Progress in study of mechanism of Bacillus[J].Feed Industry，1997，18（9）：32-34.

[28] ZIAEINEJAD S，REZAEI M H，TAKAMI G A，et al.The effect of Bacillus spp.Bacteria used as probiotics on digestive enzyme activity，survival and growth in the Indian white shrimp Fenneropenaeus indicus[J].Aquaculture，2006，252（2/4）：516-524.

[29] 王彥波，傅玲琳.益生菌對(duì)凡納濱對(duì)蝦生長(zhǎng)性能和消化酶活性的影響[J].飼料工業(yè)，2010，31（20）：12-14.

[30] 張艷婷.熱滅活乳酸桿菌（HKLP）對(duì)刺參生長(zhǎng)性能、消化酶活性、免疫力以及人工感染燦爛弧菌后免疫反應(yīng)的影響[D].大連：大連海洋大學(xué)，2012.

[31] 張濤，白嵐，李蕾，等.不同添加量的益生菌組合對(duì)仿刺參消化和免疫指標(biāo)的影響[J].大連水產(chǎn)學(xué)院學(xué)報(bào)，2009（S1）：64-68.